Yüksek throughput ve Çok parametrik Nicelik için iki Algoritmalar<em&gt; Drosophila</em&gt; Nöromusküler Junction Morfoloji

Özet

İki görüntü analiz algoritmaları, "Drosophila NMJ Morfometri" ve "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" otomatik Drosophila nöromüsküler kavşakta (NMJ) dokuz morfolojik özelliklerini ölçmek için, yaratıldı.

Özet

Sinaptik morfolojisi sinaptik etkinlik için sıkı ilişkili olduğu ve birçok durumda morfolojik sinaps kusurları sonuçta sinaptik arızalanmasına yol açar. Drosophila larva nöromuskular (NMJ), glütamaterjik sinapslarda büyük bir köklü model yaygın olarak yıllardır çalışılmıştır. NMJ morfolojik kusurlara neden mutasyonların belirlenmesi sinaps gelişimi ve işlevi düzenleyen genlerin bir repertuarı ortaya çıkardı. Bunların çoğu Drosophila NMJ morfolojik anormallikleri tespit etmek için nitel yaklaşımlar üzerinde duruldu büyük ölçekli çalışmalarda tespit edilmiştir. nitel analizler bir dezavantajı NMJ morfolojisi katkıda birçok ince oyuncu muhtemelen fark edilmeden kalması. nicel analizler ustaca morfolojik farklılıkları tespit etmek için gerekli olan Halbuki onlar zahmetli olduğu için, bu tür analizler henüz yaygın gerçekleştirilen değildir. Bu protokol detay iki görüntü analiz algoritmaları açıklar "Drosophila Drosophila NMJ, kantitatif doğru ve objektif morfometrik analiz Fiji uyumlu makrolar gibi mevcut> NMJ Morfometri" ve 'Drosophila NMJ Bouton Morfometri'. Bu metodoloji, yaygın olarak kullanılan belirteçler ile immunolabeled NMJ terminalleri analiz etmek için geliştirilmiştir Dlg-1 ve . BRP Ayrıca, bu tür Hrp, CSP ve SYT gibi diğer belirteçler onun daha geniş uygulama bu protokolde sunulan makro dokuz morfolojik NMJ özelliklerini değerlendirmek için edebiliyoruz. NMJ alanı, NMJ çevre, bOUTONS sayısı NMJ uzunluk, NMJ en uzun şube uzunluk, adacıkların sayısı, dal sayısı, dallanma noktaları ve NMJ terminali aktif bölgelerin sayısı.

Giriş

Gibi zihinsel engelli, otizm spektrum bozukluğu ve şizofreni gibi bilişsel hastalıklar çoğu zaman anormal sinaptik ^{fonksiyon, 1, 2, 3} ile karakterize edilir. Sinaps morfolojisi ve fonksiyon sıkı iç içe geçmiştir; morfolojik kusurlar sinaptik arızaya neden olabilir ve, tersine, anormal sinaptik transmisyon sinaptik olgunlaşmasını ve şekil ^{4, 5, 6} etkileyecektir.

Model organizmaların bir dizi daha sinaps biyolojisini anlamak ve sinaptik değişiklikler sağlık ve hastalık ^{7, 8, 9} beyin fonksiyonlarını nasıl etkilediğini ışık tutmak amacıyla kullanılmıştır. Drosophila NMJ bir geniş olarak araştırılmış ve glutamaterjik sistem için in vivo model köklünapse biyoloji ^{10, 11.} Geçmiş yıllarda, bu model NMJs arasındaki morfolojik farklılıkları tespit etmek amacıyla, hem de büyük ölçekli genetik ekranlar için, fizyolojik ve gen odaklı çalışmalar için kullanılmıştır. Özellikle, ileri genetik ekranlar sinaps gelişimi altında yatan pek çok önemli regülatörleri ve mekanizmalar tanımlanmış ve ^{12, 13, 14, 15, 16} fonksiyon var. Bununla birlikte, bu ekranların en NMJ terminali morfolojisinin görsel değerlendirme ile ve nitel sinaptik anormalliklerin tespit edilmesi veya birkaç morfolojik özelliklerin yarı-kantitatif puanlama dayanıyordu. Sonuç olarak, insan gözünün olmayan ortada oldukça ince sinaptik morfolojik anormallikler kolayca cevapsız edilir. amacıyla kapsamlı kantitatif farklılıklar tespit edebilmek içinNMJ doğru çıkar morfolojik parametrelerin sistematik olarak ölçmek suretiyle değerlendirilmelidir. elle NMJ özellikleri Ölçme birkaç NMJ ilgi özellikleri ve / veya büyük ölçekli genetik gösterimleri gerçekleştirilirken özellikle olduğunda, zahmetlidir. Multiparametrik, yüksek hacimli morfolojik analizini desteklemek ve objektif ölçümünü elde etmek için, iki makro "Drosophila NMJ Morfometri" ve "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" ¹⁷ geliştirilmiştir. Her iki makro açık kaynak görüntü analiz yazılımı Fiji ¹⁸ çalıştırmak ve her ikisi de aynı odaklı ve nonconfocal görüntüleri ölçmek.

"Drosophila NMJ Morfometri" önlemler büyük 1 postsinaptik işaretleyici disk (DLG-1) ya da presinaptik yaban turpu peroksidaz (HRP) ile immüno-NMJ terminalleri, aktif bölge işaretleyici bruchpilot (BRP) ile birlikte etiketli. Dokuz morfolojik parametrelerle quantifiesters (aşağıda daha ayrıntılı olarak tarif edilmiştir): NMJ alanı, NMJ çevre, BOUTONS sayısı NMJ uzunluğu, NMJ uzun dal uzunluğu, adacıkların sayısı, dal sayısı, dallanma noktaları ve sinaptik terminalden aktif bölgelerin sayısı gibi (Şekil 1) . BOUTONS sayısının belirlenmesi için bir algoritma bu makro mevcut olsa da, doğruluk ¹⁷ kriterlerini karşılamayan. Düzgün BOUTONS sayısını değerlendirmek için, özellikle anti-sinaptotagmin (SYT) ya da anti-Sistein dize protein (CSP) ile boyama NMJ hazırlıklarını kullanarak boutons ölçmek için tasarlanmıştır "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" makro kullanmak için gerekli olan, ve BRP ile birlikte imüno-. "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" makro aşağıdaki parametreleri quantifies: Aktif zo ait BOUTONS sayısını, NMJ bouton alanı, NMJ uzunluğu, NMJ en uzun dal uzunluğu, adaların sayısı, şube sayısını, dallanma noktalarının sayısını ve numarayıaksam (Şekil 2).

Makroları 3 alt makrolar oluşur: (I) "yığın dönüştür" mevcut tüm görüntü dosyalarını tanımlar ve Z-hyperstacks ve her iki kanalın maksimum yoğunluk projeksiyonları oluşturur. çıktısı gibi, bu makro "stack_image_name" ve "flatstack_image_name" denilen sinaps başına iki yeni dosyalar oluşturur. II) "ROI tanımlama" art arda her maksimum projeksiyon görüntüleri "flatstack_image_name" açık ve manüel olarak ilgi çekici bir spesifik sinaptik terminali mevcut olduğu (ROI), bölgeyi tanımlamak için isteğe ile sunacaktır. Bu görüntülerin ¹¹ mevcut olabilir bitişik kas ve / veya (1 olan), sinaptik terminallerinden diğer tip bağlantı sinaps hariç tutulmasına izin uygulanmıştır. (III) "Analiz" tam ROI sınırları içinde görüntülerin tüm bölgelerine analizini otomatik uygular. Gibitüm sayısal ölçüm açıklamalı olacak "results.txt" ve makro tarafından üretilen temel görüntü segmentasyonları izah edilecektir bir "res_image_name.tif": Bu adımın sonucu, kullanıcı iki yeni dosyalar elde edecektir. NMJ anahat, NMJ iskelet ve BRP pozitif aktif bölgelerin sayısı: Görüntü analizi sırasında üç yapılar, her bir sinaptik terminalden elde edilir. NMJ anahat NMJ alan ve çevre belirlemek için kullanılır ve daha sonraki bir havza ayırma BOUTONS sayısını belirtir. İskeletin itibaren beş NMJ özellikler çıkarılabilir gibidir: toplam NMJ uzunluğu, herhangi iki uç noktalarını bağlayan en uzun kesintisiz yolun uzunluğunun toplamı (en uzun dal uzunluğu), NMJ başına bağlantısız bölmeleri sayısını ( "adalar" olarak anılacaktır ), dal sayısı ve dallanma noktaları (bir dallanma noktası üç veya daha fazla dal bağlanır) sayısı. aktif bölgelerinin sayısı, saymak suretiyle BRP-kanal belirlenirBRP pozitif noktalar. (Açıklamalı NMJ hatları (sarı çizgi), NMJ iskelet (mavi çizgi) ve (beyaz odaklar ile gösterilir) BRP pozitif aktif bölgeleri sayısı sonuçları resim görüntülenir ve parametrelerin ölçümleri için işlenir. txt) çıktı dosyası (Şekil 3).

Drosophila NMJ Morfometri" ve 'Drosophila NMJ Bouton Morfometri Drosophila NMJ Morfometri 've 'Drosophila NMJ Bouton Morfometri'' önce tarif edilen ve yaygın olarak Nijhof ve ark. ¹⁷ ile doğrulanmıştır. Bu makale makrolar kullanılarak NMJ morfolojisi analiz etmek için yöntem odaklanır'. Bununla birlikte, makro-destekli analizi öncesinde, NMJ tahlil ve immunostainings Bu önemli adımlardır. gerçekleştirilmesi gereken ve immünohistokimya için kullanılan işaretlerin kombinasyonu makro analizler için uygun olması gerekmektedir. Bu adımlar kısaca açıklanan seBu protokolün ction 1 ve bu prosedürleri gerçekleştirmek için ayrıntılı protokolleri tarif referanslara yönlendirmek.

Protokol

Önceki Görüntü İşlemeye 1. Gereksinimleri

1. Daha önce tarif edildiği gibi ^19, üçüncü instar dolaşan larvası (L3), Drosophila açık bir kitap preparatları gerçekleştirin.
2. Eş immunolabel İki markalama maddesi bir arada kullanarak Drosophila NMJ terminalleri: "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" ²⁰ analiz için BRP ile birlikte "Drosophila NMJ Morfometri" ile analiz için BRP ve SYT veya CSP ile birlikte Dlg-1 ya da HRP.
   Not: aynı türden antikorlar, Zenon Alexa etiketleme kitleri ¹⁷ gibi bir antikor-konjugasyon kiti ile ön etiketleme, bir ile birleştirilebilir.
3. Ile (ya da Apotome olmadan), örneğin bir seçim, floresan veya konfokal mikroskopi bir mikroskop kullanarak görüntü NMJ terminaller.
   1. NMJ terminalin bir 2 kanallı görüntü yığını elde edin.
      1. bir şekilde, mikroskop ayarlarını düzenleme söz konusu kanal 1BRP ile immunolabeled NMJ terminali 2 Dlg-1 (ya da HRP, SYT, CSP) ve kanal ile immunolabeled NMJ terminali elde eder.
      2. İsteğe bağlı olarak, makro ile (tek bir antikor ile immunolabeled sinaps) tek kanallı görüntüleri analiz. Görüntü NMJs "Drosophila NMJ morfometri" veya "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" için SYT veya CSP ile analiz için Dlg-1 veya HRP ile benzersiz immunolabeled.
         NOT: Sadece anti-BRP immünoboyandı sinaps analiz etmek mümkün değildir.
   2. Bireysel' .tiff dosyaları olarak elde görüntüleri aktarın. belirtildiği gibi kazanılmış değilse makro çalıştırmadan önce kanal sırasını ters çevirin.

2. Yazılım Gereksinimleri ve Kurulum

1. Makro indir: "Drosophila NMJ Morfometri" ve "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" Aşağıdaki web sitesinden: https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21.
2. klasörün "Makro güncelleme 1" için imleci hareket ettirin ve görünen seçeneği "görüntüsü" e tıklayın. Bu klasörün içeriği ile bir liste görünür. Klasör makro "Drosophila NMJ Morfometri" ve "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" içerir.
   NOT: Her iki makro da aynı klasörde sağlanır Fiji sürümleri 1.4 ile uyumludur. makrolar son sürümlerinde çalışmayabilir. sağlanan sürüm 1.4 kullanan edin. Mevcut daha yeni Fiji sürümüyle bile bilgisayarlarda, bu sürümü başlatmak için sorunsuzdur.
3. "Tümünü indir" butonuna tıklayın. Klasör içeriği .zip dosyası olarak bilgisayara indirilecek. İndirilen dosyayı açın.
4. Fiji.app/plugins/ dizinine Drosophila _NMJ_Morphometrics.ijm ve Drosophila _NMJ_Bouton Morphometrics.ijm dosyaları kopyalayın. programı yeniden başlatmanız zaman makrolar Eklentiler alt kısmında görünecektirAşağıya doğru açılan menü.

3. Çalışma Alt makro NMJ Görüntüler Z-projeksiyonlar ve Hyperstacks oluşturma "Stack dönüştürme"

1. Açılır menüden "Drosophila NMJ Morfometri" araç çubuğundaki Plugins seçerek grafik arayüzü başlatın ve seçin.
2. makronun grafiksel arayüzde "Eşsiz Dosya Dize" ayarını tanımlayın.
   NOT: mikroskop yazılımı bireysel' .tiff dosyaları olarak yığınlarını saklarken uçakları ve kanalları düzenlemek için bir kimlik imzasını kullanır. Girilen benzersiz dosya dize ayarı birinci kanalın birinci düzleme yazılım tarafından atanan imza belirtmesi gerekir (önemli: düzlem ve kanal numarası ihtiyacı düşük belirtilecektir).
3. sadece alt makro ve "Tamam" ı tıklayın ve resimlerin bulunduğu klasörü seçin "yığın dönüştür" seçeneğini seçin. Birkaç alt klasörler ile bir ana dizin seçilirse, 'bütün bireysel .tiff içinde dosyalarıbenzersiz dosya dize kriterleri ana dizin ve alt klasör işlenecektir.
   1. z yığın tek bir kanal içeriyorsa, kutu "Kanal 1 sadece" seçin.
4. Varsayılan olarak NMJ resim başına iki yeni dosyalar, stack_image_name olarak adlandırılan ve flatstack_image_name görünecektir dikkat edin. Daha fazla analiz için sadece bu yığını ve flatstack saklayın. .tiff dosya serisi gerekli depolama kapasiteleri minimize ve potansiyel hata kaynaklarının kaçınarak, bu noktada silinebilir.

4. Çalışma Alt makro İlgi NMJ Terminali Delineate için "YG'yi tanımla"

1. "Drosophila NMJ Morfometri" nin grafik arayüzü başlatın.
2. "YG'yi tanımla" ve "OK" ve flatstack_name başlıklı görüntüler saklanabilir ve basın "Seç" ana dizin seçin sadece onay kutusunu işaretleyin. alt makro "yatırım getirisi tanımla" otomatik olarak tüm alt klasörler ararSeçilen ana dizin içinde.
3. İlk projeksiyon açar gibi, araç çubuğundaki "Freehand seçimleri" aracını seçin. Fare münhasıran ilgi komple NMJ terminalini içeren bir seçim çizin ve pencere "Terminal tanımla" in "Tamam" ı kullanma. Makro sonraki projeksiyon ile devam edecek.
4. Bir sonraki yatırım getirisi Delineate ve tüm ROI tanımlanır kadar tekrarlayın. "Roi_image_name" adlı YG görüntü dosyası, işlenmiş görüntülerin her biri için önceden oluşturulan yığını ve projeksiyon görüntüleri aynı dizine saklanacaktır. Bu alt makro çıktı siyah arka plan üzerinde beyaz ROI bir ikili resimdir.

"Analiz" 5. Run Alt makro NMJ Terminali Özellikleri belirlememize

1. "Eklentileri" ve kullanımını seçmek, araç çubuğuna gidin:
   "Drosophila _NMJ_Morphometrics" Anti-Dlg-1 ya da anti-HRP (kanal 1) ile imüno-sinaps analizinde birlikteAnti-BRP (kanal 2), ya da "Drosophila _NMJ_Bouton_Morphometrics" BRP ile (kanal 1) ile birlikte anti-SYT ya da anti-CSP ile immunolabeled sinaps analiz ile (kanal 2).
   1. Bir kanal görüntü yığınları analiz edilecek olduğunda ( "Drosophila_ NMJ_Morphometrics" veya SYT veya "Drosophila _NMJ__Bouton_Morphometrics" CSP için yapısal kanal Dlg-1 ya da HRP), kutu "Kanal 1 sadece" seçin.
2. görüntülere karşılık gelen ölçeğini ayarlayın analiz edilecek. görüntüde bir piksel 2.5 um karşılık geliyorsa, um = 2,5 ölçek Piksel = 1, Ölçek mesafe göstermektedir. durumda her iki ayar NMJ alan, çevre, uzunluk ve en uzun dal uzunluğu piksel sayısı olarak ifade edilecektir, 0'dan bırakılır.

3. Gerekirse, makro varsayılan analizi ayarlarını yapın. alt makro "Analiz", sadece ayarlamaları (yetersiz sonuçlarla bu bölümü ve DETE gerçekleştir6. bölümde rmined daha iyi ayarları) işletilmektedir.
4. onay kutularını işaretleyin "Analiz" ve "Bekle" ve "Tamam" tuşuna basın.
   1. 2 kanallı resimlerde alt makro "Analiz" çalıştırırken "Bekle" onay kutusunu seçin. Aksi takdirde, aktif bölge sayımı hatalar nedeniyle sınırlı bilgisayar kapasitelerinin oluşabilir.
5. Yeni bir pencere olarak açılır "Bir Rehber Seç" görüntüleri "select" bulunur ve basın dizini seçin. Uygulanabilir, daha sonraki klasörler (: stack_image_name, flatstack_image_name ve roi_image_name önceki alt makro yürütülmesini üç dosya kullanarak) eğer makro, ana dizinde saklanan tüm görüntüleri analiz etmek ve edecektir. Makro süreçler tek tek ve ardışık her görüntü. Bu (bilgisayar kapasitesine bağlı olarak) görüntü yığını başına birkaç dakika sürebilir.
6. Makro çalıştırdıktan sonra, her biri için yeni bir resim dosyası adında res_image_name analiz dikkat sinaps Crea olacak saklananebeveyn klasörde ted. kantitatif ölçümleri "results.txt" dosya olarak saklanır.
7. algılamak ve segmentasyon hataları ile resim dışlamak için tüm sonuç görüntüleri inceleyin. Olası segmentasyon hataları bu atlatmak için ayarlarını nasıl tavsiye ile birlikte, Tablo 3'te açıklanmıştır. Böyle segmentasyon hataları ile Sonucu görüntüleri Şekil 4'te örnek olarak verilmiştir.
   NOT: kullanıcı arayüzü gözlenen varsayılan ayarlarla makro çalıştırırken, makro değerlendirme manuel değerlendirme ¹⁷ oranla edildiğinde yaklaşık% 95'lik bir doğruluk yoktu.

6. Görseller'e Makro ayarlarını ayarla

1. Görüntülerin% 5'den fazla segmentasyon hataları gösterdiğinizde, / tanımlamak görüntüler için en uygun makro ayarları seçmek için farklı algoritmalar keşfetmek.
2. Yuvarlanan bir top yarıçap değeri ayarlama
   NOT: haddeleme topu yarıçapıfonksiyon resmin arka planını çıkarır. floresan mikroskoplar edinilen görüntülerle çalışırken Bu fonksiyon hayati öneme sahiptir ve / veya görüntüler yüksek arkaplan gürültüsünü varken. arka plan çıkarma NMJ terminallerinin yeterli segmentasyon üretmek için makronun otomatik eşikleme adımlarını yardımcı olacaktır.
   1. Üç NMJ Z projeksiyonlar görüntü veri kümesi temsil eden (alt makro "yığın dönüştürme" tarafından üretilen flatstack_image_name görüntüleri) seçin.
   2. araç kutusunda, Görüntü | Renk | Bölünmüş kanalları. İki görüntü bir kanal 1 ve diğer kanal 2 temsilen oluşturulacaktır.
   3. Dlg-1, HRP, SYT veya CSP immunolabeling tekabül eden, 1 açık kanal ve görüntü kapatarak BRP kanal görüntü atmak ait tek görüntü tutun.
   4. açılır menüden ardından araç çubuğundaki "Süreç" "Çıkar Arka Plan ..." seçerek filtreyi "Çıkar arka plan" çalıştırın.
   5. Pop-up pencere önizleme kutusunu tıklayın ve panel (Şekil 5A')' deki gibi sinaps ve arka plan arasındaki kontrastı arttırmak değere haddeleme top çapındaki ayarlayın.
      NOT: Bir örnek için Şekil 5'e bakınız. Şekil 5A'da' 500 olarak ayarlanmış 'Rolling top yarıçapı' sinaps ve zemin arasında güçlü bir kontrast oluşturmaktadır buna karşın Figure5A olarak, sinaps parçaları, arka plan aynı gri seviyelerinin gösteriyoruz.
   6. yuvarlanan bir top yarıçapı için uygun bir değer tanımlanır, aynı haddeleme top yarıçap değeri ile seçilen Z projeksiyonları "Çıkart arka plan" algoritmasını çalıştırabilir ve (herhangi bir dizin içinde) kaydedin.
      NOT: 8-bit veya RGB görüntüleri için haddeleme topu yarıçap değeri arka planın parçası değil görüntüde büyük nesnenin yarıçapı en az kadar büyük olmalıdır. 16-bit ve 32 bit görüntüler için yarıçap inv edilmelidirpiksel değer aralığı ²² ersely orantılıdır.
3. Kullanılacak farklı bir otomatik eşik belirleme
   1. Önceki adımda (6.2.6) 'de kaydedilen Z-projeksiyonları açın ve Görüntü seçin | ayarlayın | AutoThreshold | Tüm deneyin.
   2. bir ikili eşiklenir sonuç görüntü tüm farklı otomatik eşik algoritmaları ile görünecektir gibi, görüntüler için en uygun algoritmayı belirler.
      1. daha sonra makro çalıştırırken, buna göre makro ayarlarında eşiği değiştirin.
      2. aktif bölgeleri belirlemek üzere "RenyiEntrophy" veya NMJ iskelet belirlemek için NMJ anahat eşiği ve "Li" olarak daha izin eşikler gibi "an" ve "Huang," gibi daha kısıtlayıcı eşik kullanın. görüntüler hiçbir arka plan çok az çabayla çok keskin olduğunda, Aksi sinaps parçaları görüntü segmentasyonu sonra eksik olabilir. NMJ anahat eşiği "olarak "Huang" kullanırlar.
      3. Örnek için, Şekil 5B bakınız. sinapsların Uygun segmentasyon yeşil kutularla vurgulanan otomatik eşikleri ile elde edilir. Uygun olmayan eşikler bazı örnekleri, kırmızı kutular (yüksek büyütmede sinaps kontrol edin) ile vurgulanır. İkinci olarak, sinaps her iki parça eksik veya arka kısımları dahildir. Daha fazla bilgi için 23 başvuru bakın.

4. Küçük parçacıkların en büyük boyutu belirleme
   NOT: Bu fonksiyon analizinden "küçük parçacıklar ayarında" tanımlanan değerden daha küçük olan NMJ anahat eşiği ve İskelet eşiği tarafından algılanan tüm partikülleri hariç tutar. Bu değer, piksel olarak tanımlanır. Bu fonksiyon, bir gürültü filtre olarak işlev görür ve (örneğin, kristaller / toz gibi) tek biçimli bir arka yüksek oranda elde edilen görüntülerin mevcut olduğunda çok yararlıdır.
   1. adımda 6.2.6 kaydedilen Z-projeksiyonlar açın. ve setölçek analiz yoluyla piksel sayısını tespit etmek için | Set Ölçeği. aşağıdaki ayarları uygulanır: mesafe piksel = 1, bilinen bir mesafe = 1, piksel boy oranı = 1, uzunluğu = piksel ve "OK" birimi. araç çubuğundaki "Oval seçim" aracını tıklayın.
   2. Fare kullanma yakından immünoboyamaya mevcuttur ancak NMJ ait olmayan tek parçacıkları çevreleyen bir seçim çizin. Mac kullanıcıları için bir Windows kullanıcı veya cmd + m için Ctrl + m. Bir sonuç pencere piksel sayısı cinsinden seçilen parçacıkların alanı gösteren açılır.
   3. En büyük bulaşıcı partikül / yapay alanı belirlemek için görüntülerin mevcut çok sayıda eşya ile önceki adımı birkaç kez tekrarlayın. Bu daha sonra makro çalışırken ortamda ayarlamak için değer olacaktır. En küçük parçacık boyutu gözlenen irin olarak "küçük tanecikler boyutu" % 25 marj set makro çalıştırırken.
   4. Bir örnek için Şekil 5D bakınız. En büyük kristal algılamaked 112 piksel bir alana sahiptir. 150 - makro ile bu görüntüyü işlerken "Küçük parçacıklar boyut" ayarı, to125 ayarlanmalıdır.

5. Asgari bouton boyutunu belirleme
   NOT: Bu fonksiyon analizinden tanımlanan değerden daha küçük olan NMJ anahat eşiği tarafından tespit edilen tüm boutons hariç tutar. Bu değer, piksel olarak tanımlanır.
   1. Bölüm 6.4 de tarif edildiği gibi, aynı adımları, ancak bu durumda NMJ terminali içinde mevcut küçük BOUTONS çevreleyen bir seçim çizin. Ölçülen olanlardan en küçük bouton tekabül en küçük alanı seçin. Bu daha sonra makro çalışırken asgari bouton boyutu ayarında ayarlamak için değerdir.

6. Define değeri "maxima gürültü toleransı bul"
   1. Bölüm 6.2.1 seçilen Z hyperstacks kullanın.
   2. araç kutusunda, Görüntü | Renk | El kremi ile Bölünmüş kanallarte 2 yığınlarının (kanal 1 ve kanal 2) ve açık BRP kanala karşılık gelen görüntü tutun. kapatarak diğer kanal görüntü atılır.
   3. Süreci seçin açılan menüden eklentileri sekmesine gidin | Maksimum (3D) ve maximum_image_name (birkaç dakika kadar sürebilir) göründüğünde, orijinal görüntü yığınını kapatın.
   4. | Maksimum ... image_name (elde görüntü yığını) seçin ve Eklentileri seçin Süreç | Asgari (3D), Maksimum ... image_name yığını kapatın.
   5. Araç çubuğunda işlem seçin | maxima bul .... Yeni bir pencere "Bul maxima ..." açılacaktır. "... Önizleme noktası seçimi" onay kutusu tıklayın ve küçük haç olarak görüntüde belirtilecektir 50 maxima noktalarını ayarlama varsayılan makro ile "Gürültü tolerans" kutusunu doldurun.
      1. Içinde aktif bölgelerin üstüne değildir açıklamalı aktif bölgeleri, yani haç aşırısını gözlemliyormuş "gürültü toleransı" değerini artırmakarka tespit edilir seçilmiş yığın düzlem ya da yanlış olarak aktif bölgeleri üzerine odaklanır.
         1. Tam olarak aktif bölgeleri açıklamalı gözlemi Diğer taraftan, "Gürültü toleransı" değerini azaltmak, etiketli kabul edilmesi odakta aktif bölgeleri yani. haçlar uygun odakta aktif bölgeleri etiketleme dek bu prosedürü takip farklı değerler çalışırken tutun. Bu değer ile "Bul maxima gürültü toleransı" doldurun.
         2. Bir örnek için Şekil 5C bakınız. Çok fazla aktif bölgeleri tespit edilmiştir. Şekil 5C'de' Yalnızca merkezde aktif bölgeleri tespit edilmiştir.
   6. alt makro tüm önceki adımlarda tanımlanan ayarlarla, adım 5.1 seçilen temsilci görüntüler için "Analiz" çalıştırın.
7. Alt ve üst eşik BRP-puncta ayarlama
   1. Yeni bir dosya m çalıştırdıktan sonra görünen olacak dikkat edinakro göre 6.6 olarak adlandırılan 2_active_zone_stack_image_name adım. Bu resimde, her düzlemde beyaz noktalar ile belirtilmiştir "maxima Bul" fonksiyonu ile tespit aktif bölgeleri yığını.
   2. sürükleyip araç çubuğu basıp Görüntü içine bırakın bu dosyayı açın | Stack | Zproject | Projeksiyon type = Sum dilimleri. 2_active_zone_stack_image_name bir projeksiyonu elde edilecektir.
   3. Resim Seç | ayarlayın | Eşik. Yeni bir pencere "Eşik" açılacaktır. İstenen tüm odaklar / BRP pozitif noktalar kırmızı görselleştirildiği, bir eşik değerini seçmek için üst çubuk kaydırın.
      Not: eşiği çok düşük olması halinde, aktif bölgelerin aşırı sayılır. çok yüksek ayarlarsanız, aktif bölgelerinin bir kısmını özleyeceğiz.
      1. Bir örnek için Şekil 5E bakınız. Eşik 400 ayarlandığında kırmızı (Şekil 5 'de vurgulanan değildir, çünkü (1 piksel odakları olarak sembolize edilen) aktif bölgelerin en segmentasyon dahil değildirE). Eşik değeri 50 ayarlandığında tüm aktif bölgeler kırmızı (Şekil 5E') vurgulanır.
   4. minimum eşik olarak bu değeri tanımlar. Maksimum değeri "Üst puncta eşiği" bırakın.
   5. alt makro Bu bölümün tüm önceki adımlarda tanımlanan ayarlarla temsili görüntüler için "Analiz" yeniden çalıştırın. Kritik çıkan görüntü dosyaları değerlendirmek ve segmentasyon düzgün yapıldığından emin olun. Bu durum söz konusu değilse segmentasyon hataları doğasına (Şekil 4, Tablo 3) 'e göre yeniden ayarlayabilirsiniz.

Sonuçlar

Metin sonuçlar dosyası ana dizinde görünür. Her resim için tüm ölçülen parametreler özetlemektedir. Sonuçlar dosya adı ile bağlantılıdır ve parametreler sonradan Tablo 1 ve 2'de gösterilen sırayla özetlenmiştir.

Res_image_name üç görüntü yığını. ilk görüntü (DLG-1, HRP, SYT veya CSP ile immün) ana hatlarını ve kanal 1 göre makro tarafından belirlenen NMJ terminalinin iskeleti vurgulamaktadır. İkinci resim ilk resmin bir kopyasıdır ve ek olarak şematik odakları olarak kanal 2 tespit edilir tespit BRP pozitif noktaları gösterilmektedir. Üçüncü görüntü tespit BRP pozitif odaklar ile birlikte, ikinci kanalın azami çıkıntı içerir.

NMJ anahat eşik makro çıkış sonuç görüntü sarı temsil edilmektedir. NMJ alanı, perimeter ve BOUTONS sayısı bu eşiğin çıkarılmaktadır.

NMJ iskelet eşiği makro çıktı sonuç görüntüde mavi temsil edilmektedir. noktaları ve adaları dallanma NMJ uzunluğu en uzun dal uzunluğu, dal sayısı, bu eşik saptanır.

NMJ aktif bölgeler eşik makro çıkış sonucu görüntüde temsil edilir. Bu eşik BRP pozitif odak potansiyel makro tarafından karşılaşılabilecek alanı belirler. NMJ anahat eşiği tarafından tanımlanan olandan biraz daha büyük olan bir NMJ alan oluşturmak içindir. Bir çok kısıtlayıcı eşik seçildiğinde, sinaps kenarı boyunca BRP pozitif odak dışı olabilir. Eşik çok keyfi olduğu zaman, arka plan gürültü noktalar (- 2, Şekil 1) BRP pozitif olarak kabul edilebilir.

vALIDA içinTe "Drosophila NMJ Morfometri" makro performansı, daha önce farklı bir NMJ parametreleri sinaptik hatalarını tarif edilmiştir, üç mutant koşullar test edilmiştir. Her bir kusur makro (NMJ anahat, sırasıyla ¹⁷ iskelet veya aktif bölgeleri) tarafından gerçekleştirilen bir farklı görüntü bölütleme prosedür ile tespit edilmiştir. indüklenebilir RNAi tarafından ilgi ve performans diseksiyonlarda ve L3 larva NMJ immün üç gen hedefleme sonra makro çalıştırıldı. Elde edilen NMJ morfolojik ölçümler daha sonra bir t-testi kullanılarak karşılaştırılmıştır (kontrole göre RNAi) çiftler halinde edildi. Her üç durumda da, istatistiksel farklar mutantlar ve daha önce bildirilen morfolojik kusurları olan uyum içindedir parametrelerini etkileyen kontroller arasında bulundu. Bu makro gerçekten yeterince Drosophila NMJ önce açıklanan kusurları tespit edebiliyoruz onaylar.

Ankirin 2 (Ank2, CG42734) mutantları kaynaşık BOUTONS ve daha küçük NMJs içeren sinaptik morfoloji kusurları gösterdiği bilinmektedir. Bu kusurlar, Ank2 mutantlar ^{24, 25} için gözlendi ve Ank2 demonte ²⁶ gider. Pan-nöronal Ank2- RNAi demonte sinekler NMJ terminalleri t-testi, p = 2.18 (a; UAS Dicer-2 / UAS Ank2 RNAi KK107238; elav-Gal4 / +) önemli ölçüde daha küçük NMJ alan gösterdi (= 339,25 um ² anlamına x 10 ^{~ 8)} ve çevre (ortalama = 238,24 um, t-testi, p = 1.82 x 10 ^3), ağırlık genetik arka plan kontrol veri kümesi (göre, UAS Dicer-2 / UAS KK60100; elav-Gal4 / + () = 451,95 um ² ortalama ve "Drosophila NMJ Morfometri" (Şekil 6A ve Şekil 4B) çalıştırdıktan sonra = 288,62 um, sırasıyla) anlamına gelir.

GTPaz Rab3 (CG7576) doğru bruchpilot dağılımı için gereklidir ve rup mutantı aktif bölgeleri ²⁷ önemli ölçüde azaltılmış bir sayısı ile sunulur. Aktif bölgelerin sayısındaki önemli bir azalma gözlenmemiştir Pan-nöronal Rab3 yok etme sinekler (w NMJ terminallerinde "Drosophila NMJ Morfometri" makro tarafından BRP pozitif odakları ölçülmesi; UAS Dicer-2 / UAS RNAi KK100787; elav -Gal4). Rab3 -RNAi içinde NMJ terminali başına aktif bölgelerin ortalama sayısı kontrol veri kümesi (/ +) t-testi s tespit 290 = 4.43 x 10 ^-29) (Şekil 6A ve 4C) aksine 138 idi.

Highwire (hiw, CG32592) NMJ büyümenin önemli bir düzenleyicisi olduğu; hiw genindeki mutasyonlann taşması ve NMJ terminaller ²⁸ arasında dallanma uzatılmış için. Pan-nöronal HIW -RNAi yok etme hattı (w NMJ terminalleri ölçülmesi; UAS-Dicer-2 / UAS RNAi GD36085; elav-Gal4 / +) "Drosophila NMJ Morfometri" ile, önemli farklılıklar iskelet türetilmiş parametreler gözlenmiştir: uzunluk (= 147.36 um ortalama t; kontrol grubu = 122.07 um ortalama kontrol ortalama = 105.65 um; testinde gösterilebilir p = 7.31 ^10-7), en uzun dal uzunluğu (= 122,19 um ortalama x t-testi, p = 4.62 x 10 ^-4) dalları (= 7.69 ortalama sayısı, ortalama kontrol = 5.74; t-testi, p = 2.52 x 10 ~ ²⁾ ile dallanma noktaları (= 2.73 ortalama sayısı, ortalama kontrol = 1.79; t-testi, p = 3.31 x 10 ~ ^2). Tüm bu parametreler anlamlı bir artış (120-180%) genetik altyapı kontroller ile karşılaştırıldığında (a; UAS Dicer-2 / UAS GD60000; elav-Gal4 / +) (Şekil 6A ve 4D).

Şekil 1: Drosophila _NMJ_Morphometrics Drosophi 9 parametreleri ölçerla NMJ. Solda Dlg-1 ve BRP Apotome ile bir floresan mikroskobu ile görüntülenen NMJ terminalleri, imüno vardır. Sağda "Drosophila NMJ Morfometri" çalıştırdıktan sonra sonuç görüntülerdir. Parametreler alan, çevre ve boutons belirtilen makro açıklamalı sarı anahat tarafından temsil edilmektedir. Parametreler uzunluğu en uzun dal uzunluğu (LBL), dallar, dallanma noktaları ve adalar makro açıklamalı mavi anahat tarafından sunulmaktadır. BRP-imüno-odakları (aktif bölgeleri) sonucu görüntülerde beyaz lekeler olarak makro ile temsil edilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 2: Drosophila NMJ Bouton Morfometri Drosophila NMJ 8 parametreleri ölçer. SoldakiSYT-1 ve BRP Apotome ile bir floresan mikroskobu ile görüntülenen, NMJ terminali imüno vardır. Sağda "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" çalıştırdıktan sonra sonuç görüntülerdir. Parametreler boutons ve bouton alan makro açıklamalı sarı anahat tarafından temsil edilmektedir. Parametreler uzunluğu en uzun dal uzunluğu (LBL), dallar, dallanma noktaları ve adalar makro açıklamalı mavi anahat tarafından sunulmaktadır. BRP-imüno-odakları (aktif bölgeleri) sonucu görüntülerde beyaz lekeler olarak makro ile temsil edilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 3: Drosophila NMJ Morfometri ve Drosophila NMJ Bouton Morfometri makrolar Temsil Akış Şeması. İlk alt makro "t dönüştürmeYığın o" görüntüsü NMJs projeksiyonları ve hyperstacks yaratır. İkinci alt makro '' çıkar NMJ terminalinin yerini tanımlayan manuel giriş gerektirir. Üç alt makro, 'yatırım getirisi tanımla Analiz', önlemler tüm NMJ parametrelerini. Bir metin nicel değerlere ve parametre sınırlandırılmasını gösteren bir sonuç görüntü dosyasını içeren dosya makro performansın kullanıcının değerlendirmesini yardımcı olmak oluşturulur. görüntüleri farklı koşullarda yakalandığı zaman, makro ayarların test ve doğru analiz sağlamak için ayarlanması gerekir. lütfen tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.

Şekil 4: Sakıncalı makro Bölümleme Sonuçlar örnekler. "Drosophila NMJ Morphometr çalıştırdıktan sonra Sonucu görüntüleriics" veya 'Drosophila NMJ Bouton Morfometri'. sinaptik terminalden parçaları sarı anahat (A) dahil edilmemiştir. arka planın parçaları sarı anahat (B) sinaptik terminalden dahildir. Mavi iskelet hattı ötesine uzanır sinaptik terminali. (Cı - D), çok sayıda aktif bölgeleri tespit edilir (E - E ') (. Bazı aktif bölgeler analiz G - G) tarafından farkedilmez.'. aktif bölgeler sinaps (F) Hatalı bouton bölütleme dışında tespit edilir (Drosophila NMJ Bouton Morfometri çalıştırırken uygundur), boutons (H) eksik olan ya da çok fazla boutons bölütleme (I) ile tespit edilir. bölütleme içerdiği arka parçası olan partiküller bir kristal ya da toz (J) . bu hataları önlemek için ayarları nasıl değiştirileceği Bilgi Tablo 3'te verilmektedir Rong. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 5: Makro-ayar Düzenlemeleri ve Görüntü Segmentasyon için Onların Sonuçlarının örnekler. "Yuvarlanan Top yarıçapı", 20 (A) ya da 500 (A') olarak ayarlandığında, (A), Apotome ile bir floresan mikroskobu görüntülenmiş bir Dlg-1 imüno-sinaps, arka plan önizleme çıkartın. (B) Çıktı Resmi çalıştırdıktan sonra elde edilen görüntüler | ayarlayın | Otomatik Eşik | 16 farklı bir otomatik eşik algoritmasıyla elde edilen görüntü segmentlerini göstermektedir tüm görüntü deneyin. 50 (C) ve 500 (C') kısmındaki "Gürültü tolerans" kurarken (C) önizleme "Maxima bul"; ACbölütleme ile tespit edilir tive bölgeleri küçük bir çarpı ile etiketlenir. Konfokal mikroskop görüntüsü, anti-HRP ile immunolabeled bir sinaps, görüntü arka görünen "küçük parçacıklar" (D) ölçülmesi. (E) "Miktar dilimleri" çıkıntı 2_active_zone_stack_ima-ge_name elde edilen. Eşik 400 (E) ve 50 (E ')' de yer almaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 6: Dlg-1 ve BRP ile "Drosophila NMJ Morfometri" makro çalıştırdıktan sonra kas 4. (A) için sonuçlar görüntülerde NMJs makro Değerlendirme ve miktarının belirlenmesi NMJ terminalleri imüno. Parametreler alan, çevre ve boutons makro açıklamalı sarı anahat tarafından temsil edilmektedir. Parametreler uzunluğu en uzun dal uzunluğu (LBL), dallar, dallanma noktaları ve adalar makro açıklamalı mavi anahat tarafından sunulmaktadır. BRP-imüno-odakları (aktif bölgeleri) sonucu görüntülerde beyaz lekeler olarak makro ile temsil edilmektedir. ölçek çubuğu 20 um gösterir. (B) Ankyrin2 RNAi sergilediğini küçük NMJ alanı demonte ve çevre genetik arka plan kontrol grubu ile karşılaştırıldığında. (C) Rab3 yok etme genetik altyapı kontroller ile karşılaştırıldığında BRP pozitif aktif bölgeleri daha düşük bir sayıda NMJs sonuçlandı. (D) Highwire yok etme daha fazla dallanmış ve genetik arka plan kontrol NMJs göre NMJ terminali başına dallanma noktaları daha yüksek uzun dal uzunluğu, uzun sonuçlanmıştır. Hata çubukları, SEM göstermektedir ** p <0.01, iki kuyruklu t-testi. He tıklayınBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için yeniden.

Parametre	NMJ yapısı	açıklama
Alan (um2)	NMJ anahat	tam etiketli NMJ alanı
Çevre (um)	NMJ anahat	alanına ait çevre
#Boutons	NMJ anahat	NMJ sinaptik BOUTONS ( 'bir ipe incileri') sayısı
Uzunluk (um)	iskelet	Tam NMJ terminalinin toplam uzunluğu
En uzun dal uzunluğu (um)	iskelet	NMJ herhangi iki uç noktayı bağlayan en uzun sürekli yol uzunluğu toplamı
#Branches	iskelet	dalların toplam sayısı
#Branching noktaları	iskelet	dallanma noktalarının sayısı (birkaç dalları bir dallanma noktasından türetmek)
#Islands	iskelet	olmayan bağlı Dlg1 pozitif sinaptik bölmelerin sayısı (ya da diğer herhangi bir boyama)
#Active bölgeler	BRP pozitif noktalar	BRP boyama göre aktif bölgelerinin sayısı,

Tablo 1: "Drosophila NMJ Morfometri" tarafından Ölçülen NMJ parametreler. "Drosophila NMJ Morfometri" makro ile ölçülen NMJ parametreler bu tabloda açıklanan emirlerini, elde edilen metin dosyasında bir liste olarak görünecektir. Bu tablo, Nijhof ve diğerleri arasından yeniden yazdırılır. ¹⁷

Parametre	NMJ yapısı	açıklama
Boutons	NMJ anahat	NMJ sinaptik BOUTONS ( 'bir ipe incileri') sayısı
Bouton alanı	NMJ anahat	Tüm BOUTONS toplam alanı
Uzunluk (um)	iskelet	Tam NMJ terminalinin toplam uzunluğu
En uzun dal uzunluğu (um)	iskelet	NMJ herhangi iki uç noktasını birleştiren en uzun sürekli yol uzunluğu toplamı
#Branches	iskelet	dalların toplam sayısı
#Branching noktaları	iskelet	thdallanma noktalarının e (birden fazla dallar bir dallanma noktasından türetmek)
#Islands	iskelet	olmayan bağlı Dlg1 pozitif sinaptik bölmelerin sayısı (ya da diğer herhangi bir boyama)
#Active bölgeler	BRP pozitif noktalar	BRP boyama göre aktif bölgelerinin sayısı,

Tablo 2: "Drosophila NMJ Bouton Morfometri" tarafından Ölçülen NMJ parametreler. "Drosophila _Bouton_NMJ_Morphometrics" makro ile ölçülen NMJ parametreler bu tabloda açıklanan emirlerini, elde edilen metin dosyasında bir liste olarak görünecektir. Bu tablo, Nijhof ve diğerleri arasından yeniden yazdırılır. ¹⁷

segmantasyon	Görünen hataları	Örnek	Gerekli ayarlamalar
NMJ Alan ve (sonuç görüntüde sarı anahat tarafından Temsil) çevre	sinaptik terminal parçaları ya sarı anahat veya arka kısımlarında dahil değildir sarı özetlenen sinaptik terminalden dahildir.	Şekil 5A-B	'Yuvarlanan Top Radius' değerini ayarlayın. bölüm 6.1.	'NMJ anahat eşiğini' ayarlayın. Bak bölüm 6.2.
NMJ uzunluğu ile ilgili parametreler (sonuçlar görüntüde mavi iskelet hattı ile Temsil)	Mavi iskelet hattı ötesine uzanır veya tüm sinaptik terminalden birlikte mevcut değildir ya da.	Şekil 5C-D	'Yuvarlanan Top Radius' değerini ayarlayın. bölüm 6.1.	'NMJ anahat eşiğini' ayarlayın. Bak bölüm 6.2.
(Sonuçlar görüntüdeki noktalar ile temsil) BRP-pozitif puncta	Çok fazla aktif bölgeleri tespit edilmiştir.	Şekil 5E-E'	'Maxima gürültü toleransı Bul' değerini azaltın. bölüm 6.5.
(Sonuçlar görüntüdeki noktalar ile temsil) BRP-pozitif puncta	Aktif bölgeler analizi ile eksik.	Şekil 5G-G' dir	'Maxima gürültü toleransı Bul' değerini artırın. bölüm 6.5.	'BRP-puncta alt eşik' azaltın. Bölüm 6.6 bakınız.
(Sonuçlar görüntüdeki noktalar ile temsil) BRP-pozitif puncta	Aktif bölge eserler sinaptik terminalden dışında tespit edilir.	Şekil 5F	'Etkin Bölge eşik' bölümüne 6.2 ayarlayın.	'BRP-puncta alt eşiğini' arttırın. Bölüm 6.6 bakınız.
Küçük parçacıklar	arka parçası olan bir kristal ya da toz gibi partiküller segmentasyon dahil görünmektedir.	Şekil 5J	'Küçük parçacıkları Kaldır' kutusunu işaretleyin. bölüm 6.3 bakınız.	Küçük parçacıkları en büyük boyutu belirler. bölüm 6.3 bakınız.
Bouton segmentasyon	(Drosophila NMJ Bouton Morfometri Sadece uygulanabilir; bouton segmentasyon için Drosophila NMJ Morfometri kullanmayın) Yanlış bouton segmentasyon.	Şekil 5H-I	'NMJ anahat eşiğini' ayarlayın. bölüm 6.1.	'Asgari bouton boyutunu' belirleyin. bölüm 6.4.

Tablo 3: makrolar Yapımcı edilebilir Görüntü Bölümlemenin Hataların Değişik Türlü Kılavuzu Sorun Giderme. Bu tablo farklı türde açıklarmakrolar tarafından üretilen görüntü segmentasyon hataları. Bunlar kolayca sonuçları görüntülerde tespit edilebilir. Her hata türünün örnekleri arasında, Şekil 4'te gösterilmiştir. Tablonun "düzenleme bölümünde" olarak ayarlanması gerekebilir ayarları vurgulanır ve kullanıcı bu ayarları nasıl tarif 6. bölümde kritik alt-aşama olan anılır.

Tartışmalar

"Drosophila NMJ Morfometri" ve "Drosophila NMJ bouton Morfometri" sinaps morfolojiyi değerlendiren ilgilenen araştırmacılar için güçlü araçlardır. NMJ parametrelerin Manuel değerlendirme zahmetli olduğu; o makroları 15 dakika için deneyimli bir araştırmacı biriktirmek olacağı tahmin edilmektedir / NMJ manuel görüntü segmentasyonu üzerine geçirdi. koşul veya genotip başına değerlendirilen sinapsların bir ila iki onlarca ile bu hızla bile küçük ölçekli çalışmalarda, kaydedilen zaman ciddi miktarda özetliyor. büyük ekranlar gerçekleştirirken, el değerlendirmesi ve ölçümü ile karşılaştırıldığında, yüksek hacimli bir analiz kullanılarak kazancı, büyük olabilir. artan bir çıktı ile ek olarak, makro kolaylıkla objektif bir analiz sağlanır; aksi takdirde kör deneyleri yanı sıra birden fazla araştırmacı analiz dahil ortaya kişilerarası farklılıkları gerektiren kişisel önyargıları dahil değildir. Son olarak, makro hassas ve doğru bir sağlamaktırDramatik NMJ kusurları ziyade ince yol ve bugüne kadar araştırmacının gözle hesaba katılmayan kalmıştır sinaptik düzenleyiciler tanımlanmasına izin NMJ özelliklerinden alysis. Doğrulama prosedürleri ve makrolar kullanılan algoritmalar ile ilgili ayrıntılı bilgiler yayın Nijhof ve diğerleri bulunur. ^17.

Makrolar işlevselliği uygun Daha sonra kas 4. Drosophila melanogaster NMJs morfolojik özellikleri ölçmek için doğrulanmıştır, bu makrolar da bu organizma diğer kaslarda sinaps analiz etmek için uygun olduğu gösterilmiştir. Makro, diğer Drosophila türleri ve ayrıca böcekler dahil olmak üzere, diğer türler, içindeki yapı ile NMJ morfolojik parametrelerin ölçülmesi için kullanılabilir olması muhtemeldir. Evriminde çok uzak olsa NMJs, örneğin farelerin NMJs, oldukça benzer bir yapısal şekle göstermek ²⁹. makrolar diğer türlerden NMJ hazırlıklar üzerinde test edilmemiştir ancak potansiyel kullanıcılar bu tür amaçlar için makro sınamak için teşvik edilir.

Kullanıcı / tanımlamak görüntüler için en uygun makro ayarları seçmek için farklı bir otomatik eşikleri ve algoritmalar araştırıyor çok önemlidir. Makro değerlendirme kılavuzu değerlendirmeye kıyaslandığında Bu ayarlarla, yaklaşık% 95'lik bir doğruluk elde edilir. Makro ayarlarını yapma düzgün segmenti görüntülerin% 100 çok zahmetli ve hatta imkansız bir prosedür olabilir için. sayıları% 5'in altındadır nedenle, düzgün segmentli olmayan görüntülerin dışlama önerilir. Görüntülerin kalitesi düşükse Açıkça, makrolar yetersiz görüntü segmentasyon daha yüksek bir oranda üretecektir. Düşük kaliteli görüntüler benzer manuel değerlendirmeyi etkileyecektir ve bu nedenle makro performansı ile bağlantılı olamaz. bunların resim için tasarlanmış gibi Yine makro oldukça sağlamdıryüksek içerik mikroskop ¹⁷ (örneklerin çok sayıda görüntüleme sağlayan otomatik bir floresan mikroskop) oluşturulan s.

Bir kritik nokta kullanıcı görsel makrolar tarafından oluşturulan tüm sonuç görüntüleri inceler olmasıdır. Bu algılamak ve yetersiz segmentasyon ile resim dışlamak için izin verecektir. Bu protokol bölüm 6, kullanıcı "Analiz" alt makro çalıştırırken doğru görüntü segmentasyon için ayarlarını nasıl yönlendirilir. hızla makrolar gereklerine ve nasıl makro ayarları "makro ayarlarını Examples_adjusting" adlı bir klasör ayarlamak için birlikte alıştırmak için makro depo https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a dahildir. örnekler (içeriği yüksek / eş odaklı / floresans mikroskobu) farklı mikroskop platformlarda elde edilen görüntüler ve farklı immunostainings sahip on üç alt klasörler her biri verilmiştir. PDF başlıklı “Örnekler rehber” Aynı dahildirHer örnek için gerekli ayarları beklenen sonuçları ve sonuçları görüntüler sağlayan bir metin belgesi ile birlikte temin edilmektedir klasörü.

makrolar .tiff dosyaları ayrılmış olarak kaydedilen görüntüleri işlemek için tasarlanmış, yine de bazı kullanıcılar farklı bir biçimde kendi görüntüleri kurtarmış olabilir. Ve ayrıntılı talimatlar belge "Örnekler Kılavuzu" nasıl makro içine görüntüleri aktarmak için - Aşağıdaki web sitesi https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a ²¹ üç örnek dosyaları (3 Örnek 1) "Drosophila NMJ" adlı bir klasör içeriyor .tiff ayrı dosyalar olarak saklanır değilse de aynı klasörde bulunabilir.

NMJ alanı, NMJ çevre, BOUTONS sayısı NMJ bouton alanı, NMJ uzunluk, NMJ en uzun dal uzunluğu, Isla sayısı: Birlikte, "Drosophila NMJ Morfometri" ve "Drosophila NMJ bouton Morfometri" makro on farklı NMJ özelliklerini ölçmekNDS, dal sayısı, dallanma noktalarının sayısı ve aktif bölgelerin sayısıdır. Bu yalnızca bir veya birkaç sinaptik özellikleri ^{30, 31} değerlendirebilir şimdiye kadar mevcut araçlar üzerinde büyük bir avantaj sağlamaktadır. Multiparametrik nicel analiz sinaps biyoloji sayısız yönleri kadar birini kontrol roman düzenleyicileri tanımlamak için yeni keşifler, örneğin için büyük bir potansiyele taşımaktadır. Ayrıca, tam olarak aynı veya üst üste NMJ özellikleri coregulate ve böylece, ortak moleküler yollarla çalışma olasılığı olan genleri belirlemek için gerekli çözünürlüğü sağlar. Son olarak, sinaptik parametreler genler, koordine morfometrik korelasyon temin istifin bozulmadığı koşullar ¹⁷ ve birbirleriyle ilişkili ne kadar farklı araştırmak için ihtimalini açmaktadır.

Birlikte ele alındığında, bu protokol "Drosophila NMJ Morfometri" iki makro nasıl kullanılacağı gösterilmektedir veYüksek verimli bir şekilde on morfolojik NMJ özelliklerinin objektif ve duyarlı kantifikasyonunu gerçekleştirmek "Drosophila NMJ Bouton Morfometri".

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining			Dilution
Mouse anti-discs large 1	Developmental Studies Hybridoma Bank	AFFN-DLG1-4D6	1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Rabbit anti-horseradish peroxidase	Jackson IR	323-005-021	1/500
Rabbit anti-Synaptotagmin	Gift from Hugo Bellen		Jan-00
Mouse anti-Cysteine string protein	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCSP-1(ab49)	1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Mouse anti-Bruchpilot	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Jan-50
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Life technologies	A11029	1/200
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Life technologies	A11011	1/500
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit	ThermoFisher	Z25006
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36930
Material	Company	Catalog number	Comments
Equipment
Confocal microscope or fluorescence microscope	Leica SP5
Zeiss Axio imager
Computer	Mac or Pc
Material	Company	Catalog number	Comments
Software
FIJI