泄殖腔按摩与精子 DNA 分离法采集禽精

摘要

本协议描述泄殖腔按摩, 一种非侵入性的手工技术, 用于从禽类中收集精子, 以及使用商业提取试剂盒进行 DNA 提取, 并进行修改。

摘要

收集的精子可能是有用的广泛的应用, 包括研究涉及精质, 精子端粒动力学和表观遗传学。鸟类是生物学研究中广泛使用的学科, 是涉及反复精子样本研究的理想选择。然而, 对于那些希望学习如何从禽类精子中收集和提取 DNA 的人来说, 目前还没有多少资源可用。在这里, 我们描述泄殖腔按摩, 一个温和的, 非侵入性的手工技术收集禽类精子。虽然这项技术是建立在文献, 它可能是很难从可用的描述学习。我们还提供信息, 从禽精提取 DNA 的商业提取试剂盒的修改。泄殖腔按摩可以很容易地用于任何小到中型雄鸟的生殖条件。在收集后, 可以立即使用精子进行运动化验, 或在本协议所述的 DNA 提取后冷冻。这一提取协议被提炼为禽精, 并已成功地用于收集的样本从几个雀物种 (过路人幼雏, Spizella passerina, Haemorhous mexicanus, 和鸫 migratorius) 和一个 columbid (鸽)。

引言

鸟类是研究精子质量和竞争的理想科目¹, 精子端粒动力学², 遗传学的³, 和类似的主题, 因为它们广泛用于生物研究和精子可以很容易地取样使用泄殖腔按摩.泄殖腔按摩是一种温和的, 非侵入性的手工收集精子的技术, 从鸟类^4,5,6。重复样品可以很容易获得, 不需要特殊的工具, 使其易于在现场或实验室执行。虽然泄殖腔按摩已经使用了几十年, 很难从现有的书面说明。本刊物旨在减少学习泄殖腔按摩所涉及的时间和不确定因素。

从鸟类收集的精子使用泄殖腔按摩可立即用于运动评估^4,7或人工授精⁸, 或冷冻其他用途, 如高级成像和 DNA 提取。来自雀鸟的精子样本很小, 但含有浓密的精子。DNA 的提取使用一个商业提取试剂盒简单, 与修改, 以克服专门的保护功能的精子⁹。提取后, 精子端粒可以使用 qPCR¹⁰进行测量。

研究方案

该议定书涉及脊椎动物的主题, 并已批准的机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 在北达科他州立大学。

1. 使用泄殖腔按摩的雀鸟的精子收集

注: 泄殖腔按摩是一种有效的生殖活禽的精子收集技术, 但可以在适当的圈养情况下成功地在繁殖季节之外进行。在使用泄殖腔按摩之前, 应确定目标物种的生殖活动。这种技术可以用于野生鸟类捕获或圈养鸟类。

1. 从雄鸟开始, (在繁殖条件) 達的握在非主导的手, 转移鸟到支配的手与它的腹侧接触手掌 (图 1)。
   1. 确保鸟的头部离手掌的侧边最近。用小指、环和中指轻轻地保护头部和身体。这就使得鸟的排气口和尾部露出来了。
   2. 用手掌把鸟的腿松开或轻轻地克制。

图 1: 泄殖腔按摩手柄.这只鸟在占优势的手上被轻轻地固定着, 它的腹侧接触手掌, 头部被小指固定。请单击此处查看此图的较大版本.

2. 将占主导地位的食指和拇指放在泄殖腔的任一侧, 轻轻地捏住手指, 对尾部施加非常轻微的压力 (图 2)。泄殖腔将埃弗特, 露出泄殖腔粘膜 (粉红色内部)。
   注意: 如果鸟目前没有生产精子, 泄殖腔突起可以小, 泄殖腔很难埃弗特。有经验, 很容易区分 cloacas 的生殖活动和非活动的男性^5,11。

图 2: 手指位置和泄殖腔突起.埃弗特泄殖腔通过施加轻微的压力到上级端 (A)。在生殖活跃的雄性雀中, 泄殖腔突起明显且牢固 (B)。请单击此处查看此图的较大版本.

3. 用非显性手, 将食指的垫放在尾巴底部的背侧以稳定手, 然后将拇指的尖端放在外翻泄殖腔的下方。
   注意: 短而平滑的缩略图有利于进行泄殖腔按摩, 保护鸟免受意外伤害。
4. 移动非显性拇指深和 cranially 在一个重复的运动中压, 保持低于泄殖腔。继续, 直到鸟射精。根据个人, 这通常需要在1和几十个中风。
5. 鸟一射精, 就在 microhematocrit 管中收集精子。重复泄殖腔按摩以获得多射精。
   注: 雀的精子呈浅褐色, 通常有较厚的稠度。从泄殖腔中排出的白色或深色物质不是精子, 可能会污染精子样本。在泄殖腔或与精子混合时出现少量的血液, 通常是由于按摩时压力太大造成的。
6. 对于 DNA 提取, 将精子放入离心管中, 20 µL 1x PBS (pH 7.4)。注: 1x PBS 中贮存的精子不适合人工受精, 但在-80 ° c 贮存时可用于 DNA 提取。PBS 可以是室温或冷冻的, 但在储存精子样本时应处于液态状态。
   1. 通过在复合显微镜下观察少量的稀释样品 (图 3), 确认样品中是否存在精子。
7. 将稀释的精子贮存在-80 ° c 直至提取。

2. 从禽精中提取 DNA

注: 本协议已通过多个商业 dna 提取试剂盒进行了测试, 但仅在使用一个 dna 套件¹²时才成功。从套件协议中修改的步骤由 * 表示。

1. 在水中准备一个1米的糖 (德勤) 溶液, 并使用涡流混合。
   1. 分的解决方案, 并存储在-20 ° c, 直到使用前立即。每个样品要提取需要10µL 1 M 的解决方案。
2. 准备一个包含20毫米三氯的缓冲液, pH 值 8.0;20毫米 EDTA;200毫米氯化钠;和 4% SDS。要提取的每个样本需要此缓冲区的90µL。
   1. 在室温下存储缓冲区。如果它已经沉淀, 温暖它到56° c 溶化。
3. 将装有摇杆或振动筛的恒温箱预热至65° c。
4. 在开始提取之前, 在步骤2.2 中为每个抽取的样本准备10µL 的90µL 的缓冲液, 并在提取100样本时,例如900 µL 缓冲器加10µL 的解决方案。这种混合物将被称为 "数码缓冲"。
5. 添加70µL 1x PBS 到整个稀释的精子样本和混合良好使用涡流。
6. 添加100µL 的数码缓冲和10µL 蛋白酶 K 溶液的样品。漩涡20秒, 然后孵化在预热孵化器1小时的摇杆或振动筛。
7. 添加200µL 缓冲 AL 和200µL 新鲜乙醇 (100%) 和漩涡20秒。
8. 将整个样品转移到旋转柱, 离心机1分钟, 6000 x g. 丢弃收集管。
9. 将列放在新管上, 并添加500µL 准备的缓冲 AW1。离心机1分钟在 6000 x g. 丢弃收集管。
10. 将列放在新管上, 并添加500µL 准备的缓冲 AW2。离心机1分钟, 在 6000 x g. 丢弃流, 并将列放回管上。
11. 离心机3分钟在 2万 x g. 丢弃收集管, 将柱放在1.5 毫升离心管上。
12. 吸管35µL 将 AE 缓冲器直接放在柱膜上, 室温孵育5分钟。
13. 离心机1分钟在 1.4万 x g. 丢弃自旋柱, 并在-80 ° c 处储存提取的样品。

结果

泄殖腔按摩和 DNA 提取使用所描述的协议已经对几个雀物种和一个 columbid (表 1) 进行。在泄殖腔按摩收集的精子样本中, 通过在400X 放大倍数显微镜下观察少量稀释后的样品 (图 3), 证实了精的存在。从家庭麻雀收集的精子样本中提取的 dna 使用这里所描述的协议, 八样品在凝胶电泳和 dna 阶梯上运行 (三样本可以在图 4...

讨论

本文介绍了一种简单可靠的生殖活性条件下从中小鸟类采集精子的方法, 并从禽精中提取 DNA。

所描述的精子 DNA 提取协议是从一个简单的套件修改, 但被提炼为使用在禽类的精子。精子抗裂解的标准萃取化学品^9,13, 从形收集的精样本是相当小的 (通常是少数升)。这些因素提出了在65° c 的情况下使用适当浓度的德勤和孵化成功克服的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microhematocrit capillary tubes	Fisherbrand	22-362566	Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow.
Microcentrifuge tubes	Any
1x PBS	Any		Used for storing semen samples prior to DNA extraction.
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Tris base	Sigma-Aldrich	10708976001	Any supplier can be used.
EDTA	Sigma-Aldrich	1233508	Any supplier can be used.
NaCl	Sigma-Aldrich	793566	Any supplier can be used.
SDS	Sigma-Aldrich	1614363	Any supplier can be used.
QIAamp DNA micro kit	Qiagen	56304	Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us.