JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم إنشاء اثنين من خوارزميات تحليل الصور، "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" و "ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics"، لتحديد تسعة الميزات المورفولوجية للذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي (NMJ) تلقائيا.

Abstract

مورفولوجيا متشابك يرتبط ارتباطا وثيقا فعالية متشابك، وفي كثير من الحالات العيوب الشكلية المشبك تؤدي في نهاية المطاف إلى خلل متشابك. ذبابة الفاكهة اليرقات الوصل العصبي العضلي (NMJ)، وهذا نموذج راسخة لنقاط الاشتباك العصبي glutamatergic، وقد درس على نطاق واسع على مدى عقود. تحديد الطفرات المسببة العيوب الشكلية NMJ كشفت عن وجود ذخيرة من الجينات التي تنظم وضع المشبك وظيفة. وقد تم تحديد العديد من هذه الدراسات على نطاق واسع أن تركز على النهج النوعية للكشف عن تشوهات شكلية من ذبابة الفاكهة NMJ. والعيب من التحليلات النوعية هو أن العديد من اللاعبين خفية المساهمة في التشكل NMJ المرجح أن تظل دون أن يلاحظها أحد. في حين يطلب من التحليلات الكمية للكشف عن الاختلافات الشكلية دهاء، هذه التحليلات ليست بعد أداء عادة لأنها شاقة. يصف هذا البروتوكول في التفاصيل اثنين من خوارزميات تحليل الصور "ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics "، كما تتوفر وحدات الماكرو فيجي المتوافقة، لتحليل المورفومترية الكمي ودقيق وموضوعي لذبابة الفاكهة NMJ. تم تطوير هذه المنهجية لتحليل المحطات NMJ immunolabeled مع علامات تستخدم عادة أجهزة ... (1) و . BRP بالإضافة إلى ذلك، يتم تقديم تطبيقها على نطاق أوسع لعلامات أخرى مثل برنامج الصحة الإنجابية، CSP وSYT في هذا البروتوكول وحدات الماكرو قادرة على تقييم تسعة ميزات NMJ المورفولوجية: منطقة NMJ، محيط NMJ، وعدد من حبات، طول NMJ، NMJ أطول فرع طول، وعدد من الجزر، وعدد الأفرع، وعدد من المتفرعة نقاط وعدد من المناطق النشطة في محطة NMJ.

Introduction

الاضطرابات المعرفية مثل الإعاقة الذهنية، واضطراب طيف التوحد والفصام غالبا ما تتميز اختلال وظيفة متشابك 1، 2، 3. مورفولوجيا المشبك وظيفة تتشابك بإحكام. عيوب شكلية يمكن أن يسبب خلل متشابك و، باتجاهين معاكسين، وانتقال متشابك الشاذة يؤثر نضوج متشابك والتشكل 4 و 5 و 6.

وقد تم استخدام عدد من الكائنات النموذج من أجل فهم أفضل لبيولوجيا المشبك وتسليط الضوء على كيفية تأثير التغييرات متشابك وظيفة الدماغ في الصحة والمرض 7 و 8 و 9. هو درس ذبابة الفاكهة NMJ على نطاق واسع وراسخة في نموذج الجسم الحي للسي glutamatergicعلم الأحياء 10 و 11 napse. في العقود الماضية، وقد استخدم هذا النموذج للدراسات الفسيولوجية والتي تركز على الجينات، وكذلك لشاشات الوراثية على نطاق واسع، وذلك بهدف الكشف عن الاختلافات الشكلية بين لل NMJs. على وجه الخصوص، وقد حددت شاشات الوراثية إلى الأمام العديد من الجهات التنظيمية وآليات حاسمة الكامنة وراء تطور المشبك وتعمل 12 و 13 و 14 و 15 و 16. ومع ذلك، فإن معظم هذه الشاشات تعتمد على التقييم البصري للNMJ التشكل المحطة وعلى الكشف النوعي للتشوهات متشابك أو تسجيل نصف الكمية من عدد قليل من السمات المورفولوجية. ونتيجة لذلك، خفية بدلا تشوهات شكلية متشابك التي هي غير واضحة للعين البشرية وغاب بسهولة. من أجل أن تكون قادرة على كشف شامل الاختلافات الكمية، ولديها NMJ التي سيتم تقييمها بدقة من خلال تقدير المنتظم للمعلمات المورفولوجية للاهتمام. قياس ملامح NMJ يدويا هي شاقة، خاصة عند وجود العديد من الميزات NMJ الفائدة و / أو عند إجراء الفحوصات الجينية على نطاق واسع. من أجل دعم multiparametric، الإنتاجية العالية التحليل الصرفي وتحقيق تقدير موضوعي، وقد وضعت اثنين من وحدات الماكرو "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" و "ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics" 17. تشغيل كل من وحدات الماكرو في البرمجيات مفتوحة المصدر تحليل الصور فيجي 18، ويمكن تحديد كل من الصور مبائر وnonconfocal.

"ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" تدابير محطات NMJ immunostained مع علامة القرص بعد المشبكي واسع 1 (DLG-1) أو قبل المشبكي الفجل البيروكسيديز (HRP)، وشارك في المسمى مع نشطة bruchpilot علامة منطقة (بدر). ومن الكمي تسعة parame الصرفيالنسب (مزيد موضح أدناه): منطقة NMJ، محيط NMJ، وعدد من حبات، طول NMJ، NMJ أطول طول فرع، وعدد من الجزر، وعدد الأفرع، وعدد من المتفرعة نقاط وعدد من المناطق النشطة في محطة متشابك (الشكل 1) . على الرغم من خوارزمية لتحديد عدد من حبات موجودة في هذا الماكرو، فإنه لم تستوف معايير دقة 17. لتقييم صحيح عدد حبات، فمن الضروري استخدام "ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics" ماكرو، الذي تم تصميمه خصيصا لقياس حبات استخدام مستحضرات NMJ immunostained بواسطة anti-Synaptotagmin (SYT) أو البروتين سلسلة مكافحة السيستين (CSP)، وشارك في immunolabeled مع بدر. الماكرو "ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics" يقيس المعلمات التالية: عدد حبات، NMJ منطقة حبة، طول NMJ، NMJ أطول طول فرع، وعدد من الجزر، وعدد الأفرع، وعدد من نقاط المتفرعة وعدد من زوي نشطالأخبار (الشكل 2).

وحدات الماكرو تتكون من وحدات الماكرو دون 3: (I) "تحويل إلى كومة" يحدد جميع ملفات الصور المتاحة ويخلق Z-hyperstacks والحد الأقصى لتقديرات كثافة كل من القنوات. كما تم إخراجه، وهذا الماكرو توليد ملفين جديدة في المشبك يسمى "stack_image_name" و "flatstack_image_name". II) "تعريف ROI" ستفتح كل القصوى الصور إسقاط "flatstack_image_name" على التوالي وتقديمها مع طلب لتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) الذي محطة متشابك محددة من الفائدة الحالية يدويا. وقد تم تنفيذ هذا للسماح استبعاد نقاط الاشتباك العصبي التي تربط العضلات المجاورة و / أو أنواع أخرى من محطات متشابك (مثل 1S) التي يمكن أن تكون موجودة في الصور 11. (III) "تحليل" ينطبق مؤتمتة بالكامل التحليل لجميع المناطق من الصور داخل حدود العائد على الاستثمار. مثلنتيجة لهذه الخطوة، سيكون المستخدم الحصول على ملفين جديدة: "RESULTS.TXT" حيث سيتم المشروح كل قياس العددي و"res_image_name.tif" حيث سيتم توضيح لتقطيع الصورة الكامنة التي تنتجها الماكرو. خلال تحليل الصور وتستمد ثلاثة مبان من كل محطة متشابك: الخطوط العريضة NMJ، والهيكل العظمي NMJ، وعدد من المناطق النشطة بدر إيجابية. يستخدم مخطط NMJ لتحديد منطقة NMJ ومحيطها ويقدم الفصل فاصلا لاحق عدد من حبات. من الهيكل العظمي، تم استنتاج خمس ميزات NMJ: الطول الكلي NMJ، مجموع طول أطول مسار مستمر توصيل أي نقاط نهاية اثنين (أطول طول فرع)، وعدد حجرات غير مترابطة في NMJ (المشار إليها باسم "الجزر" )، وعدد من الفروع، وعدد من النقاط المتفرعة (نقطة التفرع واحد يربط ثلاثة أو أكثر من الفروع). يتم تحديد عدد من المناطق النشطة في قناة بدر عن طريق عدالبقع بدر إيجابية. يتم عرض المخطط التفصيلي NMJ (الخط الأصفر)، والهيكل العظمي NMJ (الخط الأزرق)، وعدد من المناطق النشطة بدر إيجابية (المشار إليها البؤر الأبيض) في صورة النتائج وتتم معالجة قياسات المعلمات إلى (. النص) ملف الإخراج (الشكل 3).

ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics "و" ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics "وصفت لأول مرة والتحقق من صحتها على نطاق واسع من قبل Nijhof وآخرون. 17. وتركز هذه المخطوطة على منهجية لتحليل NMJ التشكل باستخدام وحدات الماكرو" ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics "و" ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics ". ومع ذلك، قبل أن التحليلات الكلية بمساعدة، تحتاج تشريح NMJ وimmunostainings التي يتعين القيام بها. وهذه خطوات حاسمة، والجمع بين علامات تستخدم لالمناعية يجب أن يكون مناسبة لتحليل الاقتصاد الكلي. وردت هذه الخطوات لفترة وجيزة في حد ذاتهاction 1 من هذا البروتوكول وتوجيه المستخدم إلى المراجع التي تصف بالتفصيل بروتوكولات لتنفيذ هذه الإجراءات.

Protocol

1. متطلبات قبل معالجة الصور

  1. أداء ذبابة الفاكهة التحضيرات كتاب مفتوح من الطور تجول الثالثة اليرقات (L3)، كما هو موضح سابقا (19).
  2. شارك في immunolabel محطات ذبابة الفاكهة NMJ باستخدام مزيج من اثنين من علامات: DLG-1 أو HRP جنبا إلى جنب مع بدر للتحليل مع "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics"، وSYT أو CSP جنبا إلى جنب مع بدر للتحليل مع "ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics" 20.
    ملاحظة: الأجسام المضادة من نفس النوع يمكن الجمع التي كتبها قبل وضع العلامات واحد مع مجموعة الأجسام المضادة الاقتران مثل زينون اليكسا وسمها أطقم (17).
  3. صورة محطات NMJ باستخدام مجهر الاختيار، على سبيل المثال، مضان (مع أو بدون ApoTome) أو المجهري متحد البؤر.
    1. الحصول على كومة صورة 2-قناة محطة NMJ.
      1. ضبط إعدادات المجهر بطريقة القناة 1يكتسب محطة NMJ immunolabeled مع أجهزة ... 1 (أو برنامج الصحة الإنجابية، SYT، CSP) وقناة 2 محطة NMJ immunolabeled مع بدر.
      2. اختياريا، تحليل الصور قناة واحدة (من نقاط الاشتباك العصبي immunolabeled مع الأجسام المضادة واحد) مع وحدات الماكرو. immunolabeled لل NMJs صورة فريد مع أجهزة ...-1 أو برنامج الصحة الإنجابية للتحليل مع "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics"، أو SYT أو CSP ل "ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics".
        ملاحظة: ليس من الممكن لتحليل نقاط الاشتباك العصبي immunostained مع الوحيدة المضادة للبدر.
    2. تصدير الصور التي تم الحصول عليها الفردية ملفات TIFF. ". عكس ترتيب القنوات قبل تشغيل وحدات الماكرو إذا لم يتم الحصول عليه كما هو محدد.

2. متطلبات البرنامج وتركيب

  1. تحميل وحدات الماكرو: "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" و "ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics" من الموقع التالي: https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21.
  2. حرك المؤشر إلى المجلد "وحدات الماكرو تحديث 1"، وانقر على خيار "عرض" الظهور. سوف تظهر قائمة مع محتويات هذا المجلد. يحتوي المجلد وحدات الماكرو "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" و "ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics".
    ملاحظة: كل من وحدات الماكرو متوافقة مع الإصدارات فيجي 1.4، والتي يتم توفيرها أيضا في نفس المجلد. قد لا يتم تشغيل وحدات الماكرو في الإصدارات الأخيرة. يرجى الاستفادة من تقدم الإصدار 1.4. ومن إشكالية لبدء هذا الإصدار، حتى على أجهزة الكمبيوتر مع نسخة فيجي أكثر حداثة المتاحة.
  3. انقر على "تحميل جميع". سيتم تحميل محتوى المجلد إلى الكمبيوتر كملف الرمز البريدي. بفك الملف الذي تم تنزيله.
  4. نسخ الملفات ذبابة الفاكهة _NMJ_Morphometrics.ijm وذبابة الفاكهة _NMJ_Bouton Morphometrics.ijm إلى Fiji.app/plugins/ الدليل. عند إعادة تشغيل البرنامج، سوف تظهر وحدات الماكرو في الجزء السفلي من الإضافاتالقائمة المنسدلة.

3. تشغيل الفرعية ماكرو "تحويل إلى كومة" إنشاء Z-توقعات وHyperstacks من الصور NMJ

  1. بدء تشغيل واجهة رسومية عن طريق تحديد الإضافات في شريط الأدوات واختر "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" في القائمة المنسدلة.
  2. تحديد "سلسلة ملف فريدة من نوعها" الإعداد في واجهة رسومية الماكرو.
    ملاحظة: البرنامج المجهر يستخدم التوقيع تحديد لتنظيم الطائرات والقنوات عند تخزين أكوام كما الفردية ملفات TIFF. ". يحتاج الإعداد سلسلة ملف فريد دخلت لتحديد توقيع تعيينها من قبل البرنامج لأول طائرة من القناة الأولى (هام: أدنى تحتاج الطائرة ورقم القناة إلى الإشارة).
  3. حدد فقط دون ماكرو "تحويل إلى كومة" ثم انقر على "موافق" وحدد المجلد حيث توجد الصور. إذا تم تحديد دليل الرئيسي مع العديد من المجلدات الفرعية، كل فرد و tiff الملفات داخلالدليل الرئيسي والفرعي المطابقة للمعايير سلسلة ملف فريد سوف تتم معالجتها.
    1. إذا كان كومة ض يحتوي فقط على قناة واحدة، حدد خانة "القناة 1 فقط".
  4. لاحظ أن ملفين جديدة لكل صورة NMJ، افتراضيا توصف بأنها stack_image_name وflatstack_image_name سوف تظهر. تخزين فقط هذه المكدس وflatstack لمزيد من التحليل. يمكن حذف سلسلة ملف TIFF. في هذه المرحلة، والتقليل من قدرات التخزين المطلوبة وتجنب مصادر الخطأ المحتملة.

4. تشغيل الفرعية ماكرو "تعريف ROI" لتحديد محطة NMJ الاهتمام

  1. بدء تشغيل واجهة رسومية "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics".
  2. حدد مربع الاختيار فقط "تحديد العائد على الاستثمار" ثم اضغط على "OK" وحدد الدليل الرئيسي حيث يتم تخزين الصور بعنوان flatstack_name ثم اضغط على "اختيار". والكلي الفرعي "تحديد العائد على الاستثمار" بالبحث تلقائيا من خلال جميع المجلدات الفرعيةضمن الدليل الرئيسي المحدد.
  3. كما يفتح الإسقاط الأول، حدد أداة "التحديدات حر" في شريط الأدوات. باستخدام الماوس رسم التحديد الذي يحتوي حصرا محطة NMJ كاملة من الفوائد وانقر فوق "موافق" في إطار "تعريف محطة". سوف الماكرو المضي قدما في إسقاط المقبل.
  4. ترسيم ROI المقبل، وتكرار حتى يتم تحديد كل رويس. سيتم تخزين ملف الصورة ROI، واسمه "roi_image_name"، في نفس الدليل الذي تم إنشاؤه من قبل المكدس وإسقاط الصور لكل من الصور ومعالجتها. إخراج هذا الماكرو من الباطن هو صورة ثنائية من العائد على الاستثمار باللون الأبيض على خلفية سوداء.

5. تشغيل الفرعية ماكرو "تحليل" لتحديد NMJ محطة الميزات

  1. انتقل إلى شريط الأدوات، حدد "الإضافات" والاستخدام:
    "ذبابة الفاكهة _NMJ_Morphometrics" عند تحليل نقاط الاشتباك العصبي immunolabeled مع مكافحة DLG-1 أو مكافحة HRP (القناة 1) معامع المضادة للبدر (قناة 2)، أو "_NMJ_Bouton_Morphometrics ذبابة الفاكهة" عند تحليل نقاط الاشتباك العصبي immunolabeled مع مكافحة SYT أو مكافحة CSP (القناة 1) جنبا إلى جنب مع بدر (قناة 2).
    1. عندما تكون ليتم تحليلها واحد مداخن قناة صورة (قناة الهيكلية DLG-1 أو HRP ل "Drosophila_ NMJ_Morphometrics"، أو SYT أو CSP ل "_NMJ__Bouton_Morphometrics ذبابة الفاكهة")، حدد خانة "القناة 1 فقط".
  2. ضبط مقياس المقابلة للصور ليتم تحليلها. إذا بكسل واحد في الصورة يتوافق مع 2.5 ميكرون، يشير مقياس-بكسل = 1، مقياس لمسافات في ميكرومتر = 2.5. في حال تركت كلا الإعدادات في 0، ويتم التعبير عن المنطقة NMJ، المحيط، طول وطول أطول فرع في عدد من بكسل.
  1. إذا لزم الأمر، وضبط إعدادات تحليل الافتراضي الماكرو. تنفيذ التعديلات إلا إذا كان الكلي الفرعي "تحليل" (هذا القسم مع نتائج غير مرضية، وDETEوقد rmined أفضل الإعدادات في القسم 6) التشغيل.
  2. حدد مربعات الاختيار "تحليل" و "الانتظار" واضغط "OK".
    1. حدد خانة الاختيار "الانتظار" عند تشغيل شبه الكلي "تحليل" في 2 صور قناة. وإلا أخطاء في العد منطقة نشطة يمكن أن تحدث نتيجة لقدرات الكمبيوتر محدودة.
  3. كما نافذة جديدة "اختيار الدليل" يفتح، حدد الدليل حيث توجد الصور ثم اضغط على "اختيار". سوف الماكرو تحليل جميع الصور المخزنة في الدليل الرئيسي، وإذا المجلدات المعمول بها، اللاحقة (باستخدام الملفات الثلاثة من تنفيذ السابقة، وحدات الماكرو فرعية هي: stack_image_name، flatstack_image_name وroi_image_name). العمليات الكلية كل صورة على حدة وعلى التوالي. هذا يمكن أن يستغرق عدة دقائق في كومة صورة (اعتمادا على قدرة الكمبيوتر).
  4. بعد تشغيل الماكرو، لاحظ أن جديد ملف الصورة اسمه res_image_name لكل تحليل المشبك المخزنة سيكون بجمعية العقاراتتيد في المجلد الوالدين. سيتم تخزين القياسات الكمية كملف "RESULTS.TXT".
  5. تفتيش جميع الصور نتيجة لكشف واستبعاد الصور مع أخطاء تجزئة. موصوفة أخطاء تجزئة المحتملة في الجدول 3، جنبا إلى جنب مع المشورة كيفية ضبط إعدادات للتحايل على هذه. وتقدم الصور النتيجة مع مثل هذه الأخطاء تجزئة كأمثلة في الشكل (4).
    ملاحظة: عند تشغيل الماكرو مع الإعدادات الافتراضية لوحظ في واجهة المستخدم، وكان هناك دقة ما يقرب من 95٪ عند مقارنة تقييم الماكرو إلى دليل التقييم 17.

6. ضبط إعدادات الماكرو إلى الصور

  1. عندما يظهر أكثر من 5٪ من الصور أخطاء تجزئة، واستكشاف خوارزميات مختلفة لتحديد / اختيار إعدادات الماكرو أكثر ملائمة للصور.
  2. ضبط المتداول الكرة قيمة نصف قطر
    ملاحظة: كرة نصف قطرها المتداولوظيفة ينقص خلفية الصورة. هذه هي وظيفة ذات أهمية حاسمة عند العمل مع الصور حصلت على المجاهر مضان و / أو عندما يكون صور الضوضاء العالية الخلفية. فإن الطرح الخلفية تساعد الخطوات لصناعة السيارات في العتبة الماكرو لإنتاج تجزئة كافية من محطات NMJ.
    1. اختيار ثلاثة NMJ Z-توقعات (صور flatstack_image_name الناتجة عن شبه الكلي "تحويل إلى كومة") التي تمثل مجموعة البيانات صورة.
    2. في شريط الأدوات، حدد صورة | اللون | قنوات الانقسام. سيتم إنشاء صورتين، واحدة تمثل القناة 1 وغيرها من القناة 2.
    3. تبقي فقط على صورة تابعة لقناة 1 مفتوحة، الموافق DLG-1، برنامج الصحة الإنجابية، SYT أو CSP immunolabeling، والتخلص من صورة قناة بدر عن طريق إغلاق الصورة.
    4. تشغيل تصفية "خلفية طرح" عن طريق اختيار "عملية" في شريط الأدوات تليها "خلفية طرح ..." في القائمة المنسدلة.
    5. انقر على مربع الاختيار المعاينة في نافذة منبثقة وضبط كرة نصف قطرها المتداول إلى القيمة التي تزيد من التناقض بين المشبك والخلفية كما في لوحة (الشكل 5A).
      ملاحظة: انظر الشكل رقم 5 على سبيل المثال. في Figure5A، وأجزاء من المشبك تظهر نفس مستويات الرمادي كخلفية، في حين أنه في الشكل 5A "في" المتداول نصف قطر الكرة "لتعيين 500 يولد تباين قوي بين المشبك والخلفية.
    6. عندما يتم تعريف القيمة المناسبة لالمتداول نصف قطر الكرة، قم بتشغيل "خلفية طرح" الخوارزمية على Z-توقعات المحدد مع نفس القيمة دائرة نصف قطرها الكرة المتداول وحفظها (في أي دليل).
      ملاحظة: الكرة قيمة نصف قطر المتداول لمدة 8 بت أو صور RGB يجب أن تكون على الأقل كبيرة بقدر نصف قطر أكبر جسم في الصورة التي ليست جزءا من الخلفية. للصور 16 بت و 32 بت يجب إستثمار في دائرة نصف قطرهايتناسب ersely إلى مجموعة قيمة بكسل 22.
  3. تحديد مختلفة لصناعة السيارات في العتبات التي سيتم استخدامها
    1. فتح Z-توقعات المحفوظة في الخطوة السابقة (6.2.6) واختر صورة | ضبط | AutoThreshold | محاكمة جميع.
    2. كما ستظهر صورة نتيجة thresholded الثنائية مع جميع خوارزميات لصناعة السيارات في عتبة مختلفة، وتحديد خوارزمية أكثر ملائمة للصور.
      1. عند تشغيل الماكرو في وقت لاحق، تغيير العتبة في إعدادات الكلية وفقا لذلك.
      2. استخدام عتبات أكثر تقييدا ​​مثل "RenyiEntrophy" أو "لحظات" كما عتبة مخطط NMJ وعتبات أكثر تساهلا مثل "لي" لتحديد هيكل عظمي NMJ، و "هوانغ" لتحديد المناطق النشطة. عندما تكون صورا حادة جدا مع قليل من أي خلفية، استخدام "هوانغ" بأنها "عتبة مخطط NMJ وإلا أجزاء من المشبك قد يكون في عداد المفقودين بعد تجزئة الصورة.
      3. انظر الشكل 5B على سبيل المثال. يتم الحصول على تجزئة المناسبة من المشبك مع لصناعة السيارات في عتبات أبرزها صناديق خضراء. ويسلط الضوء على بعض الأمثلة على عتبات غير مناسبة من قبل صناديق الحمراء (راجع نقاط الاشتباك العصبي في تضخم عالية). في الأخير، إما أجزاء من المشبك مفقودة أو تدرج أجزاء من الخلفية. أنظر المرجع 23 للمزيد من المعلومات.
  1. تحديد الحد الأقصى لحجم الجسيمات الصغيرة
    ملاحظة: هذه الوظيفة استبعاد كل جزيئات الكشف عنها من قبل عتبة مخطط NMJ وعتبة الهيكل العظمي التي هي أصغر من القيمة المحددة في "وضع جزيئات صغيرة" من التحليل. وتعرف هذه القيمة بالبكسل. تخدم هذه الوظيفة كعامل تصفية الضوضاء ومفيدة جدا عند معدلات عالية من خلفية غير موحدة (مثل بلورات / الغبار) موجودة في الصور التي تم الحصول عليها.
    1. فتح Z-توقعات بحفظه في الخطوة 6.2.6. وحددمقياس للكشف عن عدد البكسل عبر تحليل | مقياس مجموعة. تطبيق الإعدادات التالية: المسافة بالبكسل = 1، المعروف المسافة = 1، بكسل نسبة الجانب = 1، وحدة طول = بكسل ثم اضغط على "موافق". انقر على أداة "اختيار البيضاوي" في شريط الأدوات.
    2. باستخدام الماوس رسم مجموعة مختارة المحيطة بشكل وثيق الجسيمات واحدة التي تكون موجودة في المناعية ولكن لا تنتمي إلى NMJ. اضغط Ctrl + م لمستخدم Windows أو كمد + م لمستخدمي ماك. وسوف تفتح نافذة نتيجة، مشيرا إلى مجال الجزيئات المختارة في عدد من بكسل.
    3. كرر الخطوة عدة مرات سابقة مع العديد من القطع الأثرية الموجودة في الصور لتحديد أكبر منطقة تلويث الجسيمات / قطعة أثرية. وستكون هذه هي قيمة لتعيين في الإعداد عند تشغيل الماكرو في وقت لاحق. عند تشغيل الماكرو تعيين "الجسيمات الصغيرة الحجم"، كما أصغر حجم الجسيمات صديد احظ هامش 25٪.
    4. انظر الشكل 5D على سبيل المثال. أكبر الكريستال كشفإد تبلغ مساحتها 112 بكسل. الإعداد "الجسيمات الصغيرة الحجم"، عند معالجة هذه الصورة مع الماكرو، يجب تعيين to125 - 150.
  1. تحديد الحد الأدنى لحجم حبة
    ملاحظة: هذه الوظيفة استبعاد كل حبات الكشف عنها من قبل عتبة مخطط NMJ التي هي أصغر من القيمة المحددة من التحليل. وتعرف هذه القيمة بالبكسل.
    1. اتبع نفس الخطوات كما هو موضح في القسم 6.4، ولكن في هذه الحالة رسم مجموعة مختارة المحيطة أصغر حبات موجودة في محطة NMJ. اختيار أصغر مساحة المقابلة إلى أصغر حبة من تلك المقاسة. هذه هي قيمة لتعيين في إعداد حجم الحد الأدنى حبة عند تشغيل الماكرو في وقت لاحق.
  1. تحديد "البحث ماكسيما الضوضاء التسامح" قيمة
    1. استخدام Z-hyperstacks المختارة في القسم 6.2.1.
    2. في شريط الأدوات، حدد صورة | اللون | قنوات انقسم الى بجمعية العقاراتالشركة المصرية للاتصالات 2 مداخن (لقناة 1 وقناة 2) والحفاظ على الصورة المقابلة لقناة بدر المفتوحة. تجاهل صورة قناة أخرى قبل إغلاقه.
    3. انتقل إلى علامة التبويب الإضافات في القائمة المنبثقة، حدد عملية | الحد الأقصى (3D)، وعندما يظهر maximum_image_name (والذي يمكن أن يستغرق بضع دقائق)، أغلق كومة الصورة الأصلية.
    4. حدد الحد الأقصى ... IMAGE_NAME (كومة صورة حصلت عليها) وحدد الإضافات | عملية | الحد الأدنى (3D)، أغلق الحد الأقصى ... IMAGE_NAME المكدس.
    5. في شريط الأدوات، حدد عملية | البحث ماكسيما .... نافذة جديدة "البحث ماكسيما ..." ستفتح. انقر على "اختيار نقطة معاينة ..." مربع وملء خانة "الضوضاء التسامح" مع الماكرو الإعداد الافتراضي 50. النقاط ماكسيما سيتم مبين في الصورة كما الصلبان الصغيرة.
      1. زيادة قيمة "الضوضاء التسامح" إذا مراقبة وجود فائض من المناطق النشطة المشروح، أي الصلبان التي ليست على رأس المناطق النشطة التي هي فيالتركيز على الطائرة كومة المحدد، أو المناطق النشطة كاذبة التي يتم الكشف عنها في الخلفية.
        1. من ناحية أخرى، إذا مراقبة مشروحة بشكل غير كامل المناطق النشطة، أي المناطق النشطة في التركيز لا يكون يعلم المعترف بها، وانخفاض القيمة "الضوضاء التسامح". تحاول أن تبقي قيم مختلفة تتبع هذا الإجراء حتى الصلبان ووضع العلامات بشكل مناسب المناطق النشطة في التركيز. ملء "البحث التسامح الضوضاء ماكسيما" مع هذه القيمة.
        2. انظر الشكل 5C على سبيل المثال. تم الكشف عن العديد من المناطق النشطة. في الشكل 5C "فقط تم الكشف عن المناطق النشطة في التركيز.
    6. تشغيل شبه الكلي "تحليل" للصور تمثيلية بتحديده في الخطوة 5.1، مع إعدادات محددة في كل الخطوات السابقة.
  2. ضبط بدر-نقاط وأقل والعتبة العليا
    1. لاحظ أن ملف جديد سوف تظهر بعد تشغيل مانحلال وفقا للخطوة 6.6، ودعا 2_active_zone_stack_image_name. في هذه الصورة كومة من المناطق النشطة الكشف عنها بواسطة وظيفة "البحث ماكسيما" بالرمز بقع بيضاء في كل طائرة.
    2. فتح هذا الملف عن طريق سحب وإفلاته في شريط الأدوات ثم اختر صورة | كومة | Zproject | نوع الإسقاط = شرائح المجموع. وسيتم الحصول على إسقاط من 2_active_zone_stack_image_name.
    3. اختر صورة | ضبط | عتبة. وهناك نافذة "عتبة" الجديدة فتح. حرك الشريط العلوي لاختيار قيمة العتبة حيث، وتصور كل / البقع بدر إيجابية بؤر المطلوب باللون الأحمر.
      ملاحظة: إذا تم تعيين عتبة منخفضة جدا، سيتم احتساب وجود فائض من المناطق النشطة. إذا تعيين عالية جدا، وسوف تضيع جزء من المناطق النشطة.
      1. انظر الشكل 5E على سبيل المثال. عندما يتم تعيين العتبة إلى 400، معظمهم من المناطق النشطة (يرمز بمثابة بؤر 1 بكسل) ليست مدرجة في تجزئة، لأنها ليست سلط الضوء باللون الأحمر (الشكل 5E). عندما يتم تعيين العتبة إلى قيمة 50 ويسلط الضوء على جميع المناطق النشطة باللون الأحمر (الشكل 5E ').
    4. تحدد هذه القيمة كحد ادنى حد. ترك "عتبة نقاط والعليا" على القيمة القصوى.
    5. أعد تشغيل الكلي الفرعي "تحليل" للصور تمثيلية مع إعدادات محددة في جميع الخطوات السابقة من هذا الباب. تقييم نقدي ملفات الصور الناتجة عنها، والتأكد من أن يتم تجزئة بشكل صحيح. إذا لم تكن هذه هي الحالة إعادة ضبط الإعدادات وفقا لطبيعة الأخطاء تجزئة (الشكل 4، الجدول 3).

النتائج

سيظهر ملف نتائج النص في الدليل الرئيسي. وهو يلخص جميع المعلمات قياس لكل صورة. وترتبط النتائج إلى اسم الملف ويتم لاحقا لخصت المعلمات في الترتيب المبين في الجدولين 1 و 2.

Res_image_name هو كومة ثلاثة الصورة. الصورة الأولى يسلط الضوء على الخطوط العريضة والهيكل العظمي للمحطة NMJ تحددها الكلية بناء على القناة 1 (immunolabeling DLG-1، برنامج الصحة الإنجابية، SYT، أو CSP). الصورة الثانية هي نسخة من الصورة الأولى وتظهر حددت بدر إيجابية البقع التي يتم الكشف عنها في القناة 2 كما بؤر schematized بالإضافة إلى ذلك. تقدم صورة ثالثة الحد الأقصى لإسقاط القناة الثانية جنبا إلى جنب مع بؤر بدر الإيجابية التي تم تحديدها.

ويمثل عتبة مخطط NMJ باللون الأصفر في الصورة نتيجة الانتاج الكلي. منطقة NMJ، بريمالعطر واستنتاج عدد من حبات من هذه العتبة.

ويمثل عتبة الهيكل العظمي NMJ باللون الأزرق في الصورة نتيجة الانتاج الكلي. تم استنتاج طول NMJ، أطول طول الفرع وعدد الفروع، المتفرعة نقطة والجزر من هذه العتبة.

لا يتم تمثيل NMJ عتبة المناطق النشطة في الصورة نتيجة الانتاج الكلي. هذه العتبة تحدد المنطقة حيث البؤر بدر إيجابية يحتمل أن يكون واجه بواسطة الماكرو. ومن المفترض أن خلق منطقة NMJ التي هي أكبر قليلا من واحد يحددها عتبة مخطط NMJ. عند تحديد عتبة ضيقة للغاية، ويجوز منع بؤر بدر إيجابية تقع على هامش المشبك. عندما عتبة متساهلة جدا، قد تحسب الضوضاء الخلفية كما بدر إيجابية البقع (الشكلان 1-2).

لvalida الشركة المصرية للاتصالات أداء الماكرو "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics"، تم اختبار ثلاثة شروط متحولة التي تم وصفها بالفعل لتقديم عيوب متشابك في NMJ المعلمات مختلفة. تم الكشف عن كل عيب قبل إجراء تقطيع الصورة مختلفة يؤديها الماكرو (مخطط NMJ والمناطق الهيكل العظمي أو النشطة، على التوالي 17). بعد استهداف الجينات الثلاثة من الاهتمام من قبل محرض رني وتشريح أداء وNMJ المناعية من L3 اليرقات، تم تشغيل الماكرو. وكان NMJ القياسات المورفولوجية التي تم الحصول عليها ثم البشرى (رني مقابل سيطرتها) مقارنة باستخدام اختبار (ت). في جميع الحالات الثلاث، تم العثور على فروق ذات دلالة إحصائية بين المسوخ والضوابط التي تؤثر على المعلمات التي تتفق مع العيوب الشكلية ذكرت سابقا. وهذا يؤكد أن وحدات الماكرو هي في الواقع قادرة على تحديد كاف العيوب التي سبق وصفها في ذبابة الفاكهة NMJ.

ومن المعروف أن "1"> Ankyrin 2 (Ank2، CG42734) المسوخ لإظهار العيوب مورفولوجيا متشابك، بما في ذلك حبات تنصهر ولل NMJs أصغر. وقد لوحظت هذه العيوب عن المسوخ Ank2 24 و 25 و Ank2 ضربة قاضية الذباب (26). محطات NMJ من عموم العصبية Ank2- رني الذباب ضربة قاضية (ث، UAS-المقامر-2 / UAS-Ank2 رني KK107238، elav-GAL4 / +) أظهر منطقة NMJ أصغر بكثير (متوسط = 339.25 ميكرون 2، اختبار t ع = 2.18 × 10 -8) ومحيط (يعني = 238.24 ميكرون، اختبار t ع = 1.82 × 10 -3)، مقارنة مع بيانات مراقبة خلفية وراثية (ث، UAS-المقامر-2 / UAS-KK60100، elav-GAL4 / + ) (يعني = 451.95 ميكرون (2) ويعني = 288.62 ميكرون، على التوالي) بعد تشغيل "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" (أرقام 6A و 4B).

وGTPase Rab3 (CG7576) مطلوب للتوزيع bruchpilot السليم ويعرض متحولة روب مع عدد أقل بكثير من المناطق النشطة 27. ولوحظ وجود انخفاض كبير في عدد من المناطق النشطة عند قياس بؤر بدر إيجابية بواسطة الماكرو "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" في محطات NMJ من عموم العصبية الذباب ضربة قاضية Rab3 (ث، UAS-المقامر-2 / UAS رني KK100787، elav -Gal4). وكان متوسط عدد المناطق النشطة في محطة NMJ في Rab3 -RNAi 138 في المقابل إلى 290 في الكشف عن بيانات التحكم (/ +) اختبار t ع = 4.43 × 10 -29) (أرقام 6A و 4C).

موقع HighWire (HIW، CG32592) مهم المنظم للنمو NMJ. الطفرات في الجينات يؤدي إلى HIW اكتسى وتمديد المتفرعة من المحطات NMJ 28. قياس المحطات NMJ من الخلايا العصبية عموم خط HIW -RNAi ضربة قاضية (ث، UAS-المقامر-2 / UAS-رني GD36085، elav-GAL4 / +) مع "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics"، لوحظت اختلافات كبيرة في المعايير المستمدة من هيكل عظمي: طول (يعني = 147.36 ميكرون، والسيطرة تعني = 122.07 ميكرون؛ ر -test ع = 7.31 × 10 -7)، أطول طول فرع (يعني = 122.19 ميكرون، ومراقبة يعني = 105.65 ميكرون، اختبار t ع = 4.62 × 10 -4) عدد الفروع (يعني = 7.69، والسيطرة متوسط = 5.74؛ اختبار t ع = 2.52 × 10 -2) وعدد من النقاط المتفرعة (يعني = 2.73، والسيطرة متوسط = 1.79؛ اختبار t ع = 3.31 × 10 -2). وزادت كل هذه المعايير بشكل ملحوظ (120-180٪) مقارنة مع الضوابط الخلفية الوراثية (ث، UAS-المقامر-2 / UAS-GD60000، elav-GAL4 / +) (أرقام 6A و 4D).

figure-results-5580
الشكل 1: ذبابة الفاكهة _NMJ_Morphometrics يقيس 9 معلمات من Drosophiلا NMJ. على اليسار هي أجهزة ... (1) وبدر immunolabeled محطات NMJ، تصوير على المجهر مضان مع ApoTome. على اليمين هي الصور نتيجة بعد تشغيل "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics". وتتمثل المعلمات منطقة، ومحيط حبات من المخطط الأصفر المشروح الكلي المشار إليها. طول المعلمات، أطول طول فرع (LBL)، يتم عرض الفروع ونقاط المتفرعة، والجزر من قبل المخطط الأزرق المشروح الماكرو. وتمثل بؤر immunolabeled بدر (المناطق النشطة) بواسطة الماكرو على شكل بقع بيضاء في الصور نتيجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6461
الشكل 2: ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics يقيس 8 معلمات من ذبابة الفاكهة NMJ. على اليسارهي SYT-1 و بدر immunolabeled محطة NMJ، تصوير على المجهر مضان مع ApoTome. على اليمين هي الصور نتيجة بعد تشغيل "ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics". وتتمثل المعلمات حبات ومنطقة حبة من المخطط الأصفر المشروح الماكرو. طول المعلمات، أطول طول فرع (LBL)، يتم عرض الفروع ونقاط المتفرعة، والجزر من قبل المخطط الأزرق المشروح الماكرو. وتمثل بؤر immunolabeled بدر (المناطق النشطة) بواسطة الماكرو على شكل بقع بيضاء في الصور نتيجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7336
الشكل (3): تدفق الرسم البياني تمثل ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics وذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics وحدات الماكرو. أول الفرعية ماكرو "تحويل رس كومة "يخلق توقعات وhyperstacks لللل NMJs تصوير، والثانية شبه الكلي" تحديد العائد على الاستثمار "يتطلب الإدخال اليدوي تحديد موقع محطة NMJ من الفائدة. الفرعية ماكرو الثلاثة،" تحليل "، جميع التدابير المعلمات NMJ. نص يتم إنشاء الملف الذي يحتوي على القيم الكمية وملف صورة نتيجة تصور ترسيم المعلمة لمساعدة تقييم المستخدم من الأداء الكلي. وعندما يتم الحصول على صور في ظل ظروف مختلفة، وإعدادات الماكرو يجب أن يتم اختبارها وتعديلها لضمان تحليل دقيق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8278
الشكل 4: أمثلة من غير لائقة نتائج الإنقسام ماكرو. صور نتيجة بعد تشغيل "ذبابة الفاكهة NMJ MorphometrICS "أو" ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics "لا يتم تضمين أجزاء من محطة متشابك في المخطط الأصفر (A). يتم تضمين أجزاء من الخلفية في محطة متشابك من مخطط الصفراء (B). ويمتد خط هيكل عظمي أزرق وراء محطة متشابك. (C - D) يتم الكشف عن الكثير من المناطق النشطة (E - E '). بعض المناطق النشطة لا تزال غير مكتشفة من قبل التحليل (G - G). تم الكشف عن مناطق Active خارج المشبك (F) حبة تجزئة غير صحيحة. (فقط ينطبق عند تشغيل ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics)، وغاب عن حبات (H) أو يتم اكتشاف الكثير من حبات قبل تجزئة (I). الجسيمات مثل هذه البلورات أو الغبار التي هي جزء من الخلفية تم تضمينها في تجزئة (J) . يتم توفير معلومات حول كيفية تغيير إعدادات لتجنب هذه الأخطاء في الجدول 3 . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-9595
الشكل 5: أمثلة على التعديلات وضع الماكرو وعواقبها لتقسيم الصور. (A) طرح معاينة خلفية DLG-1 immunolabeled المشبك، تصوير على المجهر مضان مع ApoTome، عندما يتم تعيين "المتداول نصف قطر الكرة" إلى 20 (A) أو 500 (A '). (B) وصور ناتج تم الحصول عليها بعد تشغيل صورة | ضبط | لصناعة السيارات في عتبة | حاول كل صورة توضح تقطيع الصورة التي حصلت عليها 16 الخوارزميات المختلفة لصناعة السيارات في العتبة. (C) "البحث ماكسيما" المعاينة عند إعداد "التسامح الضوضاء" في 50 (C) و 500 (C ')؛ ميلانوصفت مناطق TIVE التي يتم الكشف عنها من قبل تجزئة من قبل صليب صغير. (D) قياس من "الجسيمات الصغيرة" التي تظهر في الخلفية صورة المشبك immunolabeled مع مكافحة HRP، تصوير على المجهر متحد البؤر. (E) "شرائح مبلغ" إسقاط الحصول عليها من 2_active_zone_stack_ima-ge_name. تم تعيين عتبة 400 (E) وفي 50 (E). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-10895
الشكل 6: تقييم ماكرو والكمي للل NMJs على الصور العضلات 4. (A) نتيجة بعد تشغيل ماكرو "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" على أجهزة ... (1) وبدر immunolabeled محطات NMJ. منطقة المعلمات، ومحيط حبةيتم تمثيل الصورة من قبل المخطط الأصفر الكلي المشروح. طول المعلمات، أطول طول فرع (LBL)، يتم عرض الفروع ونقاط المتفرعة، والجزر من قبل المخطط الأزرق المشروح الماكرو. وتمثل بؤر immunolabeled بدر (المناطق النشطة) بواسطة الماكرو على شكل بقع بيضاء في الصور نتيجة. ويشير الشريط على نطاق و20 ميكرون. (B) Ankyrin2 رني ضربة قاضية المعرض منطقة NMJ أصغر ومحيط مقارنة مع الضوابط الخلفية الوراثية. (C) Rab3 ضربة قاضية أسفرت لل NMJs مع عدد أقل من مناطق بدر إيجابية نشطة مقارنة مع الضوابط الخلفية الوراثية. (D) ضربة قاضية موقع HighWire أسفرت أطول، أعلى أطول طول فرع، وأكثر أفرع ومع نقاط أكثر المتفرعة في محطات NMJ مقارنة لل NMJs السيطرة الخلفية الوراثية. أشرطة الخطأ تشير SEM **، ف <0.01، وهما الذيل T-الاختبار. الرجاء الضغط هوإعادة لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

معامل هيكل NMJ تفسير
المنطقة (μm2) مخطط NMJ منطقة NMJ وصفت الكامل
محيط (ميكرون) مخطط NMJ محيط ينتمون إلى المنطقة
#Boutons مخطط NMJ عدد حبات متشابك ( 'اللؤلؤ على سلسلة') من NMJ
طول (ميكرون) هيكل عظمي ويبلغ طول المحطة NMJ كاملة
أطول طول فرع (ميكرون) هيكل عظمي مجموع طول أطول مسار مستمر توصيل أي اثنين من النهاية من NMJ
#فرع شجرة وفاق هيكل عظمي إجمالي عدد الفروع
نقاط #Branching هيكل عظمي عدد المتفرعة نقطة (عدة فروع يمكن أن تجنيها من وجهة المتفرعة واحد)
#Islands هيكل عظمي عدد غير متصلة الأجزاء متشابك Dlg1 إيجابية (أو أي تلطيخ أخرى)
مناطق #Active بقع بدر إيجابية عدد المناطق النشطة، استنادا إلى بدر تلطيخ

الجدول 1: NMJ معلمات تقاس "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics". سوف المعلمات NMJ تقاس الماكرو "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" تظهر على شكل قائمة في ملف نصي تم الحصول عليها، تبعا للترتيب الوارد وصفها في هذا الجدول. لقد طبع هذا الجدول من Nijhof وآخرون. 17

FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1">

معامل هيكل NMJ تفسير
حبات مخطط NMJ عدد حبات متشابك ( 'اللؤلؤ على سلسلة') من NMJ
منطقة بوتون مخطط NMJ وتبلغ المساحة الإجمالية لجميع حبات
طول (ميكرون) هيكل عظمي ويبلغ طول المحطة NMJ كاملة
أطول طول فرع (ميكرون) هيكل عظمي مجموع طول أطول مسار مستمر توصيل أي نقاط نهاية اثنين من NMJ
#Branches هيكل عظمي إجمالي عدد الفروع
نقاط #Branching هيكل عظمي ثعدد (ه) من المتفرعة نقطة (عدة فروع يمكن أن تجنيها من وجهة المتفرعة واحد)
#Islands هيكل عظمي عدد غير متصلة الأجزاء متشابك Dlg1 إيجابية (أو أي تلطيخ أخرى)
مناطق #Active بقع بدر إيجابية عدد المناطق النشطة، استنادا إلى بدر تلطيخ

الجدول 2: NMJ معلمات تقاس "ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics". سوف المعلمات NMJ تقاس الماكرو "ذبابة الفاكهة _Bouton_NMJ_Morphometrics" تظهر على شكل قائمة في ملف نصي تم الحصول عليها، تبعا للترتيب الوارد وصفها في هذا الجدول. لقد طبع هذا الجدول من Nijhof وآخرون. 17

تقسيم أخطاء لوحظ مثال التعديلات المطلوبة
NMJ منطقة ومحيط (يمثلها مخطط الأصفر في الصورة نتيجة) إما غير المدرجة أجزاء من محطة متشابك في المخطط الأصفر أو أجزاء من خلفية مدرجة في محطة متشابك المحددة باللون الأصفر. الشكل 5A-B ضبط قيمة "شعرة معاوية الشعاع. انظر القسم 6.1. ضبط "عتبة مخطط NMJ. انظر القسم 6.2.
NMJ المعلمات ذات الصلة طول (يمثلها خط الهيكل العظمي الأزرق في الصورة النتائج) خط الهيكل العظمي الأزرق إما يتجاوز أو غير موجود على طول محطة متشابك بأكملها. الشكل 5C-D ضبط قيمة "شعرة معاوية الشعاع. انظر القسم 6.1. ضبط "عتبة مخطط NMJ. انظر القسم 6.2.
نقاط وبدر إيجابية (يمثلها النقاط في صورة النتائج) تم الكشف عن العديد من المناطق النشطة. الشكل 5E-E " تقليل 'البحث التسامح الضوضاء ماكسيما "القيمة. انظر القسم 6.5.
نقاط وبدر إيجابية (يمثلها النقاط في صورة النتائج) وغاب عن المناطق النشطة من قبل التحليل. الشكل 5G-G " زيادة 'البحث التسامح الضوضاء ماكسيما "القيمة. انظر القسم 6.5. خفض "بدر-نقاط وأقل العتبة". انظر القسم 6.6.
نقاط وبدر إيجابية (يمثلها النقاط في صورة النتائج) تم الكشف عن القطع الأثرية منطقة نشطة خارج محطة متشابك. الشكل 5F ضبط قسم "عتبة المنطقة النشطة" 6.2. زيادة "بدر-نقاط وأقل العتبة". انظر القسم 6.6.
الجسيمات الصغيرة ويبدو أن الجزيئات مثل هذه البلورات أو الغبار التي هي جزء من الخلفية ليتم تضمينها في تجزئة. الشكل 5J حدد خانة "إزالة الجزيئات الصغيرة. انظر القسم 6.3. تحديد جزيئات صغيرة الحجم الأقصى. انظر القسم 6.3.
بوتون تجزئة تجزئة غير صحيحة حبة (تنطبق فقط على ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics، لا تستخدم ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics لتقسيم حبة). الشكل 5H-I ضبط "عتبة مخطط NMJ. انظر القسم 6.1. تحديد "الحد الأدنى حجم حبة. انظر القسم 6.4.

الجدول 3: استكشاف أخطاء دليل لأنواع مختلفة من أخطاء في تقسيم الصور التي يمكن أن تنتجها وحدات الماكرو. يصف هذا الجدول أنواع مختلفة منأخطاء تقطيع الصورة التي تنتجها وحدات الماكرو. هذه يمكن بسهولة الكشف في الصور النتائج. وترد أمثلة على كل نوع الخطأ في الشكل (4). في المقطع "تعديلات" من الجدول، ويسلط الضوء على الإعدادات التي تحتاج إلى تعديل، ويشار المستخدم إلى الفرعية خطوة حاسمة من المادة 6، والتي تصف كيفية ضبط هذه الإعدادات.

Discussion

"ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" و "ذبابة الفاكهة NMJ حبة Morphometrics" هي أدوات قوية للباحثين المهتمين في تقييم المشبك التشكل. تقييم اليدوي للمعلمات NMJ هو شاقة. وتشير التقديرات إلى أن وحدات الماكرو من شأنه أن ينقذ باحث خبرة تصل إلى 15 دقيقة / قضى NMJ على الخط تقطيع الصورة. مع 1:59 العشرات من نقاط الاشتباك العصبي تقييم لكل حالة أو التركيب الوراثي، وهذا يلخص بسرعة تصل إلى كميات كبيرة من الوقت الذي يمكن توفيره، حتى في الدراسات الصغيرة. عند تنفيذ شاشات كبيرة، كسب باستخدام تحليل إنتاجية عالية، مقارنة تقييم اليدوي وتقدير، يمكن أن يكون هائلا. بالإضافة إلى زيادة الإنتاجية، وحدات الماكرو توفر بسهولة التحليل الموضوعي. أنها تستبعد التحيزات الشخصية التي تتطلب خلاف ذلك التجارب أعمى فضلا عن الخلافات الشخصية التي تحدث عندما يشارك الباحثون متعددة في التحليل. وأخيرا، توفر وحدات الماكرو لوحساسة ودقيقةalysis من الميزات NMJ، مما يسمح بتحديد هوية المنظمين متشابك التي تسبب خفية بدلا من العيوب NMJ مثيرة وظلت حتى الآن غير مقدر بالعين الباحث. تم العثور على معلومات مفصلة حول إجراءات التحقق من صحة وخوارزميات المستخدمة في وحدات الماكرو في نشر Nijhof وآخرون. 17.

تم التحقق من صحة وظيفة من وحدات الماكرو لقياس بشكل مناسب الميزات المورفولوجية من ذبابة الفاكهة لل NMJs في العضلات 4. وفي وقت لاحق، وقد تبين أن وحدات الماكرو وكانت أيضا مناسبة لتحليل نقاط الاشتباك العصبي في العضلات الأخرى في هذا الحي. ومن المرجح أن وحدات الماكرو يمكن أن تستخدم أيضا لقياس المعلمات المورفولوجية للNMJ مع هيكل مماثل في الأنواع الأخرى، بما في ذلك الأنواع ذبابة الفاكهة الأخرى ومزيد من الحشرات. حتى لل NMJs بعيدة جدا في التطور، على سبيل المثال، لل NMJs من الفئران، وتبين التشكل الهيكلي مماثلة تماما 29. لم يتم اختبارها وحدات الماكرو على الاستعدادات NMJ من الأنواع الأخرى ولكن يتم تشجيع المستخدمين المحتملين لاختبار وحدات الماكرو لمثل هذه الأغراض.

من المهم جدا أن المستخدم يستكشف مختلفة لصناعة السيارات في العتبات وخوارزميات لتحديد / اختيار إعدادات الماكرو أكثر ملائمة للصور. مع هذه الإعدادات، ويتحقق بدقة ما يقرب من 95٪ عند مقارنة تقييم الكلي للتقييم اليدوي. ضبط إعدادات الماكرو بشكل صحيح الشريحة 100٪ من الصور يمكن أن يكون الإجراء شاقة للغاية أو حتى من المستحيل. لذلك، فمن المستحسن استبعاد الصور لا مجزأة بشكل صحيح إذا أعدادهم أقل من 5٪. من الواضح، إذا كانت جودة الصور منخفضة، فإن وحدات الماكرو توليد نسب أعلى من تقطيع الصورة غير المرضية. وصور ذات جودة منخفضة تؤثر بالمثل تقييم اليدوي وبالتالي لا يمكن ربطها أداء وحدات الماكرو. ومع ذلك كانت وحدات الماكرو قوية بدلا لأنها كانت مصممة للصورةق إنشاؤها على المجهر المحتوى العالي (المجهر مضان الآلية التي تسمح التصوير أعداد كبيرة من عينات) 17.

وهناك نقطة هامة هي أن المستخدم يتفقد بصريا جميع الصور نتيجة الناتجة عن وحدات الماكرو. وهذا سوف يسمح لكشف واستبعاد الصور مع تجزئة غير مرضية. في المادة 6 من هذا البروتوكول، ويسترشد المستخدم كيفية ضبط إعدادات تجزئة الصورة الصحيحة عند تشغيل الكلي الفرعي "تحليل". للتعرف بسرعة مع متطلبات وحدات الماكرو وكيفية ضبط إعدادات الماكرو مجلد يسمى "Examples_adjusting إعدادات الماكرو" يتم تضمينها في https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a مستودع الماكرو. ، وتقدم ثلاثة عشر المجلدات الفرعية، ولكل منها أمثلة الصور التي تم الحصول عليها في منصات المجهر مختلفة (المجاهر نسبة عالية / متحد / مضان) وimmunostainings مختلفة. يتم تضمين PDF بعنوان "دليل أمثلة" في نفسالمجلد حيث يتم توفير الإعدادات المطلوبة لكل سبيل المثال، جنبا إلى جنب مع وثيقة نصية تقديم النتائج المتوقعة والنتائج الصور.

تم تصميم وحدات الماكرو لمعالجة الصور المحفوظة كما و tiff فصل الملفات، ومع ذلك بعض المستخدمين قد حفظ الصور في شكل مختلف. موقع https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21 التالية يحتوي على مجلد باسم "ذبابة الفاكهة NMJ" حيث ثلاثة ملفات سبيل المثال (مثال 1-3) و "دليل أمثلة" وثيقة مع تعليمات مفصلة كيفية استيراد الصور إلى الماكرو إذا لم يتم تخزين كما و tiff فصل الملفات يمكن أيضا أن تكون موجودة في نفس المجلد.

معا "، وذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" و "ذبابة الفاكهة NMJ حبة Morphometrics" وحدات الماكرو تحديد عشرة مختلفة ميزات NMJ: منطقة NMJ، محيط NMJ، وعدد من حبات، منطقة حبة NMJ، طول NMJ، NMJ أطول طول الفرع وعدد جزيرةإدارة الأمن الوطني، وعدد من الفروع، وعدد من النقاط المتفرعة وعدد من المناطق النشطة. وهذا يوفر ميزة كبيرة على الأدوات بحيث المتاحة الآن التي يمكن تقييم واحد فقط أو عدد قليل من السمات متشابك 30 و 31. التحليل الكمي Multiparametric يحمل إمكانات كبيرة لاكتشافات جديدة، على سبيل المثال، لتحديد المنظمين الرواية التي تتحكم في واحدة تصل إلى جوانب عديدة من الأحياء المشبك. كما يوفر القرار اللازم لتحديد الجينات التي coregulate بالضبط نفس أو متداخلة ميزات NMJ وبالتالي من المحتمل أن تعمل في المسارات الجزيئية المشتركة. وأخيرا، فإنه يفتح إمكانية للتحقيق في مدى اختلاف ترتبط المعلمات متشابك مع بعضها البعض في ظروف دون عائق 17 و الجينات التي تضمن تلك الارتباطات المورفولوجية منسقة.

أخذت معا، ويوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام وحدات الماكرو اثنين "ذبابة الفاكهة NMJ Morphometrics" و"ذبابة الفاكهة NMJ بوتون Morphometrics"، والتي تؤدي تقدير موضوعي وحساسة من عشرة صفات NMJ المورفولوجية بطريقة عالية الإنتاجية.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.

Acknowledgements

ونحن نعترف مركز الاسهم مركز الموارد ذبابة الفاكهة فيينا وبلومينغتون ذبابة الفاكهة (NIH P40OD018537) لتوفير سلالات ذبابة الفاكهة. نشكر جاك فرانسين من مركز التصوير الميكروسكوبية لدعم الخبراء في مجال التصوير. وأيد هذه الدراسة من قبل فيدي والمنح TOP (917-96-346، 912-12-109) من المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (NWO)، من قبل اثنين زمالات الدكتوراه المركز الطبي DCN / جامعة رادبود، من قبل العقلية شبكة التخلف الألمانية بتمويل من برنامج NGFN + من الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحوث (BMBF) وGencodys الاتحاد الأوروبي FP7 على نطاق واسع متكامل شبكة (HEALTH-241995) إلى AS. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر، أو في الإعداد للمخطوطة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ImmunostainingDilution
Mouse anti-discs large 1Developmental Studies Hybridoma BankAFFN-DLG1-4D61/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Rabbit anti-horseradish peroxidaseJackson IR323-005-0211/500
Rabbit anti-SynaptotagminGift from Hugo BellenJan-00
Mouse anti-Cysteine string proteinDevelopmental Studies Hybridoma BankDCSP-1(ab49)1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) 
Mouse anti-BruchpilotDevelopmental Studies Hybridoma Banknc82Jan-50
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488Life technologiesA110291/200
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568Life technologiesA110111/500
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling KitThermoFisherZ25006
ProLong Gold Antifade MountantThermoFisherP36930
MaterialCompanyCatalog numberComments
Equipment
Confocal microscope or fluorescence microscopeLeica SP5
Zeiss Axio imager
ComputerMac or Pc
MaterialCompanyCatalog numberComments
Software
FIJI

References

  1. Lin, Y. C., Koleske, A. J. Mechanisms of synapse and dendrite maintenance and their disruption in psychiatric and neurodegenerative disorders. Annu Rev Neurosci. 33, 349-378 (2010).
  2. van Bokhoven, H. Genetic and epigenetic networks in intellectual disabilities. Annu Rev Genet. 45, 81-104 (2011).
  3. Penzes, P., Buonanno, A., Passafaro, M., Sala, C., Sweet, R. A. Developmental vulnerability of synapses and circuits associated with neuropsychiatric disorders. J Neurochem. 126, 165-182 (2013).
  4. Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Influence of dendritic structure on firing pattern in model neocortical neurons. Nature. 382, 363-366 (1996).
  5. Yuste, R., Majewska, A., Holthoff, K. From form to function: calcium compartmentalization in dendritic spines. Nat Neurosci. 3, 653-659 (2000).
  6. Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology. J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).
  7. Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 22, 383-388 (2012).
  8. Mehnert, K. I., Cantera, R. Circadian rhythms in the morphology of neurons in Drosophila. Cell Tissue Res. 344, 381-389 (2011).
  9. Sigrist, S. J., Reiff, D. F., Thiel, P. R., Steinert, J. R., Schuster, C. M. Experience-dependent strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J Neurosci. 23, 6546-6556 (2003).
  10. Ruiz-Canada, C., Budnik, V. Introduction on the use of the Drosophila embryonic/larval neuromuscular junction as a model system to study synapse development and function, and a brief summary of pathfinding and target recognition. Int Rev Neurobiol. 75, 1-31 (2006).
  11. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 647-670 (2013).
  12. Kraut, R., Menon, K., Zinn, K. A gain-of-function screen for genes controlling motor axon guidance and synaptogenesis in Drosophila. Curr Biol. 11, 417-430 (2001).
  13. Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
  14. Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, 729-741 (2002).
  15. Laviolette, M. J., Nunes, P., Peyre, J. B., Aigaki, T., Stewart, B. A. A genetic screen for suppressors of Drosophila NSF2 neuromuscular junction overgrowth. Genetics. 170, 779-792 (2005).
  16. Collins, C. A., Wairkar, Y. P., Johnson, S. L., DiAntonio, A. Highwire restrains synaptic growth by attenuating a MAP kinase signal. Neuron. 51, 57-69 (2006).
  17. Nijhof, B., et al. A New Fiji-Based Algorithm That Systematically Quantifies Nine Synaptic Parameters Provides Insights into Drosophila NMJ Morphometry. PLoS Comput Biol. 12, e1004823(2016).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  19. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. , (2009).
  20. Dubos, A., et al. Conditional depletion of intellectual disability and Parkinsonism candidate gene ATP6AP2 in fly and mouse induces cognitive impairment and neurodegeneration. Hum Mol Genet. 24, 6736-6755 (2015).
  21. Nijhof, B., et al. Drosophila NMJ Morphometrics. , figshare https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399. (2017).
  22. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide IJ 1.46. , http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146-29.html (2014).
  23. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide IJ 1.46. , Available from: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2014).
  24. Pielage, J., et al. A presynaptic giant ankyrin stabilizes the NMJ through regulation of presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58, 195-209 (2008).
  25. Koch, I., et al. Drosophila ankyrin 2 is required for synaptic stability. Neuron. 58, 210-222 (2008).
  26. Iqbal, Z., et al. Homozygous and heterozygous disruptions of ANK3: at the crossroads of neurodevelopmental and psychiatric disorders. Hum Mol Genet. 22, 1960-1970 (2013).
  27. Prokop, A. Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila. Int Rev Neurobiol. 75, 71-90 (2006).
  28. Wan, H. I., et al. Highwire regulates synaptic growth in Drosophila. Neuron. 26, 313-329 (2000).
  29. Shi, L., Fu, A. K., Ip, N. Y. Molecular mechanisms underlying maturation and maintenance of the vertebrate neuromuscular junction. Trends Neurosci. 35, 441-453 (2012).
  30. Sutcliffe, B., Forero, M. G., Zhu, B., Robinson, I. M., Hidalgo, A. Neuron-type specific functions of DNT1, DNT2 and Spz at the Drosophila neuromuscular junction. PLoS One. 8, e75902(2013).
  31. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100(2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

123 NMJ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved