Vogelgrippe Samengewinnung von Blasenekstrophie Massage und Isolierung von DNA aus Spermien

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Blasenekstrophie Massage, eine nicht-invasive manuelle Technik zum Sammeln von Samen von Vögel und DNA-Extraktion aus Vogelgrippe Spermien mit einem kommerziellen Extraktion Kit mit Modifikationen.

Zusammenfassung

Sammlung des Samens möglicherweise nützlich für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Studien, die Qualität der Spermien, Sperma Telomere Dynamik und Epigenetik. Vögel sind weit verbreitete Themen in der biologischen Forschung und sind ideal für Studien mit wiederholter Spermaproben. Einige Ressourcen sind jedoch derzeit für diejenigen, die lernen, wie man sammeln und Vogelgrippe Samenzellen DNA extrahieren. Hier beschreiben wir Blasenekstrophie Massage, eine sanfte, nicht-invasive manuelle Technik zur Vogelgrippe Sperma zu sammeln. Obwohl diese Technik in der Literatur hergestellt ist, kann es schwierig, aus den verfügbaren Beschreibungen zu lernen sein. Wir bieten auch Informationen zur Extraktion von DNA aus Vogelgrippe Samen mit einem kommerziellen Extraktion Kit mit Modifikationen. Blasenekstrophie Massage kann leicht auf jede kleine bis mittlere männliche Vogel in reproduktive Zustand verwendet werden. Nach Sammlung kann das Sperma sofort für Motilität Assays verwendet oder eingefroren für DNA-Extraktion nach dem hier beschriebenen Protokoll. Diese Extraktion-Protokoll wurde für Vogelgrippe Sperma verfeinert und auf Proben von mehreren Sperlingsvögel (Passer Domesticus, Spizella Passerina Haemorhous Mexicanusund Turdus Migratorius erfolgreich eingesetzt ) und eine Columbid (Columba Livia).

Einleitung

Vögel sind ideale Motive für Studien mit Spermien-Qualität und Wettbewerb¹, Sperma Telomere Dynamik²Epigenetik³und ähnliche Themen, wie sie weit in der biologischen Forschung verbreitet sind und Spermien leicht entnommen werden können, mit Blasenekstrophie Massage. Blasenekstrophie Massage ist eine sanfte, nichtinvasive manuelle Technik zum Sammeln von Samen von Vögel^4,5,6. Wiederholte Proben können leicht erhalten werden und sind keine Spezialwerkzeuge erforderlich, so dass es einfach in das Feld oder Labor durchzuführen. Obwohl Blasenekstrophie Massage seit Jahrzehnten im Einsatz gewesen ist, ist es schwierig, aus den verfügbaren Beschreibungen geschrieben zu lernen. Diese Veröffentlichung dient zur Verringerung der Zeit und Unsicherheit Blasenekstrophie Massage lernen.

Samen gesammelt von Vögel mit Blasenekstrophie Massage kann sofort für Motilität Bewertung^4,7 oder künstliche Befruchtung⁸verwendet, oder für andere Nutzungen wie erweiterte Bildgebung und DNA-Extraktion eingefroren. Spermaproben von passerine Vögel sind klein, aber dicht gepackte Spermien enthalten. DNA wird mit einer kommerziellen Extraktion Kit für Einfachheit, mit Modifikationen, die speziellen Schutzfunktionen von Spermien⁹zu überwinden. Nach der Extraktion können Sperma Telomere mit qPCR¹⁰gemessen werden.

Protokoll

Dieses Protokoll beinhaltet vertebrate Tiere Themen und durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der North Dakota State University genehmigt wurde.

1. die Samengewinnung aus dem passerine Vogel mit Blasenekstrophie massage

Hinweis: Blasenekstrophie Massage ist eine wirksame Sperma Sammlung Technik auf nur reproduktiv aktive Vögel, aber außerhalb der Brutzeit im entsprechenden gefangen Situationen erfolgreich durchgeführt werden kann. Vermehrungstätigkeit sollte für Zielarten vor mit Blasenekstrophie Massage bestimmt werden. Diese Technik kann verwendet werden, auf Wildvögel bei der Erfassung oder Vögel in Gefangenschaft gehalten.

1. Beginnend mit einem Männchen (bei der Zucht Zustand) Bander es halt in der nichtdominanten Hand übertragen den Vogel auf die dominante Hand mit seiner ventralen Seite berühren die Handfläche (Abbildung 1).
   1. Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Vogels am nächsten der seitliche Rand der Palme ist. Kopf und Körper mit dem kleinen Finger, Ring und Mittelfinger leicht zu sichern. Dies lässt des Vogels Vent und Tail ausgesetzt.
   2. Lassen Sie den Vogel Beine lose oder leicht zurückhaltend mit der Handfläche.

Abbildung 1 : Griff für Blasenekstrophie Massage. Der Vogel ist mit seiner ventralen Seite berühren die Handfläche und Kopf gesichert durch den kleinen Finger leicht in die dominante Hand gesichert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

2. Legen Sie die dominanten Zeigefinger und Daumen auf beiden Seiten des überlegenen Ende der Kloake und auseinanderziehen Sie leicht der Finger während der Anwendung sehr leichten Druck in Richtung Heck ( Abbildung 2). Die Kloake wird evert, Freilegung der Blasenekstrophie Schleimhaut (rosa innen).
   Hinweis: Wenn der Vogel nicht produziert derzeit Sperma, Blasenekstrophie Protuberanz kann klein sein und die Kloake ist schwierig, evert. Mit Erfahrung ist es leicht zu unterscheiden zwischen den Cloacas reproduktiv aktive und inaktive Männchen^5,11.

Abbildung 2 : Finger Position und Blasenekstrophie Protuberanz. Evert der Kloake durch leichten Druck auf die überlegene Ende (A). In einem reproduktiv aktiven männlichen Botaniker Blasenekstrophie Protuberanz ist offensichtlich und Firma (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

3. Legen Sie mit der nichtdominanten Hand das Pad des Zeigefingers an der dorsalen Seite der Schwanzwurzel, die Hand zu stabilisieren, und platzieren Sie die Spitze des Daumens direkt unter der ausladenden Kloake.
   Hinweis: Kurze und glatte Miniaturansicht ist vorteilhaft für die Durchführung von Blasenekstrophie Massage und den Vogel vor Verletzungen schützt.
4. Den nicht-dominanten Daumen tief und cranially in eine sich ständig wiederholende Bewegungen mit mittlerem Druck, bleiben unterhalb der Kloake zu bewegen. Fortgesetzt, bis der Vogel ejakuliert. Abhängig von der Einzelperson geschieht dies in der Regel zwischen 1 und mehreren Dutzend Schläge.
5. Sobald der Vogel ejakuliert, sammeln Sie das Sperma in einem Microhematocrit Rohr. Wiederholen Sie bei Massage um mehrere ejakuliert zu erhalten.
   Hinweis: Sperlingsvögel Samen ist hellbraun und hat in der Regel eine etwas dicke Konsistenz. Weiße oder dunkle Stoffe aus der Kloake ausgeworfen nicht Sperma, und können die Samenprobe kontaminieren. Das Aussehen einer kleinen Menge von Blut auf der Kloake oder gemischt in mit das Sperma wird in der Regel verursacht durch zuviel Druck während der Massage.
6. Legen Sie für DNA-Extraktion das Sperma in einem Microcentrifuge Schlauch mit 20 µL 1 X PBS (pH 7,4). Hinweis: Samen mit 1 X PBS-Puffer gespeichert ist nicht geeignet für künstliche Befruchtung, aber kann für DNA-Extraktion zu einem späteren Zeitpunkt verwendet werden wenn bei-80 ° c gelagert Die PBS ist Raumtemperatur oder gekühlt, aber sollte in einem flüssigen Zustand sein, wenn die Samenprobe hinterlegt ist.
   1. Bestätigen Sie das Vorhandensein von Samenzellen in der Probe, indem Sie anzeigen eine kleine Menge der verdünnten Probe unter dem Mikroskop Compound (Abbildung 3).
7. Bis zur Extraktion lagern Sie der Samenlösung bei-80 ° C.

(2) Extraktion von DNA aus Vogel-Samen

Hinweis: Dieses Protokoll wurde mit mehreren kommerziellen DNA Extraktion Kits getestet, aber es wurde nur erfolgreich, wenn Sie mit einem DNA-Kit¹²verwendet. Schritte, die geändert werden aus dem Kit-Protokoll sind gekennzeichnet durch *.

1. Bereiten Sie eine 1 M Lösung von Dithiothreitol (DTT) in Wasser und mischen mit einem vortex.*
   1. Aliquoten die DVB-t-Lösung und bei-20 ° C bis unmittelbar vor der Anwendung zu speichern. Jede Probe extrahiert werden erfordert 10 µL 1 M DVB-t-solution.*
2. Bereiten Sie einen Puffer mit 20 mM Tris-Cl, pH 8.0; 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; und 4 % SDS. Jede Probe extrahiert werden erfordert 90 µL von diesem buffer.*
   1. Lagern Sie den Puffer bei Raumtemperatur. Wenn es ausgefällt hat, warm es auf 56 ° C zu dissolve.*
3. Heizen Sie einen Inkubator mit einer Wippe oder Shaker auf 65 ° C.*
4. Unmittelbar vor Beginn der Extraktion, mix 10 µL DVB-t-Lösung mit 90 µL des Puffers in Schritt 2.2 für jede Probe extrahiert werden, z. B. 900 µL Puffer plus 100 µL DVB-t-Lösung bereit, wenn 10 Proben zu extrahieren. Diese Mischung wird DVB-t-buffer.* aufgerufen werden
5. Die gesamte verdünnte Samenprobe 70 µL 1 X PBS hinzu und mischen Sie gut mit einer vortex.*
6. Hinzufügen von 100 µL DTT-Puffer und 10 µL Proteinase K-Lösung zur Probe. Wirbel für 20 Sekunden, dann brüten in den vorgewärmten Brutkasten für 1 Stunde auf einer Wippe oder shaker.*
7. Fügen Sie 200 µL Puffer AL und 200 µL frische EtOH (100 %) und Vortex für 20 seconds.*
8. Übertragen Sie das gesamte Sample auf einer Spin-Spalte und Zentrifugieren Sie 1 Minute bei 6.000 x g. verwerfen das Sammelröhrchen.
9. Legen Sie die Spalte auf einen neuen Schlauch und fügen Sie 500 µL vorbereitet Buffer AW1 hinzu. Zentrifugieren Sie 1 Minute bei 6.000 x g. verwerfen das Sammelröhrchen.
10. Legen Sie die Spalte auf einen neuen Schlauch und 500 µL vorbereitet Puffer AW2. Zentrifuge für 1 Minute bei 6.000 x g. verwerfen durchströmte und die Spalte mit der u-Bahn zurück.
11. Zentrifugieren Sie 3 Minuten bei 20.000 x g. verwerfen das Sammelröhrchen und setzen Sie die Säule an einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
12. Pipettieren 35 µL AE-Puffer direkt auf die Spalte Membran und in 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren
13. Zentrifugieren Sie 1 Minute bei 14.000 x g. verwerfen die Spin-Spalte und speichern Sie entnommene Proben bei-80 ° C.

Ergebnisse

Blasenekstrophie Massage und DNA-Extraktion verwenden, die das beschriebene Protokoll für mehrere Sperlingsvögel Arten und eine Columbid (Tabelle 1) ausgeführt wurde. Das Vorhandensein von Samenzellen im Spermaproben von Blasenekstrophie Massage wurde bestätigt, indem Sie anzeigen eine kleine Menge der verdünnten Proben unter dem Mikroskop Verbindung bei 400 X Vergrößerung (Abbildung 3). Nach Extraktion von DNA aus Spermaproben von Hau...

Diskussion

Wir beschreiben eine einfache und zuverlässige Methode für das Sammeln von Samen von kleinen und mittleren Vögel in reproduktiv aktiven Zustand und Extrahieren von DNA aus Vogelgrippe Sperma.

Die beschriebenen Samen DNA Extraktion Protokoll ist aus einem Bausatz für Einfachheit geändert, aber wurde für den Einsatz auf Vogelgrippe Sperma veredelt. Spermien sind resistent gegen lyse von standard-Extraktion Chemikalien^9,13, und Sper...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microhematocrit capillary tubes	Fisherbrand	22-362566	Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow.
Microcentrifuge tubes	Any
1x PBS	Any		Used for storing semen samples prior to DNA extraction.
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Tris base	Sigma-Aldrich	10708976001	Any supplier can be used.
EDTA	Sigma-Aldrich	1233508	Any supplier can be used.
NaCl	Sigma-Aldrich	793566	Any supplier can be used.
SDS	Sigma-Aldrich	1614363	Any supplier can be used.
QIAamp DNA micro kit	Qiagen	56304	Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us.