ヒト多能性幹細胞のin vitro分化における絨毛細胞へ

要約

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

要約

胎盤は、胚発生の間に開発した最初の臓器であり、発達中の胚の生存のために必要とされます。胎盤は、着床前胚盤胞の胚体外栄養外胚葉細胞から分化する様々な栄養膜細胞から構成されています。このように、ヒト胎盤の早期分化事象の理解があるため、人間の胚発生の単離および操作上の倫理的および法的制約のために制限されています。ヒト多能性幹細胞（hPSCs）人間開発を研究するための強力なモデル系であり、また、種々の栄養膜細胞型のマーカーを発現する栄養膜細胞にインビトロで分化させることができます。ここでは、骨形成タンパク質4及びアクチビン/ノダルシグナル伝達経路の阻害剤を使用して、栄養膜細胞にhPSCsを区別するための詳細なプロトコルを提示します。このプロトコルは、siRNAでトランスフェクトすることができる種々の栄養膜細胞型を生成します機能喪失表現型を調査するため、または病原体に感染させることができます。さらに、hPSCsは、遺伝的に変更することができ、その後の機能獲得分析のための栄養膜の前駆細胞に分化しました。 hPSCsから始まる人間栄養芽細胞を生成するためのこのインビトロ分化方法は、ヒト初期胚での作業の倫理的、法的な制限を克服し、このシステムは、創薬・幹細胞研究を含め、様々な用途に使用することができます。

概要

胎盤は、妊娠中の胎児の成長と生存のために必要と母体と胎児循環の間の気体、栄養素、老廃物、およびホルモンの交換を容易にされています。哺乳類の胚発生の間に形成された第一の臓器は、ヒトおよびマウスの¹で3.5から4.5日で6-7日後受胎の開発から始まり、胎盤^、2、3、4です。栄養膜細胞が胎盤の最も重要な細胞であり、これらの細胞は、哺乳動物の胚の初期の系統分化のイベントのいずれかを表します。彼らは、着床前胚盤胞の外胚体外栄養外胚葉細胞から生じます。胎盤の開発の初期段階の私たちの知識は、早期人間開発のモデリング上の倫理や物流の制限によって制限されています。

胚移植時には、トロホブラスト母性上皮に侵入し、専門の前駆細胞⁵に分化します。細胞栄養芽層（のCTB）が融合し、子宮にアンカー胎盤合胞体（のSYN）とextravillous侵襲性栄養膜（EVTs）に分化単核、未分化前駆細胞です。 SYNは、妊娠を維持するために必要なホルモンを合成する多核、最終分化細胞です。絨毛細胞での障害は流産、子癇前症、および子宮内発育制限¹になるようEVTsとのSYNを生成する初期分化事象は、胎盤形成に必須です。開発されてきた人間の栄養膜細胞株の種類は胎盤ホルモンを産生のCTBと絨毛を、不死化および浸潤特性^6を表示することを含みます。人間の妊娠第一期の胎盤を単離することができるが、細胞はすぐにDIFから初代栄養膜細胞ferentiateおよびin vitroで増殖して停止します。重要なことには、形質転換された、一次細胞株は、腫瘍形成および不死化栄養膜細胞株は、正確に一次栄養膜^7を表していない可能性があることを示し、異なる遺伝子発現プロファイルを有します。さらに、これらの行は、それらが三学期を介して第1の後段に由来しているため、胎盤トロホブラスト幹細胞前駆体に似ている可能性は低いです。

胎盤の形成と機能の初期事象を研究するために、初期段階のヒト栄養芽細胞の体外培養系における堅牢なの必要性があります。着床前胚の内部細胞塊と特性を共有するヒト胚性幹細胞（hESC）は、しばしば早期胎盤の形成を含む、初期のヒトの発生をモデル化するために使用されます。ヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）およびヒトES細胞の両方は、骨モルを用いてインビトロで栄養芽細胞に分化させることができますphogenicタンパク質^{4（BMP4）8、9、10、11、12、13、14、15。} BMP4を使用して栄養膜細胞への多能性細胞のこの変換は、人間の細胞に特異的であり、それは初期ヒト胚^9、16へのアクセスを必要としないため、広く初期のヒト胎盤の発達を研究するために使用されます。最近、SMAD2 / 3及びMEK1 / 2シグナル伝達経路を遮断する阻害剤A83-01（A）およびPD173074（P）の添加は、栄養外胚葉様前駆細胞、主にSYNのにHPSCの分化の効率を高めることが発見されました中胚葉、内胚葉、または外胚葉細胞⁹の大規模な発生がなく^、EVTs、17 。これらの培地条件を用いて、12日間分化ヒトES細胞は、ヒト胚盤胞段階の胚から単離された栄養外胚葉細胞と同様の遺伝子発現プロファイルを有しており、種々の胎盤特異的成長ホルモンを分泌し、in vitroモデル系^9、11本の妥当性を支持します。ここでは、BMP4 / A / P培地を用いて、ヒト栄養芽前駆細胞へのhPSCsのインビトロ分化のための詳細なプロトコルを提示します。これらの条件は、リポフェクション媒介性トランスフェクションを用いたRNA配列、siRNAを用いた遺伝子破壊、病原体感染、遺伝的改変を含む、多種多様な用途のための細胞の過剰数を生成します。

プロトコル

注：栄養膜前駆細胞へのhESCまたはhiPSCsのいずれかの分化のために、マウス胚繊維芽細胞（MEF）上に成長したhPSCsをフィーダーを含まないために、2つの通路のための条件をBMP4 / A / Pと分化を開始する前に遷移されます。このプロセスは、分化した細胞のMEF汚染を排除します。ここでは、hESCの分化のためのプロトコルを提供し、同じプロトコルをhiPSCsに適用することができます。

1.照射マウス胚線維芽細胞上のhESCの文化と回復（のMEF）（準備）

1. MEFののガンマ線照射
   1. 10％FBS、2mM L-グルタミン、1×ペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン）を含むDMEM、及び0.1mMの非必須アミノ酸（NEAA）のMEFを培養するための培地500mlを加えます。
   2. 一次のMEFの1つのバイアルを解凍し、細胞を培養するためのMEF培地を使用します。 MEF培地を用いて30プレートに一次のMEFを展開します。
      注：酸素濃度はそう、このステップのために重要ではありませんインキュベータ内の生理学的（4％）または周囲（20％）の条件のいずれかを使用することができます。
   3. MEFSを収穫。プレートからのMEFを削除し、コニカルチューブに細胞を転送するために0.25％トリプシンを使用してください。照射機器にのMEFを置き、3500グレーに細胞をさらします。
      注：時間の量は、照射ユニットの内部ソースの活性に依存します。
   4. MEF培地を照射したMEFを再懸濁し、血球計数器を用いて細胞数を数えます。
   5. 遠心分離機を使用したMEFをペレット化し、50％のMEF培地と培地を凍結50％の細胞（80％FBS、20％MEF培地）を加えます。アリコート1バイアルあたり1×10 ⁶個^の細胞。
   6. 一晩-80℃の冷凍庫で照射MEFバイアルを置き、その後、長期保存のために液体窒素に転送します。
2. 文化のために凍結したMEFおよびヒトES細胞を解凍
   1. 20％血清REPLACを含むDMEM / F-12：hESCの培地500mlを作りますement、0.1mMのNEAA、2mMのL-グルタミン、10ng / mLのbFGFを、0.1 mMのSSメルカプトエタノール、および1×ペニシリン/ストレプトマイシン。
   2. ヒトES細胞を解凍する前に、MEFを1日1バイアルを解凍します。各ウェルは1 mlで使用し、0.1％ゼラチンでコート6ウェルプレートを、。室温で少なくとも20分間インキュベートし、その後、ゼラチンを削除します。
   3. 液体窒素中で貯蔵からのMEFのバイアルを取り外し、37℃の水浴中でバイアルを浸します。唯一の小さな氷の結晶が残るまで断続的にバイアルをご覧ください。迅速に15ミリリットルコニカルチューブ内のMEF培地の9ミリリットルにバイアルの内容を転送します。
   4. 5分間、200×gで遠心分離して細胞をペレット化。上清を吸引除去し、MEF培地中で細胞ペレットを再懸濁します。 6ウェルプレート上に均等にしたMEFを等分。一晩37℃の低酸素（4％）インキュベーターにプレートを置きます。
3. MEFの上のhESCのルーチンの文化
   1. 液体窒素からのhESCバイアルを取り外し、すぐに3を使用して、バイアルを解凍7℃の水浴。ゆっくりのhESC媒体の9ミリリットルを含む15ミリリットルコニカルチューブにヒトES細胞をピペットし、5分間、200×gでスピンダウン。培地を除去し、ヒトES細胞培地1mlで細胞を懸濁します。
   2. ステップ1.2.4で製造したプレートからMEF培地を吸引し、ヒトES細胞培地の1ミリリットルを追加します。ヒトES細胞培地にROCK阻害剤Y-27632（10μM）を追加します。 MEFの上にヒトES細胞を転送します。
   3. 一晩37℃で低酸素（4％）インキュベーターにセルを配置します。毎日のhESC媒体を交換してください。 4Xで正立顕微鏡下で可視化パスツールピペットを用いて分化した細胞を削り取ります。
   4. パサージュヒトES細胞ごとに4-6日、細胞集密度とhESCコロニーの大きさに応じて。継代前日のMEFのプレートを準備します。細胞は継代に準備ができているときは、hESCの培地を除去し、1mlのPBSでよく洗います。
   5. 1mg / mlのコラゲナーゼを追加します（37℃に予熱した）、37℃で5分間インキュベートし、コラゲナーゼを除去します。 WPBSで細胞をアッシング、ウェル当たりのhESC培地の1ミリリットルを追加し、手動で5ミリリットルピペットの先端を使用して小さな塊に細胞をこすり取ります。新しいMEF-コーティングされたウェル（複数可）に懸濁細胞塊を転送します。

フィーダーなしに条件を細胞外マトリックスでコーティングされたプレート上のMEFからのhESCの2推移

1. 準備MEF馴化培地（CM）
   1. 百分の90から100までの集密度でT75フラスコ中で照射したMEFをプレート。のMEFが密にメッキされることが重要です。彼らは、フラスコの底部に取り付けられているかどうかを判断するために顕微鏡を用いて細胞を観察し（MEFをメッキまたは翌日以降、約6時間を添付します）。
      注：顕微鏡を用いて観察したときに未結合細胞が培地中に浮遊します。翌日、MEF培地を除去し、B-FGFを欠くのhESC培地25mlを追加します。
   2. インキュベーションの24時間後に馴化培地を収集します。 12日の最大のために毎日新鮮な培地と交換してください。
   3. 0.22μmのフィルターを用いて収集したCMをフィルタリングします。使用前に、CMに新鮮なB-FGFを追加します。
      注：CMは、-80℃で凍結し、最長1年間保存することができます。また、4℃で2週間CMを格納します。
2. トランジションのMEF上で培養物からヒトES細胞は、無フィーダーする細胞外マトリックスでコーティングされたプレートを。
   1. 被覆組織培養プレートのための細胞外マトリックスの調製
      1. 氷（約3-4時間）に、細胞外マトリックスのアリコートを解凍します。氷冷DMEM / F-12の24ミリリットル中に氷のように冷たいヒント、1冷たい、50ミリリットルコニカルチューブ、およびDMEM / F12培地、細胞外マトリックスの転送に2mgを使用した（希釈は、サプライヤーからの細胞外マトリックスの濃度に依存します）。
      2. 直ちに氷上に50ミリリットルを円錐管に移し、4℃で保存。被覆組織培養プレートのために、ウェルに希釈し、細胞外マトリックスの適切な量を追加する（例えば、6ウェルプレート中のウェルあたり1ml）中。プレートをコーティングするために旋回し、少なくとも1時間室温でインキュベートします。
   2. B-FGF（10 ngの/ ml）を含むCMを使用して（ステップ1.3のように）のMEFからの通路のhESC。
      1. 吸引し、新しいプレートから細胞外マトリックスを削除して、B-FGFを含むCMを追加します。ピペットを用いて、MEFプレートから掻き取り、携帯塊を移し、細胞外マトリックスでコーティングされたプレートに、それを分取。一晩37℃での低酸素インキュベーターでインキュベートします。
      2. 毎日のB-FGF媒体とCMを交換してください。培地の量は、培養フラスコの大きさに依存するであろう。 6ウェル1のために2mlの培地を使用してください。パスツールピペットで分化した細胞を削り取ります。
      3. 通路hESCを顕微鏡で見たときにコロニーが明るいごとに6-7日、。
         注：細胞外マトリックスでコーティングされたプレート上で増殖したhESCコロニーは、MEF培養細胞よりも大きくなります。
      4. 無フィーダー細胞が通過に準備ができたら、培地を除去し、広告によって洗いますPBSを除去するために、ピペット、吸引を使用してPBSの丁1mlを、追加の0.5mg / mlのディスパーゼピペットを用いて（37℃に予熱）、5分間37℃でインキュベートします。
      5. ウェルあたり2mlのPBSを添加し、その後吸引することにより、PBSで細胞を洗浄。ウェルあたりのCMの1ミリリットルを追加し、手動で5ミリリットルピペットの先端を使用して小さな塊に細胞をこすり取ります。
      6. プレートの新しい細胞外マトリックスでコーティングされたプレートに中断し、細胞塊。細胞は24時間後に接着する必要があります。

BMP4 / A / Pを使用したhESCの3分化

1. 分化培地を準備します。利用CM（欠けているB-FGF）と（新鮮）BMP4（50 ngの/ ml）を、A83-01（1μM）、およびPD173074（0.1μM）を追加します。使用前にCMにこれらの阻害剤を追加します。
2. 4％の酸素で設定したインキュベーター内部の培養1通過のための細胞外マトリックス被覆プレート上で増殖するフィーダーなしのhESCを、使用してください。細胞外マトリックスでコーティングされたプレート上に最初に通過した後、細胞は24時間添付してみましょう。次の日、分化を開始。 （B-FGFを含む）のCMを削除し、BMP4 / A / P（6ウェルプレート中のウェル当たり2ミリリットル）を含むCMと交換してください。 4％の酸素濃度を用いて細胞を培養することを続けます。
3. BMP4 / A / Pを含むCM（2ミリリットル/ウェルのための6ウェルプレート）2日毎に交換してください。吸引し古い培地を除去し、ピペットを用いて、新しいCMを追加します。 B-FGF（考え分化2日目）のBMP4の追加や削除後の第2日目に、細胞の形態は顕微鏡を用いて観察したときに大きく表示されて、変更されます。
   注：明るい丸い縁を呈する未分化細胞は、存在しません。
4. 希望の時点で細胞を収集します。分化した細胞は、約2週間後に分裂を停止します。この期間中にトランスフェクト細胞（次のセクションを参照）。

siRNAまたはプラスミドDNAと絨毛細胞の4トランスフェクション

1. トランスフェクションのための栄養膜細胞を準備します
   1. MEFのからそれらを転送した後、細胞外マトリックス上の2つの通路のための培養ヒトES細胞（ステップ2.2参照）。 B-FGFを含むhESCの培地を使用してください。
   2. 1日の分化する前に、新しい細胞外マトリックスプレート上にヒトES細胞を分割します。次の日、少なくとも50％の密集度を確保する新しいプレート/ウェル、上に1：高い細胞集密度はそれほど細胞1を分割し、重要です。低酸素インキュベーター中で一晩細胞をインキュベートします。
      注：ヒトES細胞は、このステップ中にカウントする必要はありません。
   3. 次の日は、分化培地で培地を交換してください（CM 6ウェルプレートのためミリリットル/ウェルBMP4 / A / Pを含有し、B-FGFを欠く、2を使用して）。吸引によって古い培地を除去し、ピペットを使用して、新しい培地（2ml）に移します。一晩低酸素インキュベーター（4％酸素）で細胞を置きます。
2. トランスフェクション遺伝子破壊のためにsiRNAを使用するか、プラスミドDNAを用いて
   1. 希望のタイムまで、細胞を分化（1日目と14の間）のポイント。トランスフェクションの前日に、5分間、0.05％トリプシンを用いて細胞をトリプシン処理します。ゼラチンコートプレート上に所望の密集度（トランスフェクション試薬プロトコルに応じて）にそれらをプレート（除去するために20分を吸引するための組織培養プレートに0.1％のゼラチンを追加します）。 （B-FGFを欠く）BMP4 / A / Pを含むCMを追加し、一晩インキュベートします。
   2. 翌日、細胞に新鮮な分化培地を追加します。 siRNAトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトするsiRNA。プラスミドDNAの場合は、適切なリポフェクタミン試薬を使用しています。
   3. 各トランスフェクション試薬について説明したように、製品のプロトコルに従ってください。低酸素インキュベーターで一晩細胞を、各ウェルの細胞/プレートにsiRNAをリポフェクタミン複合体を移し穏やかに混合し、文化。
      注：一部のトランスフェクション試薬は、CMがペニシリン/ストレプトマイシンを欠いている必要が抗生物質によって阻害されています。
   4. 翌日、新鮮な分化培地と交換してください。
   5. 願望で細胞を収穫Dの時点（ 例えば、24時間、48時間、および72時間）定量的RT-PCRを用いて遺伝子破壊効率を確認します。収穫細胞については、ウェル当たり1ミリリットルを添加し、37℃で5分間インキュベートし、0.05％トリプシンを使用します。トリプシンを中和するためにウェルあたりMEF培地の5ミリリットルを追加します。 5分間、200×gで細胞をスピンダウンし、RNA単離のために細胞ペレットを使用します。

絨毛細胞の5病原体感染：仙台ウイルス感染

1. 分化のためにヒトES細胞を準備します
   1. MEFのからの転送後の細胞外マトリックス上の2つの通路のための培養ヒトES細胞（ステップ2.2参照）。 B-FGFを含むhESCの培地を使用してください。
   2. 1日の分化する前に、新しい細胞外マトリックスプレート上にヒトES細胞を分割します。次の日、少なくとも50％の密集度を確保する新しいプレート/ウェル、上に1：高い細胞集密度は、そのように分割セル1が重要です。低酸素インキュベーター（4％酸素）で一晩細胞をインキュベートします。
      注：ヒトES細胞は、このステップ中にカウントする必要はありません。
   3. 翌日、一晩低酸素インキュベーター（4％酸素）に分化培地（CM BMP4 / A / Pを含有し、B-FGFを欠く）と文化で培地を交換してください。
2. 栄養膜細胞の仙台ウイルス感染
   1. ある日、希望分化日の前に、5分間、0.05％トリプシンを用いて、（単一細胞）に分化する細胞をトリプシン処理し、ゼラチンコートプレートに移します。分化培地を追加し、低酸素インキュベーターで一晩インキュベートします。
   2. 翌日、感染のための培地を追加（これは、ウイルスによって異なります）。 6ウェルプレートの1ウェル0.5 mlで使用し、BMP4 / A / Pを含むペニシリン/ストレプトマイシンを欠く使用CM。 MOIは、低酸素インキュベーター中で8時間、1インキュベートを=のためにセンダイウイルスを追加します。
   3. 追加の時点が必要な場合は、4時間後にウイルス含有培地を除去し、BMP4 / A / P CMと交換してください。細胞を回収RNA単離のために細胞スクレーパーを使用して。
   4. ウイルス応答¹⁸に関与する遺伝子のための定量RT-PCRを行うことにより、ウイルス感染の効率を決定します。

結果

hPSCsのインビトロ分化の概要

このインビトロ分化プロトコルは、1の通路（ 図1A）のための無フィーダー条件に移行されたMEF上で増殖させた未分化ヒトES細胞から始まります。私たちはこのプロトコルでhESCの分化を説明したが、我々が正常絨毛細胞にhiPSCsを区別するために、このプロトコルを使用し...

ディスカッション

私たちは、栄養膜の前駆細胞にヒトES細胞を区別するための基本的な手順を提示しました。このプロトコルは、最近栄養膜細胞への分化を増加させ、典型的には単独のBMP4処理で観察された中胚葉前駆細胞の発生を回避すること、急速にアクチビン/ノーダルシグナル伝達阻害剤を添加してヒトES細胞を区別するために最適化されています。 BMP4のモデルシステムは、人間の栄養膜細胞系譜の仕?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Invitrogen	11330-057
Knock Out Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	This is referred to as "serum replacement" in this protocol.
NEAA	Invitrogen	11140-050
FBS	Invitrogen	16000-044
L-Glutamine	Invitrogen	10828-028
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-155
2-Mercaptoethanol	Sigma	M-7522
B-FGF	Millipore	GF-003
DMEM	Invitrogen	11965-118
Dispase	Invitrogen	17105-041
Collagenase Type IV	Invitrogen	17104-019
Rock inhibitor Y27632	Calbiochem	688000
Irradiated CF1 MEFs	GlobalStem	6001G	MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.
0.22 µm syringe filter	Millipore	SLGS033SS
Heracell 150i low oxygen incubator	Heracell/VWR	89187-192	Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.
BMP4	R&D Systems	314-BP-01M
A 83-01	R&D Systems	2939/10
PD173074	R&D Systems	3044/10
RNAiMax	Invitrogen	13778150
Trizol	ThermoFisher	15596026	Trizol is used to isolate total RNA.
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001
Matrigel	Corning	356231	This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol.