تحديد "قوتها النسبية" من مكافحة-تنف [مونوكلونل] جسم (ماب) قبل Neutralizing تنف استخدام أسلوب بيواناليتيكال في المختبر

Summary

بروتوكول لتحديد نشاط apoptotic مكافحة النسبي ماب TNFα مكافحة استخدام إليه إبطال مع خلايا WEHI 164 يرد هنا. هذا البروتوكول مفيدة لمقارنة قوة الأبطال من جزيئات مختلفة مع نفس الوظيفة البيولوجية.

Abstract

هذا البروتوكول يظهر قياس تحييد نشاط apoptotic TNFα في نموذج خلية تنتجها الخلايا الليفية ماوس (WEHI 164) ماب TNFα المناهضة استخدام. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم الجزيئات المضادة-TNFα الأخرى، مثل البروتينات الانصهار. نموذج الخلوية المستخدمة هنا حساس للمبرمج بوساطة TNFα عندما فعل عامل ضغط إضافي في خلية ثقافة الظروف (مثل مصل الحرمان). ويمثل هذا الإجراء كيفية تنفيذ هذا الفحص التحليلي، تسليط الضوء على العمليات الرئيسية المتصلة بإعداد عينة وتمييع الخلية، المبرمج التعريفي، والقياسات سبيكتروفوتوميتريك ذات الأهمية الحاسمة لضمان تحقيق نتائج ناجحة. ويكشف هذا البروتوكول، أداء أفضل الشروط المتعلقة بتحريض المبرمج وكفاءة إشارة تسجيل، مما يؤدي إلى عدم اليقين انخفاض قيم.

Introduction

الفاعلية البيولوجية هو مقياس كمي للنشاط البيولوجي استناداً إلى سمات المنتج جزيئي مرتبطة بالخصائص البيولوجية ذات الصلة، بينما الكمية (معبراً عنها بالكتلة) مقياس الفيزيائية لمحتوى البروتين. يتم إجراء الاختبارات فاعلية، جنبا إلى جنب مع منهجيات تحليلية أخرى، كجزء من المنتج المطابقة، والاستقرار، والدراسات المقارنة. وبهذا المعني، تستخدم القياسات فاعلية لإثبات استيفاء دفعات المنتج السمات النوعية الحرجة (كقاس) أو معايير القبول خلال جميع مراحل من التجارب السريرية، وبعد الحصول على موافقة السوق.

المبرمج موت الخلايا المبرمج، وتحدث بشكل طبيعي عندما الخلايا مصابة بفيروس، أو عندما يتم أكد الخلايا البيئية عاملاً أن التنازلات الخلوية البقاء والدالة^1،2. بين أمور أخرى، تثبيط المبرمج، أو تحييد البيولوجية، إحدى الآليات العلاجية المعروفة أساسا من مابس، لا سيما في علاج الأمراض المزمنة مثل أمراض التهاب المناعي بوساطة. تمارس الجزيئات المضادة-TNFα خصائصها العلاجية بحجب تفاعل عامل نخر الورم ألفا (TNFα) مع p55 و p75 خلية المستقبلات السطحية³، وبالتالي منع مسارات إشارة تؤدي أخيرا إلى المبرمج الخلوي.

يمكن أن تنتج TNFα التهاب في بعض الأمراض المزمنة⁴. ويفرز TNFα أيامهم في الوسط خارج الخلية بواسطة الضامة، التي هي الحراس من نظام المناعة الفطرية، والجهات الفاعلة الرئيسية في هذا النوع من المرض⁵. كمسار مشترك، TNFα رفع القيود المقترنة مع الآلية المرضية لهذه الأمراض. دون مراقبة وفي إطار الحث المستمر والإجهاد الخلية، يستحث TNFα خلية انحطاط الموت والأنسجة، يؤدي في النهاية إلى التهاب المفاصل، وداء كرون، و الملامح المرضية الأخرى⁶.

قد استخدمت تنف الخصوم التي تمنع التفاعل بين تنف ولها مستقبلات متزايدة كعلاج فعال للحد من الأعراض وتعيق تطور هذه الأمراض. في الوقت الحاضر، TNFα مكافحة المخدرات المنتجات تستخدم على نطاق واسع التحكم بتركيز الجهازية سيتوكين هذا، وبالتالي منع المزيد من تدهور الأنسجة المعنية. وبهذا المعني، يتحتم توفير الحشري استنساخه وقوية لوصف قدرة محددة من المخدرات لتحقيق التأثير البيولوجي.

في هذا البروتوكول، الحرجة خطوات تم تحديدها من خلال تطوير مقايسة الأبطال-لقياس الفاعلية البيولوجية الناجحة هي أبرز، مع تركيز بشكل خاص على المهارات اللازمة لتنفيذ الأسلوب الحيوي التحليلية. يوفر هذا الأسلوب الحيوي التحليلية معلومات مفيدة القابلية للمقارنة بين دفعات مختلفة أو مكافحة-TNFα المنتجات الدوائية بالمقارنة مع مادة مرجعية تم اختبارها سريرياً.

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام والحلول

1. إعداد متوسطة الثقافة: 1640 RPMI مع 10% FBS، درجة الحموضة 7.4.
2. تحضير المقايسة الثقافة المتوسطة: 1640 RPMI دون الأحمر الفينول ولكن مع 1% FBS، درجة الحموضة 7.4.
3. إعداد خلية يغسل الحل: الحل ملغ وخالية من كاليفورنيا دببس مع 0.02% يدتا، درجة الحموضة 7.4.
4. تعد الخلية المفرزة الحل: التربسين 0.125 في المائة مع 1 مم يدتا.
   1. ذوبان الجليد 100 مل حل 0.25% يدتا التربسين ونقل إلى قارورة 500 مل معقمة.
   2. ميكس مع 100 مل خلية يغسل الحل والاستغناء عن مختبرين 15 مل في أنابيب معقمة 15 مل. مخزن في-70 إلى-80 درجة مئوية حتى استخدام.
   3. تصفية هذه الحلول من خلال غشاء 0.22 ميكرومتر والحارة يصل إلى 37 درجة مئوية لمالا يقل عن 30 دقيقة قبل استخدامها.
5. إعداد المبرمج-التعريفي الأسهم الحل TNFα في 3.3 ميكروغرام/ملليلتر-
   1. حل 20 ميكروغرام من TNFα مع 500 ميليلتر لتصفية تعقيم المياه في الحاويات الأولية والمزيج حتى حل كامل-
   نقل في أنبوب عقيم 15 مل
   2. وإضافة 5.5 مل دببس مغ وخالية من كاليفورنيا إلى حل لهذا الأنبوب. المزيج بلطف باستخدام خلاط دوامة.
   3. قاسمة الحل إلى 70 ميليلتر أجزاء. الاستغناء عن كل قاسمة إلى 0.5 مل microtubes ومخزن في-80 درجة مئوية.
6. إعداد المبرمج حل التعريفي: حل TNFα في 40 نانوغرام/مليلتر.
   1. ذوبان الجليد قاسمة الحل الأسهم التعريفي المبرمج، تفرخ في حمام مائي في ˚C 25 للحد الأدنى 10
   2. إضعاف التعريفي المبرمج حل الأسهم 40 نانوغرام/مل بإضافة ميليلتر 61 3.3 ميكروغرام/مل TNFα حل لمل 4.939 للمقايسة الثقافة المتوسطة في أنبوب عقيم 15 مل.
   3. مزيج من دوامة خلاط 10 s؛ وهذا الحل يجب أن يكون مستعدا طازجة قبل الاستخدام.
   4. الاحماء الحل إلى 37 درجة مئوية لمالا يقل عن 30 دقيقة قبل استخدامها في التحليل انيوتراليزيشن ال-
7. إعداد الحل الركيزة: caspase 3/7 Glo الحل ^{7 ، 8}-
   1. ذوبان الجليد الحل المخزن المؤقت كاسباسي (المخزن المؤقت Glo كاسباسي 3/7) ح 12 قبل الاستخدام.
   2. تمكنك من حل المخزن المؤقت كاسباسي والركيزة (الركيزة Glo كاسباسي 3/7) الجلوس بشكل منفصل في 25 ± 5 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الاختلاط.
   3. نقل 10 مل الحل المخزن المؤقت caspase قنينة الركيزة ومزيج من انعكاس.
   4. تبقى في 25 ± 5 درجات مئوية، محمية بالضوء حتى استخدام.
      ملاحظة: الحل مستقر ح 6 في درجة حرارة الغرفة-

2. خلية كولتورينج والعد

1. ذوبان الخلية وثقافة فرعية الأولى.
   1. إزالة قنينة واحدة مع WEHI 164 الخلايا ⁹ من ثلاجة في-80 ˚C ونقلها إلى حمام الثلج.
   2. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً مع 1 مل من قبل حرارة ثقافة متوسطة حتى ذوبان الجليد تماما الخلايا المجمدة.
   3. الاستغناء عن 9 مل من قبل حرارة متوسطة الثقافة على أنبوب عقيم 15 مل.
   4. نقل تعليق خلية في أنبوب عقيم 15 مل وتخلط بلطف من خمس مرات بانعكاس.
   5. الطرد المركزي من تعليق خلية في 125 x ز للحد الأدنى 3 تجاهل المادة طافية وتصنيف بيليه الخلية.
   إضافة
   6. 5 مل من الثقافة المتوسطة للأنبوب. مزيج حتى يتم تماما حراكه الخلايا.
   7. لعد الخلايا، نقل 50 ميليلتر من تعليق خلية إلى 500 ميليلتر microtube وخلط مع 50 ميليلتر من 0.4% تريبان الأزرق. عد الخلايا وضبط إلى 0.5 × 10 ⁶ خلايا/مل. راجع الخطوة 2-2، أدناه-
   8. إضافة 13 مل من قبل حرارة الثقافة المتوسطة إلى قارورة ثقافة الخليوي 75 مل.
   9. الاستغناء عن حجم تعليق الخلية ما يكفي من الخطوة 2.1.6 لتحقيق 0.5 × 10 ⁶ خلايا/مل في قارورة ثقافة الخليوي واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO ₂ بين عشية وضحاها.
2. خلية العد.
   ملاحظة: انظر المرجع ¹⁰.
   1. باستخدام الحل من الخطوة 2.1.6، نقل 0.05 مل هيموسيتوميتير وتحديد كثافة الخلية تحت مجهر استخدام الاستبعاد تريبان الأزرق-
   2. تقدير العدد الكلي للخلايا وخلايا قابلة للحياة-
   3. ضبط تعليق خلية إلى 0.5 × 10 ⁶ خلايا/مل.
      معادلة 1
      V _{الثقافة المتوسطة} (mL) =
      V _{الثقافة المتوسطة} (mL) = (5 مل-V _{تعليق خلية})
      V _{الثقافة المتوسطة} (mL) = حجم المعدل WEHI 164 خلية تعليق
      NVC = عدد مجدية WEHI 164 خلايا/مل
      الخامس _{الثقافة المتوسطة} (mL) = المقايسة الثقافة المتوسطة الحجم إضافة إلى تعليق خلية لتحقيق 0.5 × 10 ⁶ خلايا/مل
      0.5 × 10 ⁶ = كثافة الخلية المستهدفة
3. الخلية المفرزة وفرعية الثاني والثالث.
   ملاحظة: يمكن استخدام نظام الشفط لإزالة الحلول من قوارير. ويمكن استخدام الماصات معقمة تستعمل لمرة واحدة أو الزجاج. إذا كان يحتوي الماصة تسد القطن أعلى، يجب إزالته قبل الاستخدام.
   1. إزالة المتوسطة الثقافة من زراعة الخلايا T-قارورة استخدام 1 مل ماصة معقمة وفراغ.
   الحل
   2. مل 5 الاستغناء عن الغسيل الخلية في الثقافة تي-قارورة، تخلط بلطف، وتجاهل الحل. كرر هذه الخطوة مرتين-
      ملاحظة: الإزالة الكاملة للمتوسط الثقافة حاسمة بالنسبة لكفاءة الخلية المفرزة.
   3. إضافة 15 مل من محلول مفرزة خلية T-قارورة واسمحوا الوقوف لمدة 3 دقائق في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO ₂-
   4. التحقق من عدم وجود خلايا المرفقة في قارورة الجدار الداخلي تحت المجهر. إزالة الخلايا من ثقافة تي-قارورة استخدام ماصة معقمة من 20 مل والاستغناء عن لهم في أنبوب 50 مل معقمة.
   5. الطرد المركزي من تعليق خلية في 125 x ز للحد الأدنى 3 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع آخر 5 مل من مستنبت.
   6. عد الخلايا، وإضافة المتوسطة الثقافة ما يكفي للوصول إلى تركيز الخلايا المطلوب وفقا المعادلة 1-
   7. إضافة هذا التعليق إلى 72 سم ² ر-قارورة واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO ₂-
   8. ثقافة فرعية الخلايا مرتين على الأقل قبل استخدامها في التحييد الاعتداء. كرر الخطوات 2.3.1-2.3.8 لليومين المقبلين-
4. الاعتداء تعليق خلية. ثقافة فرعية
   1. حدد 164 WEHI يحتوي على مسارات ثلاثة على الأقل. راجع الخطوة 2، 1-
   2. فصل وحساب الخلايا وفقا للخطوات 2-2 و 2-3 من هذا البروتوكول.
   3. تمييع تعليق خلية وفقا المعادلة 1 إلى 0.5 × 10 ⁶ خلايا/مل.
   4. استخدام هذا التعليق الخلوية للمقايسة الأبطال. خلط كل تعليق خلية دوامة خلاط قبل استخدام.

3. إعداد الأجسام المضادة وتخفيف

1. كوانتيتيشن مابس-
   1. تحديد تركيز المواد المرجعية ونموذج عنصر تحكم نموذج تحليلي من خلال امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر باستخدام معامل (1.39) انقراض جماعي على ¹¹-
      ملاحظة: يمكن أن تؤخذ تركيزات الأصلي من المخدرات المنتج التسميات. ومع ذلك، يجب التحقق من ذلك بامتصاص الأشعة فوق البنفسجية-
2. تخفيف ماب-
   1. ديلوت جميع العينات بشكل مستقل في ثلاث نسخ، مع حل مغ وخالية من كاليفورنيا دببس في microtubes 2 مل، وصولاً إلى 2 ملغ/مل. تأكيد هذا التركز بامتصاص الأشعة فوق البنفسجية في ثلاث نسخ، باستخدام حل خالية من كاليفورنيا وملغ دببس الفارغة.
   2. ميكس الحلول البروتين المخزون 5 s باستخدام خلاط دوامة.
   3. ميليلتر 100 تمييع كل حل ماب 2 مغ/مل مع 0.9 مل المتوسط الثقافة المقايسة.
   S
   4. المزيج ل 5 من دوامة خلاط.
      ملاحظة: هذه الحلول لها بتركيز 200 ميكروغرام/مل. ويجب أن يتم تخفيف لكل ثلاث نسخ.
   5. تمييع 10 آند #181؛ L لكل حل ماب 200 ميكروغرام/مل مع مل 0.99 المتوسط الثقافة المقايسة. مزيج 5 s باستخدام خلاط دوامة. هذه الحلول لها بتركيز 2 ميكروغرام/مل. إجراء تخفيف المسلسل لكل ثلاث نسخ قبل استخدامها في التحليل تحييد.
   جعل
   6. المضادة-TNFα تخفيف ماب في ثلاثة ميكروبلاتيس المستقلة. جعل نسخة مكررة من كل ثلاث نسخ مستقلة والاستغناء عن لهم في صفيحة واحدة، كما هو مبين في الجدول 1. مرجع مضمون < الجدول fo:keep-together.within-الصفحة = fo:keep "1"-مع-next.within-صفحة = "دائماً" fo:text-محاذاة = "توسيط" > 1 لوحة لوحة 2 لوحة 3 الآبار عينة الآبار عينة الآبار عينة B2:B11 مادة مرجعية B2:B11 B2:B11 نموذج عنصر تحكم نموذج تحليلي C2:C11 C2:C11 C2:C11 D2:D11 نموذج تحليلي D2:D11 مادة مرجعية D2:D11 نموذج عنصر تحكم E2:E11 E2:E11 E2:E11 F2:F11 نموذج عنصر تحكم F2:F11 عينة تحليلية F2:F11 مادة مرجعية G2:G11 G2:G11 G2:G11 1 الجدول: صفائف عينة ميكروسكوبية. يجب تشغيل مقايسة تحييد كاملة في ميكروبلاتيس الثلاثة ضمن إحداثيات B2 إلى G11. عشوائي الاستغناء عن الإشارة، تحليلية، وعينات مراقبة السماح للباحثين للتحقق من أي تحيز في المقايسة.
   7. إجراء تخفيف ماب كل مرجع، عينة، أو التحكم، كما هو مبين في الجدول 2-
      ملاحظة: لا يتم تركيزات ماب TNFα المضادة الموضحة في هذا الجدول التركيزات النهائية في مقايسة الأبطال. < td > 250

      عمود لوحة	"حجم المقايسة" الثقافة المتوسطة (ميكروليتر)	حجم مادة مرجعية، ونموذج تحليلي أو عنصر تحكم عينة (uL)	تركيز في "لوحة الفحص" (نانوغرام/مل)
      2	0	230	2000
      3	150	150 من السطر 2	1000
      4	75	75 من سطر 3	500
      5	100	50 من سطر 3	333
      6	75	75 من سطر 4
      7	75	75 من سطر 5	166
      8	75	75 من خط 6	125
      9	75	75 جيئة وذهابا خط م 7	83
      10	75	75 من الخط 9	41
      11	150	75 من خط 10	13

      تي 2 قادرة على: تخفيف ماب المضادة-TNFα. تخفيف المسلسل لمكافحة--TNFα مابس وأظهرت في هذا الجدول. تركيزات النهائية المبينة في هذا الجدول لا التركيزات في التحليل، حيث كانت مخففة المضادة-TNFα مابس بمعامل 3 (تمييع ماب + المتوسطة الثقافة تعليق الخلايا). تمثل الخطوط بخط غامق تخفيف قادمة من البنود 3، 5، 7، 9 و 10؛ تمثل الخطوط غير الغامق التخفيف من البنود 3 و 4 و 6. وتتم هذه تخفيف المسلسل فقط قبل إجراء الفحص تحييد. ويجب الحرص على مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً ثلاث مرات قبل صرفها تخفيف.
   8. الحفاظ اللوحات في 25 ± 5 درجات مئوية حتى استخدام.

4. تحييد الإنزيم مع خلايا 164 WEHI

1. مزيج من فورتيكسينج كل خلية المعلقات (0.5 × 10 ⁶ خلايا/مل) قبل صرفها في أي خطوة من هذا البروتوكول.
   ملاحظة: في هذا القسم، الحارة كل حل إلى 37 درجة مئوية و 30 دقيقة قبل استخدام.
2. نقل 50 ميليلتر من تعليق خلية لكل من الآبار 60 من ميكروبلاتيس، الانتقال من العمود 2 إلى 11 وخط ب غ.
تخفيف
3. نقل 50 ميليلتر ماب وعينه، والتحكم في ميكروبلاتيس. وتتبع النمط هو مبين في الشكل 1.
4. إضافة 50 ميليلتر من الحل التعريفي المبرمج لكل بئر.
5. ضوابط استخدام الهاتف الخلوي من 50 ميليلتر من WEHI 164 الخلايا، في ثلاثة آبار. إحضار كل بئر لوحدة تخزين نهائي من 150 ميليلتر مع المقايسة الثقافة المتوسطة.
6. استخدام عنصر تحكم سيتوتوكسيسيتي من خليط من 50 ميليلتر من الخلايا WEHI 164 زائد 50 ميليلتر من المبرمج التعريفي الحل. إحضار كل بئر لوحدة تخزين نهائي من 150 ميليلتر مع المقايسة الثقافة المتوسطة.
7. السيطرة على TNFα، استخدم 50 ميليلتر من الحل التعريفي المبرمج واحضاره إلى 150 ميليلتر مع المتوسط الثقافة المقايسة.
8. للفراغ، استخدم 150 ميليلتر المتوسط الثقافة المقايسة وحدها.
9. ملء الآبار المتبقية مع 150 ميليلتر من مستنبت لتجنب آثار تبخر لوحة.
4.1.1-4.1.9
10. تكرار الخطوات مرتين في اثنين آخرين ميكروبلاتيس.
    ملاحظة: ماب وتركيزات نهائية في الميكروسكوبية هي: 0.666، 0.333، 0.167، 0.111، 0.083، 0.056، 0.042، 0.028، 0,014، و 0.004 ميكروغرام/ملليلتر-
11. تحميل العينات في ميكروبلاتيس، كما هو مبين في الشكل 1.
    
    رقم 1: التخلص عينات في لوحات المقايسة. B1 إلى G11 إحداثيات جيدا في ميكروبلاتيس وتصف المواقف التي يوضع فيها تخفيف العينة. إحداثيات المفقودين آبار مليئة بالضوابط والمقايسة الثقافة المتوسطة (A1-A12 و H1-H12). ويساعد هذا التوزيع العشوائي من عينات (تخفيف الأمامية والعكسية في ميكروبلاتيس) للقضاء على التحيز في النتائج بسبب التبخر متوسطة أو متغيرات أخرى. فمن الأفضل أن كل الميكروسكوبية يقوم به محلل واحد في وقت واحد. R: مرجع, s: عينة، CS: عنصر تحكم نموذج، ديل: التخفيف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
12. احتضان ثلاث لوحات في 37 درجة مئوية و 5% CO ₂ ل 16 ± 2 حاء
13. اسمحوا الوقوف عند 25 ± 5 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل استخدام الكاشف Glo كاسباسي 3/7-
14. إضافة 100 ميليلتر من هذا الكاشف لجميع الآبار، بما في ذلك النماذج وعناصر التحكم.
15. يهز لوحات استخدام خلاط دوامة ميكروسكوبية لمدة 3 دقائق في 25 ± 5 درجات مئوية مباشرة بعد الاستغناء عن إلى الآبار.
16. احتضان اللوحات ل 2.5 ± 0.5 ح في 25 ± 5 درجة مئوية، ومحمية من الضوء.
17. إدراج هيئة التصنيع العسكريروبلاتيس إلى لومينوميتير وإكمال المقطع التالي-

5. تحليل نتائج

1. باستخدام برمجيات للكشف عن التﻷلؤ، حدد الدالة الوضع ونقطة النهاية التﻷلؤ.
2. تحديد واضح 96-جيدا-قاع اللوحة وآبارها الداخلية 80، باستثناء الأعمدة 1 و 12-
3. حدد وقت تكامل 1,250 مرض التصلب العصبي المتعدد و 10 ق لخلط الميكروسكوبية قبل القراءة.
4. تحديد الآبار حيث سيتم وضع المواد المرجعية والمضمون التحليلي ونموذج عنصر تحكم وتحديد تركزاتها المقابلة.
5. قراءة العينات التي توضع في ميكروبلاتيس لومينوميتير-
6. استخدام معادلة معلمة الرابع بإجراء تحليلات للنتائج. رسم منحنى استجابة لجرعة، كما هو مبين في الشكل 2-
   
   رقم 2: منحنى الاستجابة للجرعة. ويرد المضادة-TNFα ماب تركيز مقابل التﻷلؤ (بقاء الخلية). واستخدمت كنموذج معادلة معلمة الرابع بوصف حماية مكافحة-TNFα مابس. EC50 هو تركيز الإنسان والمحيط الحيوي الذي يمكن تحييد مبلغ TNFα التي تتسبب في موت الخلايا 50% في كل فحص، يتمثل ذلك في الرسم البياني كالتغيير في المنحدر. أشرطة وصف الانحراف المعياري التﻷلؤ لكل تركيز الإنسان والمحيط الحيوي. x يمثل تركيز Ab المضادة-TNFα وهو يصور على أنه دالة لوغاريتمية في نانوغرام/ملليلتر، بينما تمثل y الاستجابة التﻷلؤ في وحدات التعسفي التﻷلؤ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
   ملاحظة: في معادلة المعلمة الرابع، ج هو التركيز الفعال 50 (EC50). سيتم استخدام هذه القيمة مقارنة مادة مرجعية، ونموذج تحليلي، ونموذج عنصر تحكم عن طريق الدالة المستجيب.
7. لحساب مقايسات النسبي، إصلاح مضمون الإشارة إلى 100% وحساب مقايسات العينة والسيطرة عليه.
   ملاحظة: هذه القيم ويرد في الشكل 3-
   
   رقم 3: المعادلات الرياضية المستخدمة لحساب في EC50s وقيمها. EC50 القيم، أو معلمات ج، بعدم اليقين ما وصفت الخطأ القياسي. كما هو مبين من EC50s مقارنة بين نتائج العينة ومرجع لقوتها النسبية. يتم حساب فاصل الثقة مع α = 0.05. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

الرسم البياني في الاستجابة للجرعة (مع عناصر التحكم)
يمثل الشكل 1 الاستجابة التﻷلؤ مقابل تركيز الإنسان والمحيط الحيوي. تجسد هذه الدالة سيجمويدال caspase 3 و 7 الإفراج عنه في مستنبت المقايسة بسبب تحلل الخلية. موت الخلية تتعزز بالمجاعة المصل بالإضافة...

Discussion

وهذا الوصف تساعد على تحديد بداهة السلوك البيولوجي لجزيء تحت التطوير قبل أن تجري التجارب السريرية مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً. كما أنها مفيدة للإفراج عن دفعة لدفعة لمنتج المخدرات الموافق عليها. تجدر الإشارة إلى أن هذه الاختبارات مفيدة لتحديد ما إذا كان جزيء له تأثير بيولوجية ملائمة بش...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
WEHI 164	ATCC	CRL-1751	Fibrosarcoma cells from Mus musculus
RPMI-1640 Medium	ATCC	30-2001	Store medium at 2 °C to 8 °C
RPMI 1640 Medium, no phenol red	GIBCO	11835-030	Store medium at 2 °C to 8 °C
Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red	GIBCO	25200-056	Store medium at -10 °C to -20 °C
DPBS, no calcium, no magnesium	GIBCO	14190-136	Store medium at 2 °C to 8 °C
Recombinant Human TNF-alpha Protein	R&D Systems	210-TA-020	Store at -20 °C to -70 °C
Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG	HyClone	SH3089803	Store at -10 °C to -20 °C
Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	HyClone	SH3007103	Store at -10 °C to -20 °C
Caspase-Glo 3/7 Assay kit	Promega	G8093	Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent	J.T.Baker	8993-01	--
Sample mAb Adalimumab	Probiomed	NA	Final concentrations in the microplate are:  0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL
Reference and Control mAb Adalimumab	Abbvie	NA	Final concentrations in the microplate are:  0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL
Microplate Reader	Molecular Devices	89429-536	SpectraMax M3 Multi-Mode
Microplate reader Software	Molecular Devices	--	SoftMax Pro 6.3 GxP
Incubator	Revco	30482	Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2
Laminar Flow Hood	The Baker Company	200256	Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2