Raccolta dello sperma aviaria Cloacal massaggi e isolamento di DNA da sperma

Riepilogo

Questo protocollo descrive cloacal massaggio, tecnica manuale non invasiva per la raccolta di sperma da uccelli ed estrazione di DNA da aviaria dello sperma usando un kit di estrazione commerciale con modifiche.

Abstract

Raccolta di sperma può essere utile per una vasta gamma di applicazioni, tra cui studi su qualità dello sperma, sperma del telomero dinamiche e l'epigenetica. Gli uccelli sono soggetti ampiamente usati nella ricerca biologica e sono ideali per studi condotti su campioni di sperma ripetuti. Tuttavia, poche risorse sono disponibili per coloro che desiderano imparare a raccogliere ed estrarre DNA da sperma aviaria. Qui descriviamo cloacal massaggio, una tecnica manuale dolce, non invasiva per la raccolta dello sperma aviaria. Anche se questa tecnica è stabilita nella letteratura, può essere difficile da imparare dalle descrizioni disponibili. Forniamo anche informazioni per l'estrazione del DNA da aviaria sperma usando un kit di estrazione commerciale con modifiche. Massaggi cloacal possono essere facilmente utilizzato su qualsiasi uccello maschio medio-piccole in condizione riproduttiva. Dopo il prelievo, lo sperma può essere utilizzato immediatamente per saggi di motilità, o bloccato per l'estrazione del DNA seguendo il protocollo descritto nel presente documento. Questo protocollo di estrazione è stato perfezionato per aviaria sperma ed è stato utilizzato con successo su campioni raccolti da diverse specie di passeriformi (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanuse Turdus migratorius ) e un columbid (Columba livia).

Introduzione

Gli uccelli sono soggetti ideali per studi su qualità dello sperma e concorso¹, sperma del telomero dinamica², epigenetica³e argomenti simili, come essi sono ampiamente utilizzati nella ricerca biologica e dello sperma può essere facilmente campionato utilizzando cloacal massaggi. Cloacal massaggio è una tecnica manuale dolce, non invasiva per la raccolta dello sperma da uccelli^4,5,6. Campioni ripetuti possono essere ottenuti facilmente e attrezzi speciali non sono necessari, che lo rende semplice da eseguire nel campo o nel laboratorio. Anche se cloacal massaggi sono stato in uso per decenni, è difficile da imparare dalla scritta descrizioni disponibili. Questa pubblicazione è intesa a ridurre il tempo e l'incertezza coinvolti nell'apprendimento massaggi cloacal.

Lo sperma raccolto da uccelli utilizzando cloacal massaggio può essere utilizzato immediatamente per motilità valutazione^4,7 o⁸di inseminazione artificiale, o congelato per altri usi come imaging avanzato e l'estrazione del DNA. Campioni di liquido seminale da uccelli passeriformi sono piccoli ma contengono sperma densamente imballato. Il DNA è estratto usando un kit di estrazione commerciale per semplicità, con modifiche per superare le caratteristiche protettive specializzate di sperma⁹. Dopo l'estrazione, i telomeri dello sperma possono essere misurati usando qPCR¹⁰.

Protocollo

Questo protocollo coinvolge soggetti animali vertebrati ed è stato approvato dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) North Dakota State University.

1. centri di raccolta da un uccello passeriforme utilizzando cloacal massaggi

Nota: Cloacal massaggio è una tecnica di raccolta di sperma efficace sugli uccelli riproduttivo attivi solo, ma può essere eseguita correttamente di fuori della stagione riproduttiva nelle opportune situazioni in cattività. Attività riproduttiva deve essere determinata per specie di destinazione prima di utilizzare massaggio cloacal. Questa tecnica può essere utilizzata su uccelli selvatici al momento cattura o sugli uccelli tenuti in cattività.

1. A partire con un uccello maschio, (in condizioni di allevamento) presa di Bonetti nella mano non dominante, trasferire l'uccello alla mano dominante con il lato ventrale toccando il palmo (Figura 1).
   1. Assicurarsi che la testa dell'uccello è più vicino il bordo laterale del palmo della mano. Garantire leggermente la testa e il corpo utilizzando il mignolo, anello e le barrette centrali. Questo lascia l'uccello dello sfiato e coda esposti.
   2. Lasciare le gambe d'uccello sciolti o leggermente trattenuto usando il palmo.

Figura 1 : Presa per massaggi cloacal. L'uccello è protetto con leggerezza nella mano dominante con il lato ventrale toccando la Palma e la testa, protetta dal dito mignolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Posizionare l'indice e pollice dominante su entrambi i lati dell'estremità superiore della cloaca e leggermente avvicinare le dita esercitando una pressione molto lieve verso la coda ( Figura 2). La cloaca sarà evert, esponendo la mucosa cloacale (interni rosa).
   Nota: Se l'uccello non è attualmente in produzione dello sperma, la protuberanza cloacal può essere piccola e la cloaca è difficile da evert. Con esperienza, è facile distinguere tra il cloacas i maschi riproduttivi attivi e inattivi^5,11.

Figura 2 : Dito posizione e protuberanza cloacal. Evert cloaca applicando leggera pressione all'estremità superiore (A). In un passeriforme maschio riproduttivo attivo, è evidente la protuberanza cloacale e impresa (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Con la mano non dominante, posizionare il cuscinetto del dito indice sul lato dorsale della base della coda per stabilizzare la mano e quindi posizionare la punta del pollice appena sotto la cloaca anteverso.
   Nota: Una miniatura corta e liscia è vantaggiosa per l'esecuzione di massaggi cloacal e protegge l'uccello da un infortunio accidentale.
4. Spostare il pollice non dominante cranialmente e profondo in un movimento ripetitivo con media pressione, restando di sotto della cloaca. Continuare fino a quando l'uccello eiacula. A seconda dell'individuo, ciò avviene in genere tra 1 e parecchi dozzina colpi.
5. Non appena l'uccello eiacula, raccogliere lo sperma in un tubo di microhematocrit. Ripetere cloacal massaggio per ottenere più eiacula.
   Nota: Lo sperma passeriforme è marrone chiaro e in genere ha una consistenza piuttosto densa. Bianche o scure sostanze espulsione dalla cloaca non sono lo sperma e potrebbero contaminare il campione di sperma. L'aspetto di una piccola quantità di sangue sulla cloaca o misto in con lo sperma è solitamente causato da troppa pressione durante il massaggio.
6. Per estrazione del DNA, è possibile inserire lo sperma in un tubo del microcentrifuge con 20 µ l di 1X PBS (pH 7.4). Nota: Semen memorizzati in 1X PBS non è adatto per l'inseminazione artificiale, ma può essere utilizzato per l'estrazione di DNA in un secondo momento quando conservato a-80 ° C. Il PBS può essere a temperatura ambiente o refrigerati, ma dovrebbe essere in uno stato liquido quando viene depositato il campione di sperma.
   1. Confermare la presenza di spermatozoi nel campione visualizzando una piccola quantità del campione diluito sotto un microscopio composto (Figura 3).
7. Conservare lo sperma diluito a-80 ° C fino all'estrazione.

2. estrazione di DNA da sperma di uccello

Nota: Questo protocollo è stato testato con più kit commerciali di estrazione del DNA, ma ha solo avuto successo quando viene utilizzato con un DNA kit¹². Passaggi che vengono modificati dal protocollo kit sono indicati da *.

1. Preparare una soluzione 1 M di ditiotreitolo (DTT) in acqua e mescolare usando un vortex.*
   1. Aliquota della soluzione DTT e conservare a-20 ° C fino a immediatamente prima dell'uso. Ogni campione deve essere estratto richiede 10 µ l di soluzione di 1m DTT
2. Preparare un tampone contenente 20 mM Tris-Cl, pH 8.0; 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; e 4% SDS. Ogni campione deve essere estratto richiede 90 µ l di questa buffer.*
   1. Conservare il tampone a temperatura ambiente. Se è precipitato, riscaldarlo a 56 ° C per dissolve.*
3. Preriscaldare un incubatore contenente un rocker o agitatore a 65 ° c. *
4. Immediatamente prima di iniziare l'estrazione, mescolare 10 µ l di soluzione DTT con 90 µ l di tampone preparata al punto 2.2 per ciascun campione da estrarre, ad esempio 900 µ l di tampone più 100 µ l di soluzione DTT se l'estrazione di 10 campioni. Questa miscela si chiamerà DTT-buffer.*
5. Aggiungere 70 µ l 1X PBS per il campione di sperma diluito intero e mescolare bene con un vortex.*
6. Aggiungere 100 µ l DTT-buffer e 10 µ l di soluzione di proteinasi K al campione. Vortice per 20 secondi, quindi Incubare in incubatrice preriscaldato per 1 ora su un bilanciere o shaker.*
7. Aggiungere 200 µ l tampone AL e 200 µ l fresco EtOH (100%) e vortex per 20 seconds.*
8. Trasferire l'intero campione a una colonna di spin e centrifugare a 1 minuto a 6.000 x g. gettare la provetta di raccolta.
9. Posizionare la colonna su un tubo nuovo e aggiungere 500 µ l preparati buffer AW1. Centrifugare 1 minuto a 6.000 x g. gettare la provetta di raccolta.
10. Posizionare la colonna su un tubo nuovo e aggiungere 500 µ l preparati buffer AW2. Centrifugare per 1 minuto a 6.000 g. x eliminare il flusso continuo e posto la colonna posteriore sul tubo.
11. Centrifugare per 3 minuti a 20.000 x g. gettare il tubo di raccolta e posizionare la colonna in una microcentrifuga da 1,5 mL.
12. Dispensare 35 µ l di AE buffer direttamente sulla membrana di colonna e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. *
13. Centrifugare 1 minuto a 14.000 x g. gettare la colonna di spin e conservare i campioni estratti a-80 ° C.

Risultati

Cloacal massaggi e DNA estrazione utilizzando che il protocollo descritto è stato eseguito su diverse specie di passeriformi e uno columbid (tabella 1). Visualizzando una piccola quantità di campioni diluiti sotto un microscopio composto a 400 ingrandimenti (Figura 3) è stata confermata la presenza di spermatozoi nel seme campioni raccolti da massaggio cloacal. Dopo l'estrazione del DNA dai campioni di sperma raccolto da passeri della came...

Discussione

Descriviamo un metodo semplice e affidabile per la raccolta dello sperma da uccelli di piccoli e medi in stato riproduttivo attivo ed estrazione di DNA da sperma aviaria.

Il protocollo di estrazione del DNA dello sperma descritto viene modificato da un kit per semplicità, ma è stato perfezionato per l'uso su sperma aviaria. Gli spermatozoi sono resistenti alla lisi di estrazione standard prodotti chimici^9,13, e campioni di sperma rac...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microhematocrit capillary tubes	Fisherbrand	22-362566	Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow.
Microcentrifuge tubes	Any
1x PBS	Any		Used for storing semen samples prior to DNA extraction.
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Tris base	Sigma-Aldrich	10708976001	Any supplier can be used.
EDTA	Sigma-Aldrich	1233508	Any supplier can be used.
NaCl	Sigma-Aldrich	793566	Any supplier can be used.
SDS	Sigma-Aldrich	1614363	Any supplier can be used.
QIAamp DNA micro kit	Qiagen	56304	Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us.