Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

Özet

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Özet

Plasenta embriyogenez sırasında geliştirmek için ilk organdır ve gelişmekte olan embriyonun yaşam için gereklidir. Plasenta preimplantasyon blastosist ekstra embriyonik trofoektoderm hücrelerinden ayırt çeşitli trofoblastik hücrelerin oluşur. Bu nedenle, insan plasenta erken farklılaşma olayları anlayışımız nedeniyle insan embriyogenez izolasyon ve manipülasyon etik ve yasal kısıtlamaların sınırlıdır. Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) insani gelişmeyi araştırmak için sağlam bir model sistem ve aynı zamanda çeşitli trofoblastik hücre tiplerinin işaretleri ifade trofoblastik hücrelerin içine in vitro ayırt edilebilir. Burada, kemik morfojenik protein 4 ve Aktivin / Düğüm sinyal yollarının inhibitörleri kullanan trofoblastik hücrelerin içine hPSCs ayırt etmek için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu protokol, siRNA'lar ile transfekte edilebilir, çeşitli trofoblastik hücre tipleri oluştururkayıp-fonksiyon fenotipleri soruşturma veya patojenler ile enfekte olabilir için. Ayrıca, hPSCs genetiği değiştirilmiş olabilir ve daha sonra fonksiyon-kazanç analizleri için trofoblast atalarıdır ayrışmıştır. HPSCs başlayarak insan trofoblast üretmek için bu in vitro farklılaştırma yöntemi erken insan embriyosunun ile çalışma etik ve yasal kısıtlamalar üstesinden gelir ve bu sistem ilaç keşfi ve kök hücre araştırmaları da dahil olmak üzere, çeşitli uygulamalar için de kullanılabilir.

Giriş

Plasenta gebelik sırasında fetusun büyüme ve hayatta kalmak için gerekli ve maternal ve fetal dolaşıma arasında gaz, besin, atık ürünleri ve hormonların alışverişini kolaylaştırır. Memeli Embriyogenez sırasında oluşan ilk organ 6-7 days insanlarda post-anlayışı ve fareler ^{1, 2, 3, 4} 3,5-4,5 gün geliştirmeye başladı plasenta vardır. Trofoblastik hücreler plasenta en önemli hücrelerdir ve bu hücreler memeli embriyosunun ilk soy farklılaşma olaylardan biri temsil etmektedir. Onlar preimplantasyon blastosist dış ekstra embriyonik trofoektoderm hücrelerden kaynaklanır. plasenta gelişiminin erken aşamalarında bilgimiz erken insani gelişme modelleme etik ve lojistik kısıtlamalar ile sınırlıdır.

embriyonik implantasyon, trofoblastlar sırasındaanne epitel istila ve özel progenitör hücrelerin ⁵ farklılaşırlar. Sitotrofoblastlar (CTBS) sigorta ve sinsityotrofoblastlarda (SYNs) ve extravillous invaziv trofoblastlar (EVTs) içine ayırt, farklılaşmamış atalarıdır, tek çekirdekli hangi çapa rahim plasenta. SYNs, gebeliği sürdürme için gerekli hormonları sentezlemek terminal açıdan farklılaşmış hücreleri çok çekirdekli edilir. Trofoblastik hücrelerde bozukluklar düşük, pre-eklampsi ve intrauterin gelişme ^{geriliği, 1} sonuçlanır olarak EVTs ve SYN isteklerini oluşturmak erken farklılaşma olayları, plasental oluşumu için gereklidir. Geliştirilen insan trofoblast hücre hatları tipleri CTBS ve plasental hormonlar ve ekran invaziv özellikleri ⁶ üretmek koryokarsi-, ölümsüzleşti içerir. İnsan ilk trimester plasenta primer trofoblastik hücreler izole ama hücreler hızla dif olabilirfarklılaştıran ve in vitro çoğalan dur. Önemlisi, dönüştürülmüş ve birincil hücre hatları tümörijenik ve ölümsüzleştirdi trofoblast hücre hatları doğru birincil trofoblast ⁷ temsil edemez belirten farklı gen ekspresyon profillerini var. Ayrıca, bu çizgiler üçüncü trimesterde üzerinden ilk sonra aşamalı türetilen çünkü plasental trofoblast kök hücre atalarıdır benzemeye olası değildir.

Plasenta oluşumu ve işlevi erken olayları incelemek için başlangıç aşamasında, insan trofoblast in vitro kültür sistemi içinde sağlam bir ihtiyaç vardır. preimplantasyon embriyo iç hücre kütlesi ile özelliklerini paylaşan İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC), sıklıkla erken plasenta oluşumu da dahil olmak üzere, erken insan gelişimi modellemek için kullanılır. Hem insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) ve HESC Kemik Mor kullanılarak in vitro trofoblast olarak ayırt edilebilirphogenic Proteinler 4 (BMP4) ^{8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15.} BMP4 kullanarak trofoblastik hücrelerin pluripotent hücrelerin Bu dönüşüm, insan hücreleri için özeldir ve erken insan embriyosunun ^{9, 16} erişimi gerektirmez, çünkü yaygın erken insan plasenta gelişimini incelemek için kullanılır. Son zamanlarda, keşfedildi inhibitörleri çok A83-01 (A) ve SMAD2 / 3 ve MEK1 / 2 sinyal yollarının bloke PD173074 (P), trofoektoderm benzeri progenitörleri, esas olarak Syns halinde hPSC farklılaşma verimini artırır ve mezoderm, endoderm, ya da ektoderm hücreleri ^{9, 17} kapsamlı nesil olmadan EVTs, . 12 gün, insan blastosist aşamasında embriyoların izole tropo-ektoderm hücrelerini benzer gen ekspresyon profillerine sahip ve çeşitli plasental spesifik büyüme hormonu salgılayan bu ortam şartları kullanılarak, HESC Bu in vitro model sistemi ^{9, 11} geçerliliğini destekleyen farklı. Burada, BMP4 / A / P kültür ortamı kullanılarak insan trofoblast progenitörlerde hPSCs in vitro farklılaşması için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu koşullar, lipofeksiyon aracılı transfeksiyon kullanılarak RNA sekanslama, gen bozulması siRNA'lar kullanılarak patojen enfeksiyonu ve genetik modifikasyonunu da içeren uygulamalarda, çok çeşitli hücrelerin, bol sayıları üretir.

Protokol

NOT: trofoblast atalarıdır içine ya hESC veya hiPSCs farklılaşma için, fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) üzerinde yetiştirilen hPSCs BMP4 / A / P ile farklılaşmayı başlamadan önce iki pasaj koşullarını serbest besleyici geçişi yapılır. Bu işlem, farklılaşmış hücre MEF kontaminasyonu ortadan kaldırır. Burada, HESC farklılaşması için bir protokol mevcut ve aynı protokol hiPSCs uygulanabilir.

1. Kültür ve Işınlanmış Fare Embriyonik Fibroblastlar üzerinde hESC Kurtarma (MEFS) (preparatlar)

1. MEF'ler gama-radyasyon
   1. % 10 FBS, 2 mM L-glutamin, 1 x penisilin / streptomisin (pen / strep) ile DMEM, ve 0.1 mM esas olmayan amino asitleri (NEAA) MEFS kültürlenmesi için ortam 500 ml olun.
   2. Birincil MEFS bir şişe çözülme ve hücrelerin kültürlenmesi için MEF orta kullanın. MEF kültür ortamı kullanılarak 30 plakalara birincil MEFS genişletin.
      NOT: oksijen konsantrasyonları bu aşama için kritik öneme sahip değildir, bu yüzdenHer iki kuvöz içinde (% 4), fizyolojik ya da ortam (% 20) koşullar kullanılabilir.
   3. MEFS hasat. plakalardan MEFS çıkarmak ve konik tüp hücrelerin aktarımı için% 0.25 tripsin kullanın. Bir ışınlama aracı haline MEFS yerleştirin ve 3.500 griler hücreleri maruz bırakmaktadır.
      NOT: süre ışınlayıcı ünitesi içindeki kaynağın etkinliği bağlıdır.
   4. MEF kültür ortamı ile ışınlanmış MEFS tekrar süspansiyon ve hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısını.
   5. Bir santrifüj kullanılarak MEFS Pelet,% 50 MEF kültür ortamı ve ortam (% 80 FBS ve% 20 MEF kültür ortamı) dondurma% 50 hücre ilave edin. Kısım şişe başına 1 x 10 ⁶ hücre.
   6. bir gecede -80 ° C derin dondurucuda ışınlanmış MEF şişeleri yerleştirin ve sonra uzun süreli depolama için sıvı nitrojen aktarabilirsiniz.
2. Kültür için dondurulmuş MEFS ve hESC çözülme
   1. HESC ortamının 500 ml yapmak: DMEM / F-12,% 20 serum Replacası, 0.1 mM NEAA, 2 mM L-glutamin, 10 ng / ml bFGF, 0.1 mM beta-merkaptoetanol ve 1 x Pen / Strep.
   2. hESC çözülme önce MEFS bir gün bir şişe çözülme. Kat her bir 1 ml kullanılarak,% 0.1 jelatin ile bir 6 yuvalı plaka. Oda sıcaklığında, en az 20 dakika süreyle inkübe edilir ve daha sonra jelatin çıkarın.
   3. Sıvı azot içinde depolama MEF'ler bir şişe çıkarın ve 37 ° C su banyosu içinde şişeyi bırakın. sadece küçük buz kristalleri kalır aralıklı kadar flakon izleyin. Hızla 15 ml konik tüp içinde MEF ortamın 9 ml flakon içeriğini aktarmak.
   4. 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj hücreleri Pelet. Süpernatantı aspire ve MEF ortamında hücre pelletini. 6 yuvalı bir plaka uzerinde eşit MEFS kısım. gece boyunca 37 ° C düşük oksijen (% 4) inkübatör içine plaka koyun.
3. MEFS üzerinde hESC rutin kültür
   1. sıvı azot bir HESC şişe çıkarın ve hızlı bir şekilde 3 ile flakon çözülme7 ° C su banyosu. Yavaşça HESC ortamın 9 ml içeren 15 ml konik bir tüp içine hESC pipet ve 5 dakika 200 x g'de aşağı doğru döndürün. Ortamı çıkarın ve HESC ortamı, 1 ml ile tekrar süspansiyon hücreleri.
   2. Aşama 1.2.4 hazırlanan levhadan MEF orta aspire ve HESC ortamının 1 ml. HESC ortamına Kaya önleyicisi Y-27632 (10 uM) ekleyin. MEFS üzerine hESC aktarın.
   3. gece boyunca 37 ° C düşük oksijenli (% 4) inkübatör içine hücreleri yerleştirin. Günlük HESC orta yerine. 4X de dik bir mikroskop altında görüntülendi Pasteur pipeti ile farklılaşmış hücreleri kazımak.
   4. Geçiş HESC her 4-6 günde hücre konfluent ve HESC kolonilerinin boyutuna bağlı olarak değişebilir. Pasajlanması gün önce MEFS bir tabak hazırlayın. Hücreler geçit hazır olduğunuzda, HESC orta kaldırmak ve 1 ml PBS ile iyice yıkayın.
   5. 1 mg / ml kollajenaz ekleme (37 ° C önceden ısıtılmış), 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve kolajenaz çıkarın. W, Hücrelerin PBS ile kül oyuk başına HESC ortamın 1 ml ekleyin ve elle 5 ml pipet ucu kullanarak, küçük topaklar içine hücreleri kazıyın. Yeni MEF kaplı iyi (ler) içine askıya hücre kümeleri aktarın.

MEF'lerden HESC 2. Geçiş besleyici-hücre dışı matris ile kaplanmış plakalar üzerinde Koşulları

1. Hazırlayın MEF Orta (CM) Buzdolabı
   1. % 90-100 confluency T75 şişesi içinde ışınlanmış MEFS Plaka; MEF'ler yoğun kaplanır önemlidir. onlar şişenin dibine bağlı olup olmadığını belirlemek için bir mikroskop kullanılarak hücrelerin uyun (MEFS kaplama veya ertesi gün sonra yaklaşık 6 saat ekleyiniz).
      NOT: Bir mikroskop kullanılarak gözlenen Bekâr hücreler ortamda yüzer. Ertesi gün, MEF orta kaldırmak ve B-FGF eksik hESC orta 25 ml ekleyin.
   2. inkübasyondan 24 saat sonra koşullu ortam toplanır. 12 günlük bir süre boyunca her gün taze ortam ile değiştirin.
   3. 0.22 um bir filtre ile toplanmıştır cm filtre. Önce kullanmak CM taze B-FGF ekleyin.
      Not: CM, -80 ° C'de dondurulmuş ve 1 yıla kadar depolanabilir. Seçenek olarak ise, 2 hafta boyunca 4 ° C'de CM saklayın.
2. Geçiş MEFS üzerinde kültür hESC besleyici serbest hücre dışı matriks kaplı plakalar.
   1. Kaplama doku kültürü plakaları için hücre dışı matrisin hazırlanması
      1. Buz üzerinde hücre dışı matrisin bir kısım (yaklaşık 3-4 saat) çözülme. buz soğukluğunda ipuçları, tek bir soğuk 50 ml konik tüp, ve DMEM / F12 ortamı transfer buz soğukluğunda DMEM 24 ml hücre dışı matrisin 2 mg kullanarak / F-12 (dilüsyon Sunucunun hücre dışı matris konsantrasyonuna bağlıdır ).
      2. Hemen buz 50 ml konik tüp transferi ve 4 ° C'de saklayın. Kaplama doku kültürü plakaları için, oyuk seyreltilmiş hücre dışı matrisin uygun miktarda (örneğin, 6-oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına 1 mi). plakayı kaplamak için girdap ve en az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
   2. B-FGF (10 ng / ml) ihtiva eden CM kullanılarak MEF'lerden (adım 1.3 gibi) Geçiş HESC.
      1. Aspire yeni plakadan ekstraselüler matriks kaldırmak ve B-FGF içeren CM ekleyin. Bir pipet kullanarak MEF plaka kazınmış hücresel kümeleri aktarın ve hücre dışı matriks kaplı plaka içine bölmeyin. gece boyunca 37 ° C'de, düşük oksijen inkübatörde inkübe edin.
      2. günlük B-FGF orta CM değiştirin; ortamın miktarı, kültür şişesi boyutuna bağlı olacaktır. bir 6-iyi de için orta 2 ml kullanın. Pasteur pipeti ile farklılaşmış hücreleri kazımak.
      3. Geçiş hESC mikroskop altında bakıldığında koloniler parlak her 6-7 gün.
         Not: hücre dışı matris ile kaplanmış plakalar üzerinde büyütülmüş HESC koloniler, MEF-kültürlenmiş hücrelerden daha büyük bir büyür.
      4. besleyici içermeyen hücreler geçiş hazır olduğunuzda, reklama göre yıkayın, orta kaldırmakPBS kaldırmak için bir pipet, aspirat kullanılarak PBS Ding 1 mi, ilave 0.5 mg / ml dispaz bir pipetle (37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış) ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      5. oyuk başına 2 ml PBS ilave edilmesi ve daha sonra aspire hücrelerin PBS ile yıkayın. kuyu başına CM 1 ml ekleyin ve elle 5 ml pipet ucu kullanarak küçük öbekler içine hücreleri kazıyın.
      6. Yeni hücre dışı matris kaplı tabak içine askıya hücre kümeleri Plate; Hücreler 24 saat sonra uymalıdır.

BMP4 / A / P Kullanma hESC 3. Farklılaşma

1. farklılaşma ortamı hazırlayın. Kullanım CM (B-FGF eksik) ekleyin (taze) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 uM) ve PD173074 (0.1 uM). kullanımdan önce CM bu inhibitörleri ekleyin.
2. % 4 oksijen ayarlanmış bir inkübatör içinde kültürlendi 1 geçişi için hücre dışı matris ile kaplanmış plakalar üzerinde büyüyen besleyici içermeyen hESC kullanın. hücre dışı matris ile kaplanmış plakalar üzerine ilk geçişten sonra,Hücreler 24 saat takmak edelim. Sonraki gün, farklılaşma başlatır. (B-FGF ihtiva) cm çıkarın ve BMP4 / A / P (6 çukurlu bir levha içinde çukur başına 2 mi) ihtiva eden CM ile değiştirin. % 4 oksijen seviyelerini kullanarak hücrelerin kültürlenmesi devam edin.
3. BMP4 / A / P ihtiva eden cm (2 ml / oyuk bir 6-yuvalı plaka) 2 günde değiştirin. Aspire eski orta kaldırmak ve bir pipet kullanarak yeni CM ekleyin. B-FGF (kabul farklılaşma gün 2) BMP4 ekleme ve kaldırdıktan sonra ikinci gününde, hücre morfolojisi, bir mikroskop kullanılarak gözlenen büyük görünen değişecektir.
   NOT: Parlak yuvarlak kenarları sergileyen farklılaşmamış hücreler, mevcut olmayacaktır.
4. İstenen zaman noktalarında hücreler toplanır. Farklılaştırılmış hücreler yaklaşık 2 hafta sonra bölünmesi durur. Bu süre içinde Transfect hücreleri (bir sonraki bölüme bakınız).

siRNA'lar veya plazmid DNA ile trofoblastik hücrelerin 4. transfeksiyonu

1. Transfeksiyon için, trofoblastik hücrelerin hazırlanması
   1. MEFS bunları aktardıktan sonra ekstrasellüler matriks iki pasaj Kültür hESC (adım 2.2). B-FGF içeren HESC ortamı kullanın.
   2. farklılaşma önce yeni bir hücre dışı matriks plakası bir gün üzerine hESC bölün. Ertesi gün en az% 50 confluency sağlayacak olan, iyi / yeni bir plaka üzerine 1: Yüksek hücresel confluency önemlidir, bu nedenle hücreler 1 ayrıldı. düşük oksijenli gece boyunca inkübatör içinde inkübe hücreleri.
      Not: HESC Bu adım sırasında sayılmasına gerek yoktur.
   3. Sonraki gün, farklılaştırma ortamının orta yerine (CM 6 plaka ml / oyuk BMP4 / A / P ihtiva eden B-FGF eksik 2 kullanılarak). Aspirasyon ile eski orta alın ve bir pipet kullanılarak, yeni, orta (2 mi) aktarın. gece boyunca, düşük oksijen inkübatör (% 4 oksijen) hücreleri yerleştirin.
2. Transfections gen bozulması için siRNA'lar kullanarak veya plazmid DNA kullanılarak
   1. İstenilen zaman-kadar hücreleri ayırt(Gün 1 ve 14 arasında) işaret etmektedir. Transfeksiyondan bir önceki gün, 5 dakika için% 0.05 tripsin kullanılarak Hücreleri tripsinize edin. Bir jelatin kaplı plaka üzerine istenen confluency (transfeksiyon reaktif protokolüne bağlı olarak) bunları Plakalı (kaldırmak için 20 dakika ve aspirat için bir doku kültürü plakası% 0.1 jelatin ekleyin). (B-FGF eksik) BMP4 / A / P içeren CM ekleyin ve gece inkübe edin.
   2. Sonraki gün, hücrelere taze farklılaşma orta ekleyin. Bir siRNA transfeksiyon ayıracı kullanılarak transfeksiyonu siRNA'lar. Plazmid DNA, bir uygun lipofektamin reaktif kullanın.
   3. Her transfeksiyon reaktifi için tarif edildiği gibi ürün, protokol takip edin. düşük oksijen inkübatör içinde gece boyunca hücrelerin, hücrelerin her bir / plaka siRNA lipofektamin kompleksleri transfer yavaşça karıştırın ve kültür.
      NOT: Bazı transfeksiyon ayıraçları CM Kalem / Strep eksik gerektiren antibiyotikler tarafından inhibe edilir.
   4. Ertesi gün, taze farklılaşma medya ile değiştirin.
   5. arzu hücreleri Hasatd zaman noktaları (örneğin, 24 saat, 48 saat ve 72 saat) kantitatif RT-PCR kullanılarak gen bozulması verimliliğini kontrol etmek. hasat hücreleri için, oyuk başına 1 ml ilave edilmesi ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe,% 0.05 tripsin kullanın. Tripsin nötralize etmek için, göz başına MEF ortamın 5 ml ekleyin. 5 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri Spin ve RNA izolasyonu için hücre pelletini kullanın.

Trofoblastik Hücreleri 5. Patojen Enfeksiyon: Sendai Viral Enfeksiyon

1. Farklılaşması için hESC hazırlanması
   1. MEF'lerden transferinden sonra ekstrasellüler matriks iki pasaj Kültür hESC (adım 2.2). B-FGF içeren HESC ortamı kullanın.
   2. farklılaşma önce yeni bir hücre dışı matriks plakası bir gün üzerine hESC bölün. Ertesi gün, en az% 50 konfluent sağlayacak yeni bir plaka / çukur üzerine 1: Yüksek hücre birbirine karışmaya önemli için ayrı hücreler 1 olduğu. düşük oksijen inkübatör (% 4 oksijen) 'de bir gece boyunca inkübe hücreleri.
      Not: HESC Bu adım sırasında sayılmasına gerek yoktur.
   3. Sonraki gün, düşük oksijenli bir inkübatör (% 4 oksijen) farklılaşma madde (ihtiva BMP4 / A / P ve eksik B-FGF) ve gece boyunca kültür ortamı değiştirin.
2. Trofoblastik hücrelerin Sendai viral enfeksiyon
   1. Bir gün istenen farklılaşma bir gün önce, 5 dakika boyunca% 0.05 tripsin kullanılarak (tek hücre) ayırt Hücreleri tripsinize edin ve jelatin kaplı plaka aktarın. farklılaşma ortamı ilave edin ve düşük oksijenli inkübatör içinde bir gece boyunca inkübe edilir.
   2. Sonraki gün, (bu virüs ile ilgili olarak değişir), enfeksiyon için orta ekleyin. 6 oyuklu plakanın bir kuyu için 0.5 ml kullanılarak BMP4 / A / P ihtiva eden Pen / Strep eksik kullanımı CM. MOI, düşük oksijen inkübatör 8 saat 1. inkübe for = Sendai virüsü ekleyin.
   3. ek zaman noktaları gerekli ise, 4 saat sonra virüs içeren orta kaldırmak ve BMP4 / A / P CM ile değiştirin. hücreleri toplayınRNA izolasyonu için bir hücre kazıyıcı kullanarak.
   4. Viral cevap ¹⁸ yer alan genlerin QRT-PCR gerçekleştirilerek viral enfeksiyonun etkinliğini belirler.

Sonuçlar

HPSCs İn Vitro Farklılaşma Bakış

Bu in vitro farklılaştırma protokolü bir pasaj (Şekil 1A) şartlarını serbest besleyici geçişi yapılır MEFS yetişen farklılaşmamış hESC ile başlar. Bu protokolde hESC farklılaşma tarif ederken, başarılı trofoblastik hücrelerin içine hiPSCs ayırt etmek için bu protokolü kullanılır. ekstraselüler matriks geçiş insan trofoblastik...

Tartışmalar

Biz trofoblast atalarıdır içine hESC ayırt etmek için temel adımları sundu. Bu protokol, en son trofoblastik hücrelerin farklılaşmasını arttırmak ve tipik haliyle, tek başına BMP4 tedavisi ile gözlenir mezoderm progenitörlerle üretilmesini önlemek hızla Aktivin / Düğüm sinyal inhibitörleri ilavesiyle hESC ayırt etmek için optimize edilmiştir. BMP4 model sistem insan trofoblast soy şartname ve genişleme erken aşamalarında incelenmesi için izin verir. Buna ek olarak, bu BMP4 modeli sistemi,...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	11330-057
Knock Out Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	This is referred to as "serum replacement" in this protocol.
NEAA	Invitrogen	11140-050
FBS	Invitrogen	16000-044
L-Glutamine	Invitrogen	10828-028
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-155
2-Mercaptoethanol	Sigma	M-7522
B-FGF	Millipore	GF-003
DMEM	Invitrogen	11965-118
Dispase	Invitrogen	17105-041
Collagenase Type IV	Invitrogen	17104-019
Rock inhibitor Y27632	Calbiochem	688000
Irradiated CF1 MEFs	GlobalStem	6001G	MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.
0.22 µm syringe filter	Millipore	SLGS033SS
Heracell 150i low oxygen incubator	Heracell/VWR	89187-192	Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.
BMP4	R&D Systems	314-BP-01M
A 83-01	R&D Systems	2939/10
PD173074	R&D Systems	3044/10
RNAiMax	Invitrogen	13778150
Trizol	ThermoFisher	15596026	Trizol is used to isolate total RNA.
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001
Matrigel	Corning	356231	This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol.