JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu iletişim kuralı cloacal Masaj, kuşlar ve kuş sperm bir ticari ekstraksiyon kiti değişiklikleri ile kullanarak çıkarma DNA meni toplamak için bir non-invaziv el ile teknik açıklar.

Özet

Meni topluluğu çeşitli sperm kalitesi, sperm telomer dynamics ve epigenetik ilgili çalışmalar da dahil olmak üzere uygulamalar için yararlı olabilir. Kuşlar biyolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılan konulardır ve tekrarlanan sperm örnekleri içeren çalışmaları için idealdir. Ancak, az kaynak şu anda toplamak ve kuş sperm DNA ayıklamak nasıl öğrenmek isteyenler için kullanılabilir. Burada cloacal Masaj, kuş sperm toplamak için bir nazik, non-invaziv el ile teknik açıklayın. Ne kadar bu teknik literatürde kurulur, kullanılabilir açıklamaları öğrenmek zor olabilir. Ayrıca DNA kuş meni bir ticari ekstraksiyon kiti değişiklikleri ile kullanarak çıkarma hakkında bilgi sağlar. Cloacal masaj kolayca herhangi bir küçük ve orta boyutlu erkek kuş üreme durumda kullanılabilir. Koleksiyon meni hemen motilite testleri için kullanılan, veya burada açıklanan protokol sonrası DNA ekstraksiyon için dondurulmuş. Bu ayıklama protokolü için kuş sperm rafine ve başarıyla birçok ötücü türü (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanusve Turdus migratorius toplanan örnekleri üzerinde kullanılan ) ve bir columbid (Columba livia).

Giriş

Sperm kalitesini ve rekabet1, sperm telomer dynamics2, epigenetik3ve benzer konular, ilgili sıra onlar biyolojik araştırmalarda yaygın olarak kullanılır ve sperm kolayca cloacal kullanarak tatmak mümkündür çalışmaları için ideal konular kuştur Masaj. Cloacal masaj meni kuşlar4,5,6toplamak için bir nazik, non-invaziv manuel tekniktir. Yinelenen örnekleri kolayca elde edilebilir ve hiçbir özel araç alan veya laboratuvar gerçekleştirmek basit yapmak gerekli. Cloacal masaj yıllardır kullanılıyor olsa da, mevcut gelen açıklamalar yazılı öğrenmek zordur. Bu yayın belirsizlik cloacal masaj öğrenmede yer ve zamanı azaltmak için tasarlanmıştır.

Meni cloacal masaj kullanarak kuşlardan toplanan hemen hareketliliği değerlendirme4,7 veya suni tohumlama8için kullanılan veya gelişmiş görüntüleme ve DNA ekstraksiyon gibi diğer kullanımlar için dondurulmuş. Sperm örneği ötücü kuşlar küçük ama yoğun paketlenmiş sperm barındırır. DNA sperm9özel koruyucu özellikleri üstesinden gelmek için değişiklikleri ile sadelik için bir ticari ekstraksiyon kiti kullanılarak elde edilir. Çıkarma sonra sperm telomerlerin qPCR10kullanılarak ölçülebilir.

Protokol

Bu iletişim kuralı omurgalı hayvan konular içerir ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Kuzey Dakota Eyalet Üniversitesi tarafından onaylandı.

1. meni koleksiyonundan bir ötücü kuş cloacal masaj kullanarak

Not: Cloacal masaj bir çoğalma etkin kuşlar sadece üzerinde etkili meni koleksiyonu tekniktir, ancak başarıyla uygun esir durumlarda Üreme mevsimi dışında yapılan. Üreme faaliyet cloacal masaj kullanmadan önce hedef türler için tespit edilmelidir. Bu teknik yakalama üzerine yabani kuş vurmak ya da esaret altında düzenlenen kuşlar kullanılabilir.

  1. (İçinde durumu doğurmak) bir erkek kuş ile başlayan sigara dominant el pençesinde bander'ın aktarım kuş dominant el palm (şekil 1) dokunmadan ventral yan ile.
    1. Kuş başı lateral palmiye kenarına en yakın olduğundan emin olun. Hafif baş ve orta parmak, yüzük ve serçe kullanarak güvenli. Bu kuşun havalandırma ve kuyruk maruz bırakır.
    2. Kuş bacaklar gevşek veya hafifçe ölçülü palmiye kullanarak bırakın.

figure-protocol-1157
Resim 1 : Kavrama cloacal masaj için. Kuş hafifçe dominant el palm ve pinky parmak tarafından güvenli baş dokunmadan ventral yan ile sabitlenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. Baskın işaret parmağı ve başparmak lağım üstün sonu her iki tarafında yerleştirin ve hafifçe parmak birlikte kuyruk ( Şekil 2) doğru çok hafif basınç uygularken çimdik. Lağım cloacal mukoza (pembe iç) açığa çıkar.
    Not: kuş ise cloacal tümsek küçük olabilir şu anda meni, üreten ve lağım evert zordur. Tecrübesiyle, çoğalma etkin ve etkin olmayan erkek5,11cloacas arasında ayırt etmek kolaydır.

figure-protocol-2142
Resim 2 : Parmak pozisyonu ve cloacal tümsek. Lağım üstün sonuna (A) hafif basınç uygulayarak çıkar. Bir çoğalma aktif erkek ötücü içinde cloacal tümsek açıktır ve firma (B). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. Sigara dominant el ile kuyruk el stabilize etmek için tabanının dorsal tarafta parmağı yastık yerleştirin ve diplidir lağım hemen altında parmak ucu yerleştirin.
    Not: Kısa ve yumuşak küçük resim cloacal masaj gerçekleştirmek için avantajlıdır ve kaza sonucu yaralanma kuş korur.
  2. Baskın başparmak hareket derin ve cranially lağım kalma orta basınç ile tekrarlayan bir hareket. Kuş cinsel ilißki kadar devam edin. Bireysel bağlı olarak, bu genellikle 1 ve birkaç düzine vuruşları arasında sürer.
  3. En kısa zamanda kuş cinsel ilißki, meni mikrohematokrit tüp içinde toplamak. Cloacal masaj birden fazla cinsel ilißki elde etmek için yineleyin.
    Not: Ötücü meni hafif kahverengi ve genellikle biraz kalın bir tutarlılık vardır. Beyaz ve koyu maddelerden lağım atılır meni değildir ve meni örnek kontamine. Az miktarda kan lağım bulunan görünümünü veya içinde ile karışık meni genellikle masaj sırasında çok fazla baskı tarafından neden olur.
  4. DNA ekstraksiyon için 1 x PBS (pH 7,4) 20 µL ile microcentrifuge tüp meni yerleştirin. Not: 1 x PBS içinde depolanan meni suni tohumlama için uygun değildir, ancak DNA ekstraksiyon daha sonraki bir tarihte kullanılan-80 ° C'de saklandığında PBS Oda sıcaklık olabilir veya soğutulmuş ama meni örnek yatırılır sıvı bir durumda olması gerekir.
    1. Sperm örnek varlığı seyreltilmiş örnek (şekil 3) bileşik mikroskop altında küçük bir miktar görüntüleyerek doğrulayın.
  5. -80 ° C'de seyreltilmiş meni ayıklama kadar saklayın.

2. çıkarma DNA'ın kuş meni

Not: Bu iletişim kuralı birden fazla ticari DNA ekstraksiyon kitleri ile test edilmiştir, ancak sadece bir DNA kiti12ile kullanıldığında başarılı oldu. Değiştirilen kiti Protokolü adım simgesiyle *.

  1. Dithiothreitol (DTT) suda 1 M çözeltisi hazırlamak ve bir vortex.* kullanarak mix
    1. Aliquot DTT çözüm ve -20 ° c kadar kullanımdan hemen önce saklayın. Elde edilebilir için her örnek, 1 M DTT solution.* 10 µL gerektirir
  2. 20 mM Tris-Cl, pH 8.0 içeren bir arabellek hazırlamak; 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; ve % 4 SDS. Bu buffer.* 90 µL ayıklanmasını her örneği gerektirir
    1. Arabellek, oda sıcaklığında saklayın. Çöktürülmüş Eğer o dissolve.* 56 ° c sıcak
  3. Bir rocker veya shaker 65 içeren bir kuluçka Onceden ° C.*
  4. Hemen çıkarma işlemine başlamadan önce 10 µL DTT çözüm 10 örnekleri açılan Eğer adım 2.2 her örnek elde edilebilir, örneğin 900 µL arabellek artı 100 µL DTT çözüm için hazırlanan tampon 90 µL ile karıştırın. Bu karışım DTT-buffer.* adı verilecek
  5. 70 µL 1 x PBS tüm seyreltilmiş meni örnek ve iyi bir vortex.* kullanarak karıştırın
  6. 100 µL eklemek DTT-tampon ve 10 µL İndinavir K çözüm örnek. Girdap 20 saniye sonra bir rocker veya shaker.* 1 saat önceden ısıtılmış kuluçka makinesine kuluçkaya
  7. 200 µL tampon AL ve 200 µL eklemek taze alkol (% 100) ve 20 seconds.* için girdap
  8. Tüm örnek bir spin sütuna aktarmak ve 6.000 x g. atma 1 dakikada toplama tüp santrifüj kapasitesi.
  9. Sütun yeni bir tüp yerleştirin ve 500 µL hazırlanan tampon AW1 ekleyin. 1 6.000 x g. atma dakikada toplama tüp santrifüj kapasitesi.
  10. Sütun yeni bir tüp yerleştirin ve 500 µL hazırlanan tampon AW2 ekleyin. 6.000 x g. adlı 1 dakika santrifüj atmak akışı aracılığıyla ve sütun geri televizyonda yer.
  11. 3 dakika 20.000 x g. atma, koleksiyon tüp santrifüj kapasitesi ve sütun bir 1.5 mL microcentrifuge tüp yerleştirin.
  12. Damlalıklı 35 AE µL arabellek sütun membran doğrudan ve oda sıcaklığında 5 güncellemeler için kuluçkaya
  13. 1 dakikada 14.000 x g. atma spin sütun santrifüj kapasitesi ve ayıklanan örnekleri-80 ° C'de depolayın

Sonuçlar

Cloacal masaj ve açıklanan protokol birçok ötücü türü ve bir columbid (Tablo 1) gerçekleştirilen ayıklama DNA'yı kullanarak. Sperm meni örneklerinin cloacal masaj tarafından toplanan varlığı 400 X büyütme (şekil 3) seyreltilmiş numune bir bileşik mikroskop altında küçük bir miktar ile ilgilenen tarafından doğrulandı. DNA sperm örneği açılan house burada açıklanan protokolü kullanarak serçeler toplanan sonr...

Tartışmalar

Biz küçük ve orta ölçekli kuşlar üreme etkin durumda sperm toplama ve kuş sperm DNA ayıklanması için basit ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır.

Açıklanan Sperm DNA ekstraksiyon protokolü bir kit basitlik için değiştirilebilir, ancak kuş meni kullanmak için rafine. Sperm lizis standart ayıklama kimyasallar9,13tarafından dayanıklı ve sperm örneği ötücüler toplanan oldukça küçük (genellikle bir ka?...

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

Ve Jeffrey Kittilson laboratuvarı için destek biz Jose Noguera cloacal Masaj, erken hakkında yardım almak için teşekkür ederiz. Bu eser bir ND EPSCoR FAR0022429 Ödülü BJH için tarafından desteklenmiştir. Yayın ücreti cömertçe NDSU bölümü Biyolojik Bilimler tarafından desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Microhematocrit capillary tubesFisherbrand22-362566Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow.
Microcentrifuge tubesAny
1x PBSAnyUsed for storing semen samples prior to DNA extraction.
DL-DithiothreitolSigma-AldrichD0632
Tris baseSigma-Aldrich10708976001Any supplier can be used.
EDTASigma-Aldrich1233508Any supplier can be used.
NaClSigma-Aldrich793566Any supplier can be used.
SDSSigma-Aldrich1614363Any supplier can be used.
QIAamp DNA micro kitQiagen56304Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us. 

Referanslar

  1. Briskie, J. V., Montgomerie, R. Sperm size and sperm competition in birds. Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).
  2. Monaghan, P. Telomeres and life histories: the long and the short of it. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).
  3. Carrell, D. T. Epigenetics of the male gamete. Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).
  4. Burrows, W. H., Quinn, J. P. The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).
  5. Wolfson, A. The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds. Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).
  6. Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment. The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).
  7. Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus. Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).
  8. Purchase, C. F., Earle, P. T. Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data. J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).
  9. Gill, P., Jeffreys, A. J., Werrett, D. J. Forensic application of DNA 'fingerprints'. Nature. 318 (12), 577-579 (1985).
  10. Criscuolo, F., et al. Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres. J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).
  11. Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. . Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition. , (2016).
  12. . . QIAamp DNA Micro Handbook. , (2014).
  13. Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs. Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).
  14. Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler. Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).
  15. Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds. Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).
  16. Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates). Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).
  17. Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species. J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im biyolojisisay 132SpermkuDNAcloacal Masajay klamat c

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır