אוסף העופות זרע על ידי עיסוי Cloacal ובידוד של ה-DNA של הזרע

Summary

פרוטוקול זה מתאר עיסוי cloacal, טכניקה ידני פולשני עבור איסוף זרע מן הציפורים, והפקת DNA מן העופות הזרע באמצעות ערכת חילוץ מסחרי עם שינויים.

Abstract

איסוף זרע עשויה להיות שימושית עבור מגוון רחב של יישומים כולל מחקרים שכללו איכות זרע, זרע טלומר dynamics, אפיגנטיקה. ציפורים נמצאים בשימוש נרחב הנבדקים במחקר ביולוגי והם אידיאליים עבור מחקרים שכללו דגימות זרע חוזרות ונשנות. עם זאת, מעט משאבים זמינים כעת עבור אלה המעוניינים ללמוד כיצד לאסוף לחלץ את ה-DNA של הזרע העופות. כאן נתאר עיסוי cloacal, טכניקה ידני עדין, לא פולשנית עבור איסוף זרע העופות. למרות טכניקה זו נוצר בספרות, זה יכול להיות קשה ללמוד מן התיאורים זמינים. כמו כן, אנו מספקים מידע עבור חילוץ דנ א בזרע העופות באמצעות ערכת חילוץ מסחרי עם שינויים. עיסוי cloacal יכול לשמש בקלות על ציפור זכר קטן-בינוני במצב הרבייה. בעקבות אוסף, הזרע שניתן להשתמש באופן מיידי עבור מבחני תנועתיות או קפוא להפקת DNA בעקבות הפרוטוקול כפי שיתואר בהמשך. פרוטוקול החילוץ זה היה מעודן לזרע העופות, נעשה בהצלחה על דגימות שנאסף מספר מינים ציפורי שיר מ (פאסר דומסטיקוס Spizella passerina, Haemorhous mexicanus, migratorius ציור ), אחד columbid (ליוויה יונה).

Introduction

ציפורים הן נושאים אידיאלי עבור מחקרים שכללו איכות הזרע, תחרות¹, זרע טלומר dynamics², אפיגנטיקה³ונושאים דומים, הם נמצאים בשימוש נרחב המחקר הביולוגי, זרע ניתן בקלות לטעום באמצעות cloacal עיסוי. עיסוי cloacal היא טכניקה ידני עדין, לא פולשנית עבור איסוף זרע מן הציפורים-^4,-^5,-⁶. דוגמאות חוזרות ניתן להשיג בקלות, אין כלים מיוחדים נדרשים, עושה את זה פשוט לבצע בשדה או מעבדה. למרות עיסוי cloacal כבר בשימוש במשך עשרות שנים, קשה ללמוד לכתוב תיאורים זמינים. פרסום זה מיועד להפחית את הזמן ואת אי הוודאות מעורב לימוד עיסוי cloacal.

הזרע שנאסף ציפורים באמצעות עיסוי cloacal שניתן להשתמש מיד תנועתיות-הערכת-^4,-⁷ או הזרעה מלאכותית⁸או קפוא לשימושים אחרים כגון הדמיה מתקדמות והפקת דנ א. דגימות זרע מציפורי שיר מ הם קטנים, אך מכיל זרע בצפיפות. ה-DNA מופק באמצעות ערכת חילוץ מסחרי עבור פשטות, עם שינויים כדי להתגבר על התכונות מגן מיוחדות של זרע⁹. לאחר החילוץ, טלומרים זרע ניתן למדוד באמצעות qPCR¹⁰.

Protocol

פרוטוקול זה כרוך נושאים בעלי חוליות, אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת המדינה של צפון דקוטה.

1. זרע מהאוסף ציפור שיר באמצעות עיסוי cloacal

הערה: עיסוי Cloacal שיטת איסוף זרע יעיל על ציפורים reproductively פעילים בלבד, אך ניתן לבצע בהצלחה מחוץ לעונת הקינון במצבים המתאימים בשבי. פעילות הרבייה צריך להיקבע עבור היעד מינים לפני באמצעות עיסוי cloacal. ניתן להשתמש בטכניקה זו על ציפורי בר על לכידת או על ציפורים מוחזק בשבי.

1. החל זכר ציפור, (גידול בתנאי) לאחיזה של סיטרה ביד האחרת, להעביר את הציפור אל היד הדומיננטית עם הצד הגחון שלו נוגע כף היד (איור 1).
   1. ודא כי הראש של העוף הקרוב קצה לרוחב של כף היד. בקלילות לאבטח ראש וגוף באמצעות פינקי, טבעת, באצבעות. זה משאיר פתח וזנב של העוף חשוף.
   2. להשאיר את הרגליים של העוף רופף או בקלילות מאופקת באמצעות כף היד.

איור 1 : גריפ עבור עיסוי cloacal. הציפור מאובטח בקלילות ביד הדומיננטית עם הצד הגחון שלו נוגע את דקל ובראש מאובטח על ידי אצבע הזרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. למקם את דומיננטי האצבע והאגודל משני צדי בסוף נעלה קלואקה וצבטתי קלות את האצבעות יחד תוך הפעלת לחץ קל מאוד לכיוון הזנב ( איור 2). קלואקה אוורט, חשיפת רירית cloacal (ורוד פנימי).
   הערה: אם הציפור לא כיום לייצר זרע, בליטה cloacal יכול להיות קטן, קלואקה, קשה, אוורט. עם ניסיון, קל להבחין בין cloacas של הזכרים reproductively פעיל, לא פעיל^5,11.

איור 2 : אצבע המיקום ואת בליטה cloacal. אוורט קלואקה על ידי הפעלת לחץ קל עד הסוף מעולה (א). ב זכר ציפורי שיר reproductively פעיל, ברור בליטה cloacal המשרד (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

3. עם היד הלא דומיננטית, במקום משטח של האצבע המורה על הצד הגבי של בסיס הזנב לייצב את היד, ולאחר מכן מקם קצה האגודל מתחת קלואקה everted.
   הערה: תמונה ממוזערת קצרה וחלקה הוא יתרון לביצוע עיסוי cloacal, מגן על הציפור מהפציעה.
4. להזיז את האגודל-הדומיננטי עמוק, cranially עם לחץ בינוני, להישאר מתחת קלואקה קרבנותיו. המשך עד גומר הציפור. תלוי הפרט, זה בדרך כלל לוקח בין קווים 1 ו מספר עשרות.
5. ברגע שהציפור גומר, לאסוף את הזרע צינור microhematocrit. חזור על עיסוי cloacal להשיג שופך מרובים.
   הערה: ציפורי שיר מ חום בהיר של זרע בדרך כלל יש עקביות עבה במקצת. חומרים בהיר או כהה הוצאת from קלואקה הן לא זרע, עשויים לזהם את דגימת הזרע. המראה של כמות קטנה של דם על קלואקה או מעורבת עם הזרע נגרמת בדרך כלל על ידי לחץ רב מדי בעיסוי.
6. להפקת DNA, מקם את הזרע לתוך צינור microcentrifuge עם µL 20 ל- x 1 PBS (pH 7.4). הערה: זרע המאוחסן ב- 1 x PBS אינו מתאים הפריה מלאכותית, אך יכול לשמש להפקת DNA במועד מאוחר יותר כאשר הוא מאוחסן ב- 80 ° C טוב, מגניב יכול להיות בטמפרטורת החדר או מקורר, אבל צריך להיות במצב נוזלי כאשר דגימת הזרע הוא מופקד.
   1. לאשר הנוכחות של הזרע בדגימה על-ידי הצגת כמות קטנה של המדגם מדולל תחת מיקרוסקופ תרכובת (איור 3).
7. לאחסן הזרע מדולל ב-80 מעלות צלזיוס עד מיצוי.

2. הפקת דנ א בזרע ציפור

הערה: פרוטוקול זה נבדק עם מספר ערכות חילוץ מסחרי של DNA, אך עברו רק מוצלח בעת שימוש ב- DNA אחד ערכת¹². צעדים שעברו שינויים בפרוטוקול ערכת מסומנים באמצעות *.

1. להכין פתרון 1 מ' של dithiothreitol (DTT) במים ולערבב באמצעות vortex.*
   1. Aliquot הפתרון DTT ואחסן אותו ב-20 ° C עד מיד לפני השימוש. כל דגימה לצורך פריסה מדחיסה דורש 10 µL של 1 מ' DTT solution.*
2. הכנת מאגר המכיל 20 מ מ טריס-קלרנית, pH 8.0; 20 מ מ EDTA; 200 מ"מ NaCL; 4% מרחביות. כל דגימה לצורך פריסה מדחיסה דורש µL 90 של buffer.* הזה
   1. אחסן את המאגר בטמפרטורת החדר. אם זה יש זירז, לחמם את זה עד 56 ° C כדי dissolve.*
3. מחממים אינקובטור המכיל של רוקר או שאכר כ- 65 ° C.*
4. מיד לפני תחילת החילוץ, מערבבים 10 פתרון DTT µL עם µL 90 המאגר מוכן בשלב 2.2 עבור כל הדגימה כדי לחלץ, למשל 900 µL מאגר בתוספת 100 µL DTT פתרון אם חילוץ 10 דוגמאות. תערובת זו ייקרא DTT-buffer.*
5. להוסיף 70 µL 1 x PBS המדגם כולו זרע מדולל, לערבב היטב באמצעות vortex.*
6. להוסיף 100 µL DTT-buffer וכדי לפתור proteinase K µL 10 המדגם. מערבולת במשך 20 שניות, ואז דגירה בחממה preheated למשך שעה על הנדנדה או shaker.*
7. להוסיף 200 µL מאגר AL ו- 200 µL EtOH טרי (100%) ו מערבולת עבור 20 seconds.*
8. להעביר את הדגימה כל עמודה ספין, centrifuge 1 דקה-g 6,000 x. להשליך את הצינור אוסף.
9. במקום העמודה על צינור חדש ולהוסיף µL הכין 500 מאגר AW1. Centrifuge 1 דקה-g 6,000 x. להשליך את הצינור אוסף.
10. במקום העמודה על צינור חדש ולהוסיף µL הכין 500 מאגר AW2. צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 6,000 x ג למחוק את זרימה דרך ומקום העמודה חזרה ברכבת התחתית.
11. Centrifuge 3 דקות ב- 20,000 g x. להשליך את הצינור אוסף ומניחים את העמודה על צינור microcentrifuge 1.5 mL.
12. Pipet 35 µL של AE מאגר ישירות על גבי קרום עמודה, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 minutes.*
13. Centrifuge 1 דקה-g 14,000 x. להשליך את העמודה ספין ולאחסן דגימות שחולצו ב-80 מעלות צלזיוס.

תוצאות

עיסוי cloacal, ה-DNA חילוץ באמצעות שהפרוטוקול המתואר בוצע מספר מינים ציפורי שיר מ, אחד columbid (טבלה 1). הנוכחות של זרע זרע הדגימות שנאספו על ידי עיסוי cloacal אושר על-ידי הצגת כמות קטנה של הדגימות מדולל תחת מיקרוסקופ מתחם בהגדלה X 400 (איור 3). לאחר חילוץ DNA דגימות...

Discussion

אנו מתארים שיטה פשוטה ואמינה איסוף זרע מעופות קטנים ובינוניים במצב פעיל reproductively, חילוץ DNA של הזרע העופות.

פרוטוקול מיצוי DNA זרע מתואר שינוי ערכה של פשטות, אבל היה מעודן לשימוש על זרע העופות. הזרע הם עמידים בפני פירוק על ידי מיצוי סטנדרטי כימיקלים^9,...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microhematocrit capillary tubes	Fisherbrand	22-362566	Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow.
Microcentrifuge tubes	Any
1x PBS	Any		Used for storing semen samples prior to DNA extraction.
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Tris base	Sigma-Aldrich	10708976001	Any supplier can be used.
EDTA	Sigma-Aldrich	1233508	Any supplier can be used.
NaCl	Sigma-Aldrich	793566	Any supplier can be used.
SDS	Sigma-Aldrich	1614363	Any supplier can be used.
QIAamp DNA micro kit	Qiagen	56304	Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us.