جمع السائل المنوي إنفلونزا الطيور بالتدليك المذرق وعزل الحمض النووي من الحيوانات المنوية

Summary

ويصف هذا البروتوكول المذرق التدليك، أسلوب يدوي غير الغازية لجمع السائل المنوي من الطيور، واستخراج الحمض النووي من إنفلونزا الطيور الحيوانات المنوية باستخدام مجموعة أدوات استخراج تجاري مع بعض التعديلات.

Abstract

جمع السائل المنوي قد تكون مفيدة لمجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك الدراسات التي تنطوي على نوعية الحيوانات المنوية، وديناميات telomere الحيوانات المنوية، والتخلق. الطيور المواضيع المستخدمة على نطاق واسع في البحوث البيولوجية وهي مثالية لدراسات شملت عينات الحيوانات المنوية المتكررة. ومع ذلك، موارد قليلة متاحة حاليا لأولئك الذين يرغبون في تعلم كيفية جمع واستخراج الحمض النووي من إنفلونزا الطيور في الحيوانات المنوية. هنا يصف لنا المذرق التدليك، تقنية يدوية رقيقة، وغير الغازية لجمع الحيوانات المنوية إنفلونزا الطيور. على الرغم من أن يتم إنشاء هذا الأسلوب في الأدب، يمكن أن يكون من الصعب معرفة من الأوصاف المتوفرة. كما نقدم معلومات لاستخراج الحمض النووي من السائل المنوي إنفلونزا الطيور باستخدام مجموعة أدوات استخراج تجاري مع بعض التعديلات. ويمكن استخدام تدليك المذرق بسهولة على أي الطيور الذكور الصغيرة إلى متوسطة الحجم في حالة الإنجاب. وبعد جمع والسائل المنوي يمكن استخدامها فورا لفحوصات حركية، أو المجمدة لاستخراج الحمض النووي بعد البروتوكول الموضحة هنا. هذا البروتوكول استخراج المكرر لإنفلونزا الطيور في الحيوانات المنوية وقد استخدمت بنجاح في العينات التي جمعت من العديد من أنواع الجواثم (أسير دوميستيكوس باسيرينا سبيزيلا، هايمورهوس مكسيكيو ميجراتوريوس توردوس ) وواحدة كولومبيد (كولومبا ليفيا).

Introduction

الطيور ومواضيع مثالية للدراسات التي تنطوي على نوعية الحيوانات المنوية والمنافسة¹والحيوانات المنوية telomere ديناميات²والتخلق³ومواضيع مماثلة، كما أنها تستخدم على نطاق واسع في البحوث البيولوجية ويمكن تذوق الحيوانات المنوية بسهولة باستخدام المذرق تدليك. تدليك المذرق أسلوب يدوي لطيف، وغير الغازية لجمع السائل المنوي من الطيور^4،،من⁵⁶. ويمكن الحصول على عينات متكررة بسهولة ولا أدوات خاصة مطلوبة، مما يجعل من السهل القيام به في الميدان أو في المختبر. رغم المذرق تدليك في الاستخدام لعقود من الزمان، فمن الصعب معرفة من كتب الأوصاف المتوفرة. ويهدف هذا المنشور تقليل الوقت والمشاركة في تعلم تدليك المذرق من عدم اليقين.

السائل المنوي التي تم جمعها من الطيور باستخدام تدليك المذرق يمكن استخدامها على الفور لتقييم حركية^4،7 أو⁸من التلقيح الاصطناعي، أو المجمدة لاستخدامات أخرى مثل تصوير متقدمة واستخراج الحمض النووي. عينات السائل المنوي من الطيور الجواثم الصغيرة ولكن تحتوي على كثافة الحيوانات المنوية. يتم استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات استخراج تجاري للبساطة، مع بعض التعديلات للتغلب على ميزات الحماية المتخصصة للحيوانات المنوية⁹. بعد استخراج، يمكن قياس التيلومير الحيوانات المنوية باستخدام قبكر¹⁰.

Protocol

هذا البروتوكول يشمل مواضيع الحيوانات الفقارية، وقد أقرها "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة ولاية داكوتا الشمالية.

1-السائل المنوي مجموعة من الطيور الجواثم استخدام تدليك المذرق

ملاحظة: المذرق التدليك هو أسلوب جمع السائل المنوي فعالة في الطيور النشطة التناسل فقط، ولكن يمكن أن يؤديها بنجاح خارج موسم التكاثر في الحالات المناسبة الأسير. وينبغي تحديد الأنشطة الإنجابية للأنواع المستهدفة قبل استخدام تدليك المذرق. يمكن استخدام هذا الأسلوب على الطيور البرية عند التقاط أو الطيور في الأسر.

1. بدءاً من الطيور ذكور، (في تربية الشرط) القبضة في بندر في اليد غير المهيمنة، نقل الطيور في اليد المسيطرة مع الجانب البطني لمس كف (الشكل 1).
   1. ضمان أن رأس الطائر الأقرب إلى الحافة الجانبية لكف. تأمين خفة الرأس والجسم استخدام الخنصر، وخاتم والأصابع الوسطى. وهذا يترك تنفيس الطائر وذيل مكشوف.
   2. ترك الساقين الطائر فضفاضة أو ضبط النفس طفيفة استخدام النخيل.

الشكل 1 : قبضة للتدليك المذرق. يتم تأمين الطيور طفيفة في اليد المسيطرة مع الجانب البطني لمس النخيل ورأسه المضمونة بأصبع الخنصر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

2. وضع مهيمن السبابة والإبهام على جانبي نهاية متفوقة مجرور واستخفاف قرصه الأصابع معا أثناء تطبيق ضغط طفيف جداً تجاه الذيل ( الشكل 2). وسوف إيفرت مجرور، تعريض الغشاء المخاطي المذرق (الوردي الداخلية).
   ملاحظة: إذا لم تكن الطيور حاليا بإنتاج السائل المنوي، الناشزة المذرق يمكن أن تكون صغيرة وأن مجرور من الصعب أن إيفرت. ذوي الخبرة، فمن السهل أن يميز بين كلواكاس من الذكور التناسل النشطة وغير النشطة^5،11.

الشكل 2 : فنجر الموقف والناشزة المذرق. إيفرت مجرور بتطبيق ضغط طفيف للغاية متفوقة (A). الناشزة المذرق الواضح في عصفوريات ذكور التناسل نشطة، وشركة (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

3. باليد غير المهيمنة، وضع اللوحة السبابة على الجهة الظهرية من قاعدة الذيل إلى تحقيق الاستقرار من ناحية، ومن ثم ضع طرف الإبهام فقط أدناه مجرور افيرتيد.
   ملاحظة: صورة مصغرة قصيرة والسلس هو مفيد لأداء تدليك المذرق ويحمي الطيور من إصابة عرضية.
4. تحريك الإبهام غير المهيمنة cranially وعميقة في حركة متكررة مع الضغط المتوسط، البقاء أدناه مجرور. تستمر حتى أنزل الطيور. اعتماداً على الفرد، وهذا يستغرق عادة ما بين 1 وعدد من السكتات الدماغية عشرات.
5. في أقرب وقت أنزل الطيور، جمع السائل المنوي في أنبوب ميكروهيماتو. أنزل تدليك المذرق تكرار الحصول على متعددة.
   ملاحظة: السائل المنوي الجواثم خفيفة البنى وعادة بوجود اتساق سميكة نوعا ما. المواد البيضاء أو السوداء إخراج من مجرور لا المني، وقد تلوث عينة السائل المنوي. المظهر من كمية صغيرة من الدم على مجرور أو مختلطة في السائل المنوي عادة بسبب الكثير من الضغط أثناء التدليك.
6. لاستخراج الحمض النووي، وضع السائل المنوي في أنبوب ميكروسينتريفوجي مع 20 ميليلتر من 1 x PBS (درجة الحموضة 7.4). ملاحظة: السائل المنوي تخزينها في برنامج تلفزيوني 1 x ليست مناسبة للتلقيح الاصطناعي، ولكن يمكن أن تستخدم لاستخراج الحمض النووي في وقت لاحق عند تخزينها في-80 درجة مئوية. برنامج تلفزيوني يمكن أن تكون درجة حرارة الغرفة أو مبردة، ولكن ينبغي أن يكون في حالة سائلة عندما يتم إيداع عينة السائل المنوي.
   1. تأكيد وجود الحيوانات المنوية في العينة بعرض كمية صغيرة من العينة المخففة تحت مجهر المركب (الشكل 3).
7. تخزين السائل المنوي المخفف في-80 درجة مئوية حتى الاستخراج.

2-استخراج الحمض النووي من السائل المنوي الطيور

ملاحظة: تم اختبار هذا البروتوكول مع عدة مجموعات استخراج الحمض النووي التجاري، ولكن فقط كان النجاح عند استخدامها مع مجموعة الحمض النووي واحد¹². الخطوات التي يتم تعديلها من مواد البروتوكول المشار إليها بواسطة *.

1. إعداد حل م 1 من ديثيوثريتول (DTT) في المياه، واستخدام vortex.* مزيج
   1. قاسمة الحل DTT وتخزينها في-20 درجة مئوية إلى حين مباشرة قبل الاستخدام. ويتطلب كل عينة استخراج 10 ميليلتر من solution.* DTT م 1
2. إعداد المخزن مؤقت الذي يحتوي على 20 مم تريس-Cl، pH 8.0; 20 مم يدتا؛ 200 ملم كلوريد الصوديوم؛ والحزب الديمقراطي الصربي 4%. ويتطلب كل عينة استخراج ميليلتر 90 من هذا buffer.*
   1. تخزين المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة. إذا قد عجلت، الحارة إلى 56 درجة مئوية إلى dissolve.*
3. يسخن حاضنة يحتوي على الروك أو شاكر إلى 65 ° C.*
4. فورا قبل البدء بالاستخراج، مزيج 10 ميليلتر DTT الحل مع ميليلتر 90 من المخزن المؤقت الذي تم إعداده في الخطوة 2، 2 لكل عينة لاستخراجها، مثلاً 900 ميليلتر المخزن المؤقت بالإضافة إلى 100 ميليلتر DTT الحل إذا كان استخراج العينات العشر. وسوف يطلق هذا الخليط DTT-buffer.*
5. إضافة 70 برنامج تلفزيوني 1 x ميليلتر إلى عينة السائل المنوي المخفف كامل وتخلط جيدا باستخدام vortex.*
6. إضافة 100 ميليلتر المخزن المؤقت DTT و 10 ميليلتر بروتيناز ك حل العينة. دوامة لمدة 20 ثانية، ثم احتضانها في الحاضنات مسخن لمدة 1 ساعة على الروك أو shaker.*
7. إضافة 200 ميليلتر المخزن المؤقت AL و 200 ميليلتر EtOH الطازجة (100%) ودوامه ل 20 seconds.*
8. نقل نموذج كامل لعمود دوران والطرد المركزي 1 دقيقة في غ. س 6,000 تجاهل أنبوب جمع.
9. وضع العمود في أنبوب جديد وإضافة 500 ميليلتر إعداد المخزن المؤقت AW1. الطرد المركزي 1 دقيقة في غ. س 6,000 تجاهل أنبوب جمع.
10. وضع العمود في أنبوب جديد وإضافة 500 ميليلتر إعداد المخزن المؤقت AW2. تجاهل أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة على 6,000 غ. س من خلال تدفق ومكان العمود مرة أخرى على الأنبوبة.
11. الطرد المركزي 3 دقائق في 20,000 خ زاي تجاهل أنبوب جمع ووضع العمود على أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
12. بيبيت 35 ميليلتر من عبد اللطيف المخزن المؤقت مباشرة على الغشاء العمود واحتضان في درجة حرارة الغرفة ل 5 minutes.*
13. الطرد المركزي 1 دقيقة في س 14,000 غ. تجاهل عمود الدوران وتخزين العينات المستخرجة في-80 درجة مئوية.

النتائج

تدليك المذرق واستخراج الحمض النووي باستخدام بروتوكول وصف قد أجريت على العديد من أنواع الجواثم وكولومبيد واحد (الجدول 1). وأكد أن وجود الحيوانات المنوية في السائل المنوي عينات جمعت من تدليك المذرق عرض كمية صغيرة من عينات المخفف تحت مجهر المركب في 400 X التكبير (

Discussion

يصف لنا طريقة بسيطة وموثوق بها لجمع السائل المنوي من الطيور الصغيرة والمتوسطة الحجم في حالة نشطة التناسل، واستخراج الحمض النووي من إنفلونزا الطيور في الحيوانات المنوية.

بروتوكول استخراج الحمض النووي وصف السائل المنوي تعديل من مجموعة للبساطة ولكن المكرر للاستخدام في السا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microhematocrit capillary tubes	Fisherbrand	22-362566	Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow.
Microcentrifuge tubes	Any
1x PBS	Any		Used for storing semen samples prior to DNA extraction.
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Tris base	Sigma-Aldrich	10708976001	Any supplier can be used.
EDTA	Sigma-Aldrich	1233508	Any supplier can be used.
NaCl	Sigma-Aldrich	793566	Any supplier can be used.
SDS	Sigma-Aldrich	1614363	Any supplier can be used.
QIAamp DNA micro kit	Qiagen	56304	Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us.