상대적인 힘의 안티-TNF 단 클론 항 체 (mAb) 중화 방 청 TNF는 시험관에서 생물 메서드를 사용 하 여의 결정

요약

프로토콜 WEHI 164 셀 중립화 메커니즘을 사용 하는 안티-TNFα mAb의 상대 안티-apoptotic 활동의 결정에 대 한 여기에 제공 됩니다. 이 프로토콜은 같은 생물 학적 기능을 가진 다른 분자의 중립화 강도 비교 하는 데 유용.

초록

이 프로토콜 안티 TNFα mAb를 사용 하 여 마우스 fibroblast 세포 모델 (WEHI 164)에서 TNFα의 apoptotic 활동 중립화의 측정을 보여줍니다. 또한,이 프로토콜 융해 단백질 등 다른 안티 TNFα 분자를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 여기 고용 셀룰러 모델 TNFα 중재 된 apoptosis에 민감한 때 추가 스트레스 요소가 셀 문화 조건 (예: 혈 부족)에서 유도 된다. 이 절차 실행이 분석 분석 결과, 샘플 준비, 셀 희석, apoptosis 유도, 성공적인 결과 보장 하기 위해 중요 한 spectrophotometric 측정에 관련 된 주요 작업을 강조 표시 하는 방법을 예로 보여주. 이 프로토콜 apoptosis 유도 및 효율적인 신호 기록, 낮은 불확실성 값을 선도 하는 최고 성능 조건을 보여준다.

서문

생물 학적 힘 수량 (대량 표현)는 단백질 함량의 물리 화학적 측정 관련 생물 속성에 연결 된 분석 제품 특성에 따라 생물 학적 활동의 양적 척도 이다. 다른 분석 방법론을 함께 힘 테스트 제품 적합성, 안정성, 및 comparability 연구의 일부로 수행 됩니다. 이런이 의미에서 힘 측정 제품 배치에 맞는지 중요 한 품질 특성 (CQAs) 또는 승인 기준 및 시장 승인 후 임상 시험의 모든 단계를 설명 하는 데 사용 됩니다.

Apoptosis는 프로그램된 한 세포 죽음, 그 타협 세포 생존 능력 및 기능^1,2요소 바이러스 또는 세포는 환경에 의해 스트레스 세포 감염 때 자연스럽 게 발생. 다른 가운데, apoptosis 억제, 또는 생물 학적 중화 면역 중재 염증 성 질환 등 만성 질환의 치료에 특히 mAbs의 주로 알려진된 치료 메커니즘 중 하나입니다. 안티 TNFα 분자는 p55 p75 세포 표면 수용 체³, 마지막으로 세포 apoptosis 이어질 신호 경로 방지와 종양 괴 사 인자 알파 (TNFα)의 상호 작용을 차단 하 여 그들의 치료 속성을 발휘 한다.

TNFα 일부 만성 질환⁴에 염증을 일으킬 수 있다. TNFα 쓰레드가 extracellular 환경에 타고 난 면역 체계와 질병⁵의이 종류에 있는 주요 배우의 보초는 대 식 세포에 의해 은닉 된다. 일반적인 경로로 TNFα 규제 완화는 이러한 질병의 병 인 연결 됩니다. 제어 없이 및 지속적인 유도 및 세포 스트레스, TNFα 궁극적으로 류 마티스 관절염, Crohn의 질병, 그리고 다른 병 적인 프로필⁶로 이어지는 세포 죽음 및 조직 변성을 유도 합니다.

TNF와 그것의 수용 체 사이 상호 작용을 차단 하는 TNF 길 항 제는 점점 징후를 줄이고 이들이 질병의 진행을 방해 하는 효과적인 치료로 사용 되었습니다. 요즘, 안티 TNFα 약 제품 추가 참여 조직의 변성 방지이 cytokine의 조직 농도 제어를 널리 사용 됩니다. 이런이 의미에서 재현 하 고 강력한 생물의 생물 학적 효과 달성 하는 약물의 특정 능력을 설명 하기 위해 제공은 필수적입니다.

이 프로토콜, 중요 한 중화 분석 결과의 개발 단계 식별-생물 학적 힘의 성공적인 측정에 대 한 강조 표시 됩니다, 바이오 분석 메서드를 실행 하는 데 필요한 기술에 특히 강조와 함께. 이 바이오 분석 방법 마약 제품을 임상 시험된 기준 물질에 비해 다른 배치 또는 안티-TNFα 사이 유용한 comparability 정보를 제공 합니다.

프로토콜

1. 미디어와 솔루션의 준비

1. 문화 매체를 준비: RPMI-1640 10 %FBS, pH 7.4.
2. 준비 분석 결과 문화 매체: RPMI-1640 페 놀 레드 하지 않고 있지만 1 %FBS, pH 7.4.
3. 세포 세척 솔루션 준비: DPBS Mg 및 Ca 무료 솔루션 0.02 %EDTA, pH 7.4.
4. 세포 분리 솔루션 준비: 1 mm EDTA 0.125 %trypsin.
   1. 녹여 100 mL의 트립 신-EDTA와 메 마른 500 mL 플라스 크에 0.25% 솔루션.
   2. 믹스 셀의 100 mL와 함께 솔루션을 세척 하 고 15 mL 무 균 튜브에 15 mL aliquots 분배. -70-80 ° C까지 사용 하 게.
   3. 0.22 μ m 멤브레인 통해 이러한 솔루션을 필터링 하 고 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 37 ° C 까지의 따뜻한.
5. Apoptosis 유도 재고 솔루션 TNFα 솔루션 3.3 µ g/mL에서 준비.
   1. 500 µ L의 기본 컨테이너와 완전 한 해체까지 믹스에 필터 살 균 물과 TNFα의 분해 20 µ g.
   2. 15 mL 무 균 튜브에 전송 하 고이 관에 DPBS Mg 및 Ca 무료 솔루션의 5.5 mL를 추가 합니다. 와 동 믹서를 사용 하 여 부드럽게 혼합.
   3. 약 70 µ L 부분으로 수입니다. 0.5 mL microtubes-80에서 저장소에 각 약 수를 분배 ° c.
6. 준비 apoptosis 유도 솔루션: 40 ng/mL에서 TNFα 솔루션.
7. 10 분에 대 한 25 ˚C에서 물 욕조에 그것을 잠복기 apoptosis 유도 재고 솔루션의 약 수를 해 동
1. 15 mL 무 균 튜브에 분석 결과 문화 매체의 4.939 mL을 3.3 µ g/mL TNFα 솔루션의 61 µ L을 추가 하 여 40 ng/mL을 apoptosis 유도 재고 솔루션을 희석.
2. 10 소용돌이 믹서로 혼합 s;이 솔루션은 사용 하기 전에 갓 준비 해야 합니다.
3. 회 eneutralization 분석 결과에서 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 37 ° C에 솔루션을 따뜻한.
8. 기판 솔루션 준비: caspase 3/7 저런 솔루션 ^{7 , 8}.
   1. 녹여 caspase 버퍼 솔루션 (caspase 3/7 Glo 버퍼) 사용 하기 전에 12 h.
   2. Caspase 버퍼 솔루션 및 기판 (caspase 3/7 Glo 기판) 앉아 별도로 25 ± 5 ° C에서 혼합 전에 30 분 동안 하자.
   3. 반전 하 여 기판 유리병 및 혼합 caspase 버퍼 솔루션의 10 mL 전송할.
   4. 계속 25 ± 5 ° C, 사용까지 빛 보호.
      참고:이 솔루션은 실 온에서 6 h에 대 한 안정적인.

2. 세포 Culturing 및 계산

1. 셀 해빙 하 고 첫 번째 subculture.
   1. WEHI 164 셀 ⁹ 한 유리병-80 ˚C에 냉장고에서 제거 하 고 얼음 목욕에 그들을 전송.
   2. 냉동된 세포는 완전히 해 동 때까지 미리 데워 진된 문화 매체의 1 mL와 함께 아래로 플라스틱.
   3. 분배 15 mL 무 균 튜브에 미리 데워 진된 문화 매체의 9 mL.
   4. 15 mL 무 균 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 반전 5 번 부드럽게 혼합.
   5. 원심 125 x g 3 분 삭제에 세포 현 탁 액은 상쾌한 고 셀 펠 릿 세분화.
   6. 튜브를 문화 매체의 5 mL을 추가합니다. 세포는 완전히 resuspended 때까지 혼합.
   7. 셀 카운팅을 위한 500 µ L microtube 및 50 µ L 0.4 %trypan 파랑의 혼합 세포 현 탁 액의 50 µ L을 전송. 셀을 계산 하 고 10 ⁶ 셀/mL x 0.5를 조정 합니다. 아래 단계 2.2를 참조 하십시오.
   8. 75 mL 세포 배양 플라스 크를 미리 데워 진된 문화 매체의 13 mL을 추가.
   9. 단계 2.1.6 셀 문화 플라스 크에서 10 ⁶ 셀/mL x 0.5를 달성 하 고 37 ° C, 5% CO ₂에서 밤새 품 어 충분 한 셀 서 스 펜 션 볼륨 분배.
2. 셀 세.
   참고: 참조 참조 ¹⁰.
   1. 솔루션을 사용 하 여 단계의 2.1.6, 0.05 mL는 hemocytometer를 전송과 trypan 블루 제외를 사용 하 여 현미경으로 세포 밀도 결정.
   2. 셀과 가능한 셀의 총 수를 계량.
   3. 10 ⁶ 셀/mL x 0.5 셀 정지 조정.
      방정식 1
      V _{문화 매체} (mL) =
      V _{문화 매체} (mL) = (5 mL-V _{세포 현 탁 액})
      V _{문화 매체} (mL) = 조정 된 양의 WEHI 164 현 탁 액 셀
      NVC 가능한 WEHI 164 셀/mL의 수 =
      V _{문화 매체} (mL) = 0.5 x 10 ⁶ 셀/mL를 달성 하기 위해 세포 현 탁 액에 추가 분석 결과 문화 매체 볼륨
      0.5 x 10 ⁶ = 대상 셀 밀도
3. 세포 분리 및 두 번째 및 세 번째 subculture.
   참고:는 플라스 크에서 솔루션을 제거 하는 진공 시스템을 사용할 수 있습니다. 일회용 또는 유리 살 균 펫을 사용할 수 있습니다. 피펫으로 목화 덩어리 있으면 상단에, 그것은 사용 하기 전에 제거 해야 합니다.
   1. 세포 배양 1 mL 균 피 펫 및 진공을 사용 하 여 T-플라스 크에서에서 문화 매체를 제거.
   2. 셀 세척의 분배 5 mL 솔루션 T-플라스 크, 문화에 부드럽게, 혼합 하 고 솔루션을 삭제. 이 단계를 반복 하 여 두 번.
      참고: 문화 매체의 완전 한 제거는 효율적인 전지 분리에 대 한 중요.
   3. T-플라스 크에 세포 분리 솔루션의 15 mL를 추가 하 고 37 ° C, 5% CO ₂ 배양 기에서 3 분 서 보자.
   4. 는 현미경 아래 플라스 크 내부 벽에 연결 된 셀의 부재를 확인합니다. 문화 20 mL의 멸 균 피 펫을 사용 하 여 T-플라스 크에서에서 셀을 제거 하 고 살 균 50 mL 튜브에 그들을 분배.
   5. 원심 125 x g 3 분 삭제에 세포 현 탁 액은 상쾌한 고 문화 매체의 또 다른 5 mL와 펠 릿 resuspend.
   6. 셀을 계산 하 고 식 1에 따라 원하는 셀 농도 도달 충분 한 문화 매체를 추가.
   7. 72 cm ² T-플라스 크에이 정지를 추가 하 고 37 ° C, 5% CO ₂에서 밤새 품 어.
   8. Subculture 최소한 두 번 중립화에 그들을 사용 하기 전에 셀 시험. 다음 2 일에 대 한 단계 2.3.1-2.3.8 반복.
4. 세포 현 탁 액을 시험. 적어도 3 개의 패스를
   1. 선택 WEHI 164 subculture 2.1 단계를 참조 하십시오.
   2. 분리와 2.2와 2.3이이 프로토콜의 단계에 따라 셀.
   3. 10 ⁶ 셀/mL x 0.5 식 1에 따라 세포 현 탁 액 희석.
   4. 중화 분석 결과 대 한이 세포 현 탁 액을 사용합니다. 믹스와 동 믹서 사전 사용 하 여 모든 셀 정지.

3. 항 체 준비 및 희석

1. 는 mAbs의 정량. 그들의 대량 멸종의 계수 (1.39) ¹¹를 사용 하 여
   1. 결정 참조 물질, 컨트롤 샘플 및 280에 UV 흡수를 통해 분석 샘플의 농도 nm.
      참고: 원래 농도 약 제품 라벨에서 가져온 수 있습니다. 그러나,이 자외선 흡수 하 여 확인 해야 합니다.
2. mAb 희석. DPBS 2 mL microtubes, 2 mg/mL까지 Mg 및 Ca 무료 솔루션 3 중에서 독립적으로
   1. Dilute 모든 샘플. 빈으로 DPBS Mg 및 Ca 무료 솔루션을 사용 하 여 3 중에 UV 흡수이 농도 확인.
   2. 5 재고 단백질 솔루션을 믹스와 동 믹서를 사용 하 여 s.
   3. 분석 결과 문화 매체의 0.9 mL으로 각 2 mg/mL mAb 솔루션의 희석 100 µ L.
   와 동 믹서에 의해
   4. 믹스 5 s.
      참고:이 솔루션 200 µ g/mL의 농도 있다. 각 3 중의 희석은 이루어져야 합니다.
   5. 희석 10 & #181. L 각 200 µ g/mL mAb 솔루션의 분석 결과 문화 매체의 0.99 mL와 함께. 5에 대 한 믹스와 동 믹서를 사용 하 여 s. 이러한 솔루션 2 µ g/mL의 농도 있다. 각 3 중 직렬 희석 중화 분석 결과에서 그들을 사용 하기 전에 수행.
   6. 는 MAb 희석 3 개의 독립적인 microplates에 안티 TNFα 확인합니다. 각 독립 3 중에서 중복을 확인 하 고 표 1에 표시 된 대로 한 microplate에 그들을 분배 한다. 물질 참조 < 테이블 fo:keep-together.within-페이지 "1" fo:keep =-와-next.within-페이지 "항상" fo:text =-정렬 = "센터" > 접시 1 접시 2 플레이트 3 웰 스 샘플 웰 스 샘플 웰 스 샘플 B2:B11 참조 물질이 B2:B11 컨트롤 샘플 B2:B11 분석 샘플 C2:C11 C2:C11 C2:C11 D2:D11 분석 샘플 D2:D11 참조 물질이 D2:D11 컨트롤 샘플 E2:E11 E2:E11 E2:E11 F2:F11 컨트롤 샘플 F2:F11 분석 샘플 F2:F11 기준 물질 G2:G11 G2:G11 G2:G11 표 1: Microplate 샘플 배열. 완전 한 무력화 분석 결과 g 11을 좌표 B2 내 3 microplates에서 실행 되어야 합니다. 임의의 참조, 분석, 및 제어 샘플의 분배 수 연구원 분석 결과에 어떤 편견을 확인 하.
   7. 각 참조의 수행 mAb 희석 샘플, 또는 제어, 표 2에서 같이.
      참고:이 표에 설명 된 안티-TNFα mAb 농도 중립화 시험에서 최종 농도 되지 않습니다. < td > 250

      플레이트 열	분석 결과 볼륨 문화 매체 (μ)	볼륨의 참조 물질, 분석 샘플 또는 제어 샘플 (uL)	농도 분석 결과 플레이트 (ng/mL)에서
      2	0	230	2000
      3	150	선에서 2 150	1000
      4	75	75 선 3에서에서	500
      5	100	선 3에서에서 50	333
      6	75	75 선 4에서에서
      7	75	75 선 5에서에서	166
      8	75	선 6에서에서 75	125
      9	75	75 이리저리 m 라인 7	83
      10	75	75 선 9에서에서	41
      11	150	선 10에서에서 75	13

      T 수 2: 안티-TNFα mAb 희석. 안티 TNFα mAbs의 직렬 희석을이 테이블에서 보여 줍니다. 이 표에 설명 된 최종 농도 되지 않습니다 분석 결과, 농도 안티 TNFα mAbs (mAb 희석 + 배양 세포 현 탁 액) 3 배 희석 했다. 선은 굵게 나타냅니다 희석을 3, 5, 7, 9, 및 10; 라인에서 오는 굵은 비 줄 라인 3, 4 및 6에서 희석을 나타냅니다. 이러한 직렬 희석 중화 분석 결과 수행 하기 전에 그냥 할 수 있습니다. 주의 희석을 분배 하기 전에 세 번 아래로 pipetting으로 혼합 해야 합니다.
   8. 사용까지 25 ± 5 ° C에서 번호판을 유지.

4. WEHI 164 세포 분석 결과 중화

vortexing 모든이 프로토콜의 모든 단계에서 분배 이전 정지 (0.5 x 10 ⁶ 셀/mL)를 셀에 의해
1. 믹스.
   참고:이 섹션에서 따뜻하게 사용 하기 30 분 전에 대 한 37 ° C에 각 솔루션.
2. 열 2 11, 선 B g.를 이동 하는 microplates의 60 우물의 각 세포 현 탁 액의 전송 50 µ l
3. MAb 참조, 샘플 및 컨트롤 전송 50 µ L 희석 microplates로. 그림 1에 표시 된 패턴을 따릅니다.
4. 각 잘 apoptosis 유도 솔루션의 추가 50 µ L.
5. WEHI 164의 50 µ L의 셀룰러 컨트롤 사용 세포, 3 개의 우물에 적절. 분석 결과 문화 매체와 150 µ L의 최종 볼륨을 각 잘가지고.
6. 는 WEHI 164 셀의 50 µ L의 혼합물의 세포 독성 제어 플러스 apoptosis 유도 솔루션의 50 µ L을 사용합니다. 분석 결과 문화 매체와 150 µ L의 최종 볼륨을 각 잘가지고.
7. TNFα에 대 한 제어, apoptosis 유도 솔루션의 50 µ L를 사용 하 고 분석 결과 문화 매체와 150 µ L에 가져다.
8. 빈, 혼자 분석 결과 문화 매체의 150 µ L 사용.
9. 접시 증발 효과 피하기 위해 문화 매체의 150 µ L을 채울 나머지 우물.
10. 반복 단계 4.1.1-4.1.9 2 개의 다른 microplates에 두 번.
    참고: mAb 최종 농도에 미 판 있습니다: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014, 및 0.004 µ g/mL.
11. 그림 1에 표시 된 대로 microplates에서 샘플 로드.
    
    그림 1: 시험 접시에서 샘플의 처리. B1 G11 ~ 잘 좌표는 microplates에 있으며 샘플 희석 배치 됩니다 위치 설명. 누락 된 좌표는 웰 스 컨트롤 및 분석 결과 문화 매체 (A1-A12 및 H1 H12)으로 가득 합니다. 샘플 (는 microplates에서 앞으로 역 희석)의이 무작위 배포 매체 또는 다른 변수의 증발 때문에 결과에서 바이어스를 제거에 도움이 됩니다. 그것은 최고의 각 미 판 한 번에 한 애 널 리스트에 의해 수행 됩니다. R: 참조, s: 샘플, CS: 컨트롤 샘플, Dil: 희석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
12. 16 ± 37 ° C, 5% CO ₂ 세 접시를 품 어 2 헤
13. Caspase 3/7 저런 형광 시 약 25 ± 5 ° C에서 사용 하기 전에 30 분 동안 서 보자.
14. 샘플 및 컨트롤을 포함 하 여 모든 웰 스에이 시 약의 추가 100 µ L.
15. 즉시 우물으로 분배 후 25 ± 5 ° C에서 3 분 microplate 소용돌이 믹서를 사용 하 여 번호판을 흔들.
16. 2.5 ± 0.5 h 25 ± 5 ° C, 빛 으로부터 보호에 대 한 번호판을 품 어.
17. 마이크 삽입roplates는 루미 노에 다음 섹션을 완료 하 고.

5. 분석 결과의

1. 발광 모드 및 기능을 선택 발광 검출을 위한 소프트웨어를 사용 하 여.
2. 선택 96 잘 클리어-하단 플레이트 및 열 1 및 12를 제외 하 고 그것의 80 내부 우물.
3. 1250 ms 및 10의 통합 시간 선택 읽기 전에 microplate 혼합에 대 한 s.
4. 우물 참조 물질, 분석 물질 및 컨트롤 샘플 배치 됩니다 및 그들의 대응 농도와 식별을 선택 합니다.
5. 는 루미 노와 microplates에 배치 샘플 읽기.
6. 결과의 분석에 대 한 네 번째 매개 변수 방정식을 사용합니다. 그림 2에서 같이 복용량 응답 곡선 그래프.
   
   그림 2: 복용량 응답 곡선. 발광 (세포 생존 능력) 대 안티 TNFα mAb 농도 그려져 있습니다. 네 번째 매개 변수 방정식 mAbs의 안티 TNFα 보호를 설명 하는 모델으로 사용 되었다. EC50은 슬로프에 변화 그래프에서 궁 행 각 분석 결과에 50% 세포 죽음을 일으키는 원인이 되는 TNFα의 양을 중화 시킬 수 mAb의 농도 이다. 바 각 mAb 농도 대 한 발광의 표준 편차를 설명합니다. x 안티 TNFα Ab 농도 나타내고 y 나타내는 반면 ng/ml, 로그 기능으로 묘사 된다 임의의 발광 단위에서 발광 반응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
   참고: 네 번째 매개 변수 방정식에 C 효과적인 농도 50 (EC50) 이다. 이 값 effector 기능에 의하여 참조 물질, 분석 샘플, 및 제어 샘플을 비교 하는 데 사용 됩니다.
7. 상대 potencies 계산, 기준 물질을 100%로 수정 하 고 샘플의 potencies 계산 하 고 적절 하 게 제어.
   참고: 이러한 값 그림 3에서 묘사 된다.
   
   그림 3: 사용 하는 EC50s 및 그들의 값을 계산 하는 수학 방정식. EC50 값, 또는 C 매개 변수를 표준 오류로 묘사 그들의 불확실성을가지고 있다. 상대적인 힘의 샘플 및 참조 결과 EC50s의 비교도 그려져 있습니다. α와 신뢰 구간 계산 = 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

결과

(컨트롤)와 복용량 응답 그래프
그림 1 mAb 농도 대 발광 응답을 나타냅니다. 이 자형 기능 분석 결과 배양 세포 세포의 용 해 때문에 caspase 3 및 7 릴리스를 예로 보여주. 세포 죽음은 혈 청 기아 플러스 TNFα 유도 신호에 의해 향상 됩니다. 따라서, 안티-TNFα 분자 (mAb)는 TNF 세포 수용 체와의 상호 작용 (입체 방해)에 의해 억제 사이토카인 ...

토론

이 특성화 비싸고 시간이 많이 걸리는 임상 시험 실시 전에 선험적으로 개발 중인 분자의 생물 학적 행동 결정에 도움이 됩니다. 승인 된 약 제품의 일괄 처리를 일괄 처리 릴리스도 유용합니다. 이 분석 실험 분자는 그것의 행동의 메커니즘에 대 한 적절 한 생물학적 효과 여부를 확인 하는 데 유용은 언급 가치가 있다. 이 자습서에 바이오 분석 방법은 다른 안티-TNFα 분자의 비교에 매우 중...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
WEHI 164	ATCC	CRL-1751	Fibrosarcoma cells from Mus musculus
RPMI-1640 Medium	ATCC	30-2001	Store medium at 2 °C to 8 °C
RPMI 1640 Medium, no phenol red	GIBCO	11835-030	Store medium at 2 °C to 8 °C
Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red	GIBCO	25200-056	Store medium at -10 °C to -20 °C
DPBS, no calcium, no magnesium	GIBCO	14190-136	Store medium at 2 °C to 8 °C
Recombinant Human TNF-alpha Protein	R&D Systems	210-TA-020	Store at -20 °C to -70 °C
Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG	HyClone	SH3089803	Store at -10 °C to -20 °C
Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	HyClone	SH3007103	Store at -10 °C to -20 °C
Caspase-Glo 3/7 Assay kit	Promega	G8093	Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent	J.T.Baker	8993-01	--
Sample mAb Adalimumab	Probiomed	NA	Final concentrations in the microplate are:  0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL
Reference and Control mAb Adalimumab	Abbvie	NA	Final concentrations in the microplate are:  0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL
Microplate Reader	Molecular Devices	89429-536	SpectraMax M3 Multi-Mode
Microplate reader Software	Molecular Devices	--	SoftMax Pro 6.3 GxP
Incubator	Revco	30482	Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2
Laminar Flow Hood	The Baker Company	200256	Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2