في فيفو التصوير التعبير المعدلة وراثيا الجينات في الفرد الشبكية الأسلاف في الجنين اسماك الزرد همي لدراسة الخلية التأثيرات Nonautonomous

Summary

تتبع الحية الفردية الأسلاف شبكية العين WT في خلفيات وراثية متميزة يسمح لتقييم مساهمة الخلية إشارات غير المتمتعة بالحكم الذاتي خلال تكوين الخلايا العصبية. هنا، واستخدمت مجموعة من إسقاط الموروثة، وتوليد الوهم عن طريق زرع الجنين وفي الجسم الحي الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر لهذا الغرض.

Abstract

جعلت القوة الوراثية والتقنية الفقاريات الزرد نموذج كائن أساسي في أي عواقب التلاعب الجيني يمكن أن تعزى في الجسم الحي خلال الفترة الإنمائية السريعة. عمليات متعددة يمكن دراستها بما في ذلك تكاثر الخلايا، التعبير الجيني، هجرة الخلايا والتشكل. والأهم من ذلك الجيل من الوهم من خلال زرع يمكن أداؤها بسهولة، مما يتيح وضع العلامات الفسيفساء وتتبع الخلايا الفردية تحت تأثير البيئة المضيفة. على سبيل المثال، من خلال الجمع بين التلاعب وظيفية جينات الجنين المضيف (على سبيل المثال، من خلال حقن مكروي morpholino) والتصوير الحي، وآثار خارجي، إشارات الخلية nonautonomous (التي تقدمها البيئة المعدلة وراثيا) على الخلايا المانحة زرع الفردية يمكن تقييمها. نحن هنا لشرح كيفية استخدام هذا النهج لمقارنة بداية من التعبير التحوير الفلورسنت كوكيل لتوقيت determin مصير الخليةأوجه في مختلف البيئات المضيف الجيني.

في هذه المقالة، ونحن نقدم بروتوكول للmicroinjecting الأجنة الزرد بمناسبة الخلايا المانحة، ويسبب ضربة قاضية الجينات في الأجنة المضيفة، وصفا للتقنية زرع استخدامها لتوليد أجنة خيالية، وبروتوكول لإعداد وتشغيل في الجسم الحي متحد البؤر الوقت الفاصل تصوير الأجنة المتعددة. على وجه الخصوص، وأداء التصوير العديد من المواقع من الأهمية بمكان عند المقارنة بين توقيت الأحداث مثل ظهور التعبير الجيني. وهذا يتطلب جمع البيانات من السيطرة متعددة والأجنة التجريبية معالجتها في وقت واحد. يمكن بسهولة أن يمتد هذا النهج للدراسات التأثيرات خارجي في أي عضو أو نسيج من خيار للوصول للعيش التصوير، شريطة أن زرع يمكن استهداف بسهولة وفقا لخرائط مصير الجنينية المعمول بها.

Introduction

وقد ساهم القدرة على تصور العمليات التنموية الهامة في الفقاريات في الجسم الحي لجعل الزرد نموذجا أساسيا لدراسة الظروف العادية والمرض (إعادة النظر في ^{1 و 2).} على وجه الخصوص، الشبكية العصبية هي جزء لا يمكن الوصول إليها من الجهاز العصبي المركزي. شبكية العين يفسح المجال لسهولة إجراء دراسات من الخلايا العصبية بسبب، بعد بنية بسيطة نسبيا درجة عالية من التنظيم لها، وأنواع الخلايا العصبية الحفظ جدا في جميع أنحاء نوعا من الفقاريات ^3. يمكن اتباعها ديناميات السلوكيات الخلوية مثل انتشار الأسلحة النووية، خروج دورة الخلية، انقسام الخلايا غير المتماثلة، مواصفات مصير، والتمايز، وتشكيل الدوائر العصبية في جميع أنحاء العملية برمتها من retinogenesis، التي أنجزت في الشبكية المركزية للالزرد بنسبة 3 د postfertilization ( DPF) ^{4، 5،}المرجع "> 6 ^{و 7.}

وعلاوة على ذلك، فإن المتطلبات الوظيفية من الجينات المختلفة في كل مرحلة من المراحل المذكورة أعلاه يمكن تقييم متزامنة في شبكية العين الزرد، وتوفير ميزة على نماذج الفقاريات الأخرى التي الظواهر الناتجة عن تطبيق تقنيات خروج المغلوب الجينات يمكن تقييمها إلا بعد تشريح الجثة الثابتة الأنسجة. على وجه الخصوص، واستخدام خطوط المعدلة وراثيا التي يمكننا تصور ورصد التعبير من البروتينات الفلورية كما الجينات المحورة مراسل في شبكية العين، ويسمح لنا للحصول على قرار الزمني في التعبير الجيني الذي يكمن وراء نشأة معين نوع من الخلايا العصبية. نظرا للتطور السريع في الزرد، ويمكن تصور هذه الأحداث خلال الفترة التنموية برمتها، وبالتالي توفير رؤية أعمق في أهمية الزمانية في التعبير الجيني فيما يتعلق اكتساب هوية الخلايا العصبية وسلوك الخلية.

وأخيرا، هذه الأساليب يمكن الجمع بين الكفاءة في الزرد مع جيل من الوهم عن طريق زرع، مما أدى إلى نظرة ثاقبة جانبين رئيسيين من وظيفة الجين. أولا، ودراسة الخلايا المزروعة من جنين المانحة، الذي كان يطرق على جين معين أسفل في حين أنها تتطور في بيئة نوع البرية غير المسماة، ويسمح لنا للحصول على المعلومات ذات الصلة حول وظيفة الجين بطريقة خلية مستقلة. وهذا يؤدي إلى معلومات هامة عن وظيفة العوامل مصير المحدد الشبكية داخل الخلايا الاولية يعبر عنها عادة. وهذا ما يتضح من فحص نتائج مصير التنموية من الأسلاف التي لم تعد قادرة على توليد البروتين وظيفية من هذه الجينات ^{4، 6، 8، 9.} باستخدام هذا النهج، ونحن قد أظهرت أن العوامل المحددة العديد من مصير (على سبيل المثال، Vsx1، Atoh7، Ptf1a، Barhl2) تعمل خلية-autonomously لدفع مصير الخلايا العصبية للشبكية محددة؛ عدم التعبير الجيني يؤدي في المقام الأول إلى تبديل القدر، بحيث الخلايا مع الجينات ضربة قاضية لا تزال قابلة للحياة من خلال تبني خلية مصير بديل ^{4، 6، 7، 10.} ثانيا، مثل هذه التجارب خيالية يمكن استخدامها لتقييم مدى البرية تتصرف نوع الأسلاف عندما تعمل على تطوير ضمن بيئات وراثية مختلفة. على سبيل المثال، عن طريق مقارنة تطوير خلايا WT التي عادة ما تعبر عن الجين (والتحوير مراسل) في WT مقابل البيئة المضيفة التلاعب (على سبيل المثال، بالضربة القاضية جين / ضربة قاضية)، والآثار الناجمة على التعبير الجيني ومصير خلية يمكن تقييم . عدم وجود أنواع معينة من الخلايا العصبية في بيئة المضيف، على سبيل المثال، فقد تبين للتأثير على سلوك السلف النوع البري في خلية بطريقة غير المتمتعة بالحكم الذاتي، إلى التحيز لهم نحو التفريق في س ممثلة تمثيلا ناقصاص المفقودين أنواع الخلايا العصبية ^{4، 7، 11، 12.} وبالنظر إلى أن الخلايا العصبية للشبكية ولدت في ترتيب histogenic يصونها بالتتابع التعبير توقيت الجينات مصير المحدد العصبية محددة (التعبير الجيني مصير) (إعادة النظر في ^13)، استخدمنا هذه الطرق لشرح كيفية وتوقيت التعبير مصير الجيني في الأسلاف نوع البرية يتأثر عندما تتطور هذه الأسلاف في البيئات الشبكية المضيفة مع التراكيب الخلوية الشاذة التي يسببها. هنا، ونحن الخطوط العريضة لهذه النهج كدليل لكيفية الجمع بين تقنيات قياسية نسبيا، وتستخدم على نطاق واسع يمكن النظر في توقيت التعبير الجيني مصير في تطوير الأسلاف شبكية العين ^{8 و 9.}

يصف هذا البروتوكول نهج تجريبي يجمع الوقت الفاصل بين التصوير مع سهولة فيتشكيل زرع في الجسم الحي السابقين تطوير الجنين الزرد لمتابعة mosaically الفردية الخلايا المسمى طوال فترة من retinogenesis التنموية. عن طريق أداء التلاعب الجيني وظيفية سواء في الجنين المضيف، الجنين المانحة، على حد سواء أو لا، يمكن للمرء أن تقييم الحكم الذاتي خلية من وظيفة الجين. ويمكن تكييف هذا النهج على نطاق واسع على أسئلة بحوث مماثلة في أي نظام آخر والتي المكونات الفردية المذكورة هنا هي مناسبة.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لأحكام مجلس البحوث الطبية الصحية الوطنية ورمز الاسترالية لممارسة لرعاية واستخدام الحيوانات وتمت الموافقة من قبل لجان الأخلاقيات المؤسسية.

1. إعداد الزرد

1. الاقتران الأسماك الكبار
   1. إعداد الأسماك البالغة كما أزواج (أو اثنين من أزواج) في خزانات تربية بحجم مناسب المساء قبل استخدامها.
   2. للحفاظ على الأنثى فصلها عن الذكور، واستخدام مقسم إلى تمكين السمك لنرى، ولكن لا تلمس بعضها البعض.
   3. في الصباح، وبعد تبديل على ضوء ذلك، إزالة فواصل والسماح الأسماك للتزاوج دون عائق.
   4. بعد وضع التزاوج الناجح الأسماك البالغة بالعودة الى دباباتهم الأصلية.
      ملاحظة: المضيفة والمانحة سلالات قد تكون هي نفسها، على سبيل المثال، أي نوع البرية (WT) السلالات. لهذه الدراسة الأجنة المانحة المستمدة من خطوط المعدلة وراثيا تيراغرام (atoh7: gapRFP)، تيراغرام (atoh7: gapGFP) أوTG (vsx1: GFP) التي التعبير عن العوامل مصير المحدد القيادة في وقت مبكر أو يمكن تصور مصير العصبي في وقت متأخر، على التوالي ^{14 و 15 و 16.} من أجل مقارنة آثار اختلاف البيئات الوراثية، يمكن أن الأجنة المضيفة يكون المسوخ أو morphants محددة كما هو موضح أدناه.
2. جمع الأجنة
   1. استخدام مصفاة الشاي لجمع البيض من مربع تربية. تحقق من البيض كل 15 دقيقة لتحديد وقت ولادة وضمان أن يتم جمع الأجنة مرحلة وحيدة الخلية لخطوات لاحقة.
   2. شطف الأجنة مع E3 المتوسطة (5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.2 ملي بوكل، 0.4 ملي CaCl _2، 0.9 ملي MgCl ₂ و 2٪ الميثيلين الأزرق في الماء المقطر) ووضعها في أطباق بتري تحتوي على ~ 40 مل E3 ¹⁷ في مناطق ذات كثافة أقصاها 50 البيض في 90 مم طبق بيتري.
   3. تسمية أطباق بتري مع اسم السلالة، وتاريخ ووقتولادة. استخدام ماصة نقل باستور لإزالة أي حطام في حين عرض الأجنة تحت المجهر تشريح.
   4. الحفاظ على الأجنة في 28.5 درجة مئوية حتى ~ 3 ساعات postfertilization (HPF) لزرع، أو الاستمرار بواسطة إبر دقيقة جدا.
      ملاحظة: للزرع، وتهدف لالمانحة والمضيفة الأجنة في سن مماثلة. لذلك، والاستفادة من درجات الحرارة تربية مختلفة بين 25 - 32 درجة مئوية وفقا لكيميل وآخرون. ¹⁸ لإبطاء أو تسريع مخلب واحد من الأجنة لتتناسب مع الآخر.
   5. إبقاء ~ 20 من الأجنة المانحة المعدلة وراثيا uninjected في 32 درجة مئوية من الوقت لجمع حتى الوقت الفاصل بين التصوير (24 - بعد 28 ساعة).
      ملاحظة: هذه تطوير أسرع من الفوج التجريبية وسوف يعبرون عن علامات الفلورسنت في وقت سابق. أنها بالتالي يمكن استخدامها لإعداد المعلمات (قوة الليزر، ربح) للتصوير. في هذا المثال بالذات، والتصوير من الفوج التجريبية يبدأ قبل التعبير التحوير (لتقييمالتوقيت الدقيق لهذا الحدث).

2. إعداد ل microinjection

1. إعداد حقن مكروي إبرة
   1. استخدام مجتذب إبرة لسحب الإبر من كل الأنابيب الشعرية البورسليكات الزجاج (1.0 مم OD / 0.78 ملم ID / 100 ملم الزجاج الشعرية الطويلة) في مركز للحصول على اثنين من الإبر متساوية في الطول. تهدف لالإبر التي تفتق مع اعمدة طويلة.
      يتم توفير إعدادات مثال لمجتذب الإبرة المستخدمة هنا في ملاحظة: قائمة المواد.
   2. تخزين الإبر سحبت في طبق بتري وتأمين طريق الضغط عليها في شريط من المعجون قابل للتشكيل أو شريط لاصق.
   3. قبل حقن جلب رأس الإبرة في التركيز تحت المجهر تشريح واستخدام ملقط لكسر مفتوحة الإبرة في طرف. تهدف لطرف مدبب حاد مع فتحة صغيرة (الشكل 1C).
<لى> إعداد Morpholino للالأجنة المضيفة
1. [أليغنوكليوتيد أجل morpholino مصممة خصيصا لهذا الجين من الفائدة فضلا عن morpholino السيطرة القياسية أو عدم تطابق 5 قاعدة الزوج المناسب للسيطرة على الآثار الإجرائية والمناولة.
   ملاحظة: هنا، ترجمة منع Ptf1a morpholino مع تسلسل 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 "الذي يمنع تطور الخلايا الأفقية وعديم الاستطالات لدت وسيطة، ومعيار morpholino السيطرة الزرد استهداف غلوبين بيتا الإنسان إنترون طفرة (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA -3 ') ^7، واستخدمت ^19.
2. إعداد 1 ملم حل سهم morpholino (~ 8-8،5 نانوغرام / NL) وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
3. في يوم من الحقن، وتسخين قسامة (10 ميكرولتر) من morpholino عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وتدور لفترة وجيزة ومكان على الجليد ليبرد من 65 درجة مئوية (وبعد ذلك يمكن أن تبقى في درجة حرارة الغرفة خلال الاستخدام). عشرهو سوف عكس أي يحتمل التجميع ضمن حل morpholino، والتي يمكن أن تقلل من فعالية ضربة قاضية.
   1. لPtf1a morpholino ويعادل morpholino السيطرة القياسية، وإعداد حل العاملة من 6 نانوغرام / NL بواسطة تمييع morpholino حل الأسهم مع الماء المقطر. الحفاظ على RT.
      ملاحظة: استخدام 2 NL من morpholino في الجنين مثل Ptf1a morpholino يتطلب تركيز العمل عالية نسبيا من 12 نانوغرام في الجنين كما سبق تحديدها ^7. بالنسبة لمعظم morpholinos، 2-5 نانوغرام في جنين فعال، لذلك يخفف من الأسهم إلى 2-5 نانوغرام / NL وحقن 1 NL إلى كل جنين.
2. إعداد الفلورسنت مراسل هيستون الانصهار يبني لأجنة وضع العلامات المانحة
   ملاحظة: من أجل التمييز / تصور الخلايا المانحة في الأجنة المضيفة، وهناك أساليب مختلفة لتسمية الجنين المانحة، بما في ذلك Microinjection من H2A-GFP (في حال استخدام الجهات المانحة المعدلة وراثيا معللصحفيين أحمر فلوري) أو H2B-طلب تقديم العروض (اذا كنت تستخدم الجهات المانحة المعدلة وراثيا مع الصحفيين الفلورسنت الأخضر) مرنا في صفار البيض للخلية واحدة الجنين مرحلة المانحة.
   1. خطي 1 ميكروغرام على الأقل تحتوي على البلازميد الحمض النووي المراسل.
      ملاحظة: هنا pCS2 + البلازميد (ولدت وتفضلت التي تقدمها البروفيسور ديفيد تيرنر من جامعة ميشيغان والبروفيسور رالف روب من الطبية مركز ميونيخ) التي تحتوي على H2A-GFP أو H2B-طلب تقديم العروض (الناتجة عن الدكتور كريستوفر ويلكنسون، رويال هولواي، وقد خطي جامعة لندن) على الهضم نوتي تقييد الانزيم.
   2. تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   3. نسخ الرنا المرسال باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا مع البلمرة المناسب وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. لالبلازميد pCS2 +، استخدم مجموعة SP6 البلمرة.
   4. تنقية مرنا باستخدام مجموعات تجارية أو استخراج الفينول كلوروفورم تليها هطول الأمطار الأيسوبروبانول حسب تعليمات الشركة الصانعةالصورة. تمييع مرنا في الماء عالى النقاء (20 - 30 ميكرولتر)، وقياس تركيز مع معمل ومخزن في -80 درجة مئوية.
   5. في يوم من الحقن، وإعداد محلول العمل مرنا في الماء المعقم مع تركيز النهائي من 100 نانوغرام / ميكرولتر والحفاظ على الجليد. العودة الأسهم مرنا غير المستخدمة إلى -80 درجة مئوية.

3. Microinjection من Morpholinos و / أو مرنا في خلية واحدة المرحلة الأجنة

وتستخدم إبر دقيقة جدا للاحتفال كل الخلايا المانحة وإعداد بيئات المضيف مختلفة (السيطرة وضربة قاضية الجينات) وتشمل حقن مرنا أو morpholino أليغنوكليوتيد] العقاقير ^{20، 21:} ملاحظة.

1. تحميل ومعايرة إبرة الحقن
   1. Backload إبرة الحقن مع 3 ميكرولتر من morpholino و / أو هيستون الفلورسنت حل الانصهار مرنا باستخدام نصائح microloader ماصة.
   2. يهز solutايون نحو الطرف حقن الإبرة حتى عدم وجود فقاعات المتبقية. استخدام إبر الحقن مع الزجاج الداخلي إدراج مثل هذا الحل وسيتم اختيار في المقام الأول إلى الطرف بفعل الخاصية الشعرية.
   3. نعلق إبرة الحقن لصاحب المركبة في micromanipulator (3D اليدوي micromanipulator) وضمان وجود ختم ضيق في السكن أنبوب.
   4. بدوره على امدادات الكهرباء والغاز إلى microinjector الضغط تنظيمها.
   5. تزج طرف الإبرة في قطرة من الزيوت المعدنية في طبق (في حالة استخدام العدسة graticule) أو تحوم طرف الإبرة مباشرة على شريحة ميكرون لمعايرة حجم الهبوط. قياس حجم الحقن عن طريق الضغط على دواسة القدم، وضبط ضغط الغاز و / أو المدة الزمنية حتى حجم الحقن ما يعادل 1 NL (125 ميكرون قطر).
      ملاحظة: الاستفادة من شريحة ميكرون هي أن قياسات مستقلة من التكبير المستخدمة في المجهر، ومع ذلك باستخدام خصوصيات العدسة graticuletead، وانخفاض حقن وحجم يمكن أن يكون في التركيز في نفس الوقت.
2. الجنين حقن مكروي
   1. ضع شريحة المجهر في طبق بتري واستخدام ماصة نقل لإيداع الأجنة مرحلة وحيدة الخلية على طول حافة الشريحة. محاذاة إلى عمود واحد باستخدام طرف microloader ماصة مع نصف من طرف رقيقة قطع. إزالة كسائل أكبر قدر ممكن مع ماصة نقل غرامة لمنع الحركات أثناء الحقن (الشكل 1A).
   2. انخفاض الإبرة نحو كل جنين، وتخترق المشيمه وصفار في السكتة الدماغية على نحو سلس واحد (الشكل 1B).
   3. مرة واحدة يتم توسيط طرف إبرة في صفار البيض، microinject عن طريق الضغط على دواسة القدم. حقن 1 NL من H2A-GFP أو H2B-طلب تقديم العروض مرنا في صفار البيض لوحيدة الخلية الجنين مرحلة المانحة (وراثيا). حقن 2 NL من MO القياسية أو Ptf1a MO في صفار البيض من مرحلة وحيدة الخلية النوع البري الجنين المضيف عن طريق الضغط على دواسة القدم مرتين. حقن ناجحة يمكن تصور من قبل األصغر ل تشوه المكاني في صفار البيض.
   4. إزالة إبرة الحقن، ونقل الطبق الذي يحتوي على أجنة لجعل الجنين القادم في الموقف ومواصلة ضخ حتى يتم حقن العمود بأكمله من الأجنة (50 - 60 الأجنة).
   5. بعد حقن جميع الأجنة، ورفع الطبق يصل في 30 - زاوية درجة 45 واستخدام تيار لطيف من E3 المتوسطة (زجاجة ضغط) لنقل الأجنة حقنه في طبق بيتري نظيفة جديدة.
   6. وضع طبق الجنين في حاضنة (إما في 28.5 درجة مئوية أو درجة حرارة أخرى للتأكد من أن الجهات المانحة والمضيفة الأجنة في سن ما يعادلها).
   7. كرر الخطوات من 3.2.1 - 3.2.6 عند الضرورة للحصول على ~ 100 الأجنة المانحة أو ~ 200-250 الأجنة المضيفة.
   8. في 1-2 HPF، والتحقق من الأجنة تحت المجهر تشريح وإزالة أي بويضة غير مخصبة التي لم تقدم لل2- أو 4 خلايا مراحل مع نقل ماصة باستور.

4. التحضير لزراعة الأعضاء

ontent "> ملاحظة: يتم استخدام الزرع لتوليد أجنة خيالية السماح للآثار مختلفة البيئات المضيف وراثي ليتم تقييمها ضمن معادلة الأسلاف المانحة WT ^{9، 22، 23.}

1. الجهات المانحة اختيار الجنين
   1. في 3 HPF، والتحقق من الأجنة المانحة في 2 - 5X التكبير لوصفها إشارة تحت المجهر مضان. اختر متطورة (كتلة الخلية متماثل مع خلايا الحجم بالتساوي) الأجنة مع إشارة الفلورسنت قوية باستخدام GFP بالإضافة إلى فلتر (460-500 نانومتر الإثارة، 510 نانومتر الانبعاثات تمريرة طويلة) أو مرشح تكساس الأحمر (540-580 نانومتر الإثارة، 610 نانومتر الانبعاثات تمريرة طويلة) (1D الشكل). لا يتم التعبير عن صحفيين المعدلة وراثيا حتى الان.
2. لوحة حقن الأغاروس وبيتري إعداد الطبق
   1. صب المنصهر 2٪ الاغاروز مخففة في E3 المتوسطة إلى 90 مم طبق بيتري وندعه يبرد حتى طبق آمنللمس. الاغاروز الساخن يمكن أن تشوه خلاف ذلك القالب.
   2. تطفو على قالب من البلاستيك مع نتوءات على شكل وتد (6 × 25 / العفن) على الاغاروز (الشكل 2D، E). تجنب فقاعات الهواء عن طريق وضع جانب واحد من العفن على الاغاروز وأقل ببطء أسفل الجانب الآخر. تأكد يتركز القالب في طبق أو نحو الجانب من أعمق نقطة من نتوءات على شكل وتد للسماح الفضاء إزالة ما يكفي لإبرة الزرع.
   3. السماح للالاغاروز ليصلب تماما في RT.
   4. ضع صحن الاغاروز في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وإزالة القوالب من خلال رفع بلطف من زاوية واحدة (على سبيل المثال، مع ملقط). إعداد لوحات حقن الأغاروس اليوم قبل التجربة وتخزينها في 4 درجة مئوية مع كمية صغيرة من E3 ختم المتوسطة والبارافين فيلم لمنعهم من الجفاف.
   5. قبل زرع، وملء لوحة حقن الأغاروس مع E3 المتوسطة والمكان الى 28.5 درجة مئوية الحاضنة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
   <لى> منذ الأجنة dechorionated التمسك البلاستيك، إما استخدام الأطباق الزجاجية أو معطف داخل أطباق بتري (90 مم) مع طبقة رقيقة من 2٪ الاغاروز في E3. إعداد طبق واحد عن الأجنة المضيفة dechorionated، طبق واحد للأجنة المانحة dechorionated وطبق واحد عن كل 40 الأجنة المزروعة. تخزين كما هو موضح في لوحة حقن (4.2.4).
3. إعداد نقل ماصة
   1. قطع رأس من شكل طويل سحبت بدقة الزجاج طرف ماصة باستير (2 حجم مل، 230 ملم طول 100 ملم طرف الطويل) على طول تسمح للمناورة مريحة (اختياري) عن طريق خدش بسكين الماس في حين الدورية حتى السقوط طرف إيقاف (الشكل 1F).
   2. تأكد من أن قطع مستقيم. البولندية النار الزجاج ماصة نقل عن طريق تناوب على سطح قطع في موقد بنسن لتوليد نهايات ناعمة حتى لا تضر الأجنة dechorionated (الشكل 1F).
      ملاحظة: حفظ غيض ماصة في الشعلة لفترة طويلة جدا ثنتيجة سوء في افتتاح يجري مختومة أعلى أو أصبحت صغيرة جدا بالنسبة للأجنة.
4. Dechorionating الأريمة مرحلة المانحة والمضيفة الأجنة
   1. الأجنة Dechorionate إما يدويا مع اثنين من ملقط غرامة بشق كل المشيمه دون لمس الجنين، أو إنزيمي باستخدام البروتيني للسماح dechorionation السريع المتزامن لعدد كبير من الأجنة ^9.
      1. يعد حل الأسهم 100X من 50 ملغ / مل البروتيني الخليط، وجعل 100 مكل وتخزينها في -20 درجة مئوية.
      2. إضافة 100 ميكرولتر من البروتيني الأسهم إلى 10 مل E3 المتوسطة (تركيز النهائي من 0.5 ملغ / مل البروتيني).
      3. وضع متطورة المضيفة والمانحة الأجنة في اثنين فنجان صغير مخروطي الزجاج منفصلة (10 مل) وإزالة أكبر قدر من السائل ممكن.
      4. إضافة 5 مل من 0.5 ملغ / مل من محلول بروتيني إلى كل كوب ودوامة بلطف الأجنة في حين ينظر إليها تحت المجهر تشريح. مراقبة أي علامات تشوه المشيمه.
      5. الحفاظ دوامات. بمجرد أن الجنين الأول من المشيمه (1D الشكل، النجمة)، نفذ ثلاثة يشطف سريعة مع E3 المتوسطة لإزالة حل البروتيني التي تتدفق معظم السائل وإعادة تعبئة القارورة بصب بلطف في E3 على طول الجانب. لا تسمح الأجنة dechorionated تأتي في اتصال مع الهواء في أي من الخطوات التالية حتى نهاية (القسم 5) لزراعة الأعضاء، لأنها سوف تنفجر. ترك حل مناسب في قارورة بين يشطف.
      6. مع الحريق مصقول نقل ماصة الزجاج، ونقل الأجنة من دورق مخروطي في أطباق بتري الزجاج أو الاغاروز (2٪ في E3 المتوسطة) المغلفة أطباق بلاستيكية. ماصة بلطف أثناء نقل لإزالة أي المتبقية المشيمه ضعف.
5. إعداد زرع الإبر
   1. استخدام مجتذب إبرة لسحب اثنين من الإبر من كل أنبوب رفيع الجدار الزجاجي البورسليكات (1.0 مم OD/ 0.78 ملم ID / 100 ملم طول) مع نفس الإعدادات كما ماصات حقن مكروي.
      يتم توفير إعدادات مثال لمجتذب الإبرة المستخدمة هنا في قائمة المواد: ملاحظة. الإبر زرع لم يكن لديك إدراج الزجاج، كما امتص هذا يضر الخلايا في الإبرة.
   2. سحب الإبر مسبقا وتخزينها في طبق بيتري وتأمين طريق الضغط على شريط من المعجون قابل للتشكيل أو شريط لاصق.
   3. قبل الزرع جلب رأس الإبرة في التركيز تحت المجهر تشريح واستخدام ملقط لكسر مفتوحة الإبرة في طرف. استخدام ملقط غرامة لضبط شكل إبرة لهدف لالفلوت الشكل (الشكل 2G)، أو استخدام الطرق البديلة وصفه لتوليد شكل قمة ^23.

5. الوهم الجيل عبر الأريمة زراعة

1. الإعداد زرع
   ملاحظة: هنا، تم استخدام جهاز زرع الذاتي تجميعها (الشكل 2A ).
   1. جبل الإبرة زرع في حامل إبرة نفسه الذي استخدم ل microinjection فوق (التي شنت على micromanipulator، خطوة 3.1.3) (الشكل 2A).
   2. قطع أنابيب ضخ الذي يربط نهاية حامل micropipette إلى microinjector الضغط ينظم استخدامها لإبر دقيقة جدا. إرفاق أنابيب حقن مرتبط إلى 1 مل حقنة (الشكل 2A، B)، الذي يمثل منصة الزرع.
      1. تأكد من أن كافة الاتصالات مغلقة بإحكام باستخدام فيلم البارافين أو المعجون قابل للتشكيل. منع الأجنة من ملامسة الهواء عن طريق ضمان أن هناك دائما بعض المتوسطة E3 في الإبرة زرع نفسها. تعمل حقنة يدويا لامتصاص خلايا / السائل داخل وخارج إبرة الزرع.
2. محاذاة الجنين
   1. نقل الأجنة المانحة مع ماصة الزجاج في العمود الأول من قالب الاغاروز. نقل الأجنة المضيفة في أعمدة 2إلى 6 من العفن الاغاروز (الشكل 2F). وضع الأجنة مع ماصة بحيث يواجه الجانب قسيم أرومي تصل.
3. ازدراع
   1. راحة بلطف الإبرة زرع على خلية قسيم أرومي من جنين المانحة وتمتص ببطء حوالي 20 - 50 خلية في إبرة الزرع (الشكل 2H). تجنب امتصاص الصفار.
   2. رفع إبرة زرع من الجنين المانحة باستخدام micromanipulator. نقل طبق قالب الاغاروز إلى اليسار وإدراج غيض زرع إبرة من خلال الجانب من الكتلة الخلوية في القطب الحيواني من الجنين المضيف الأول. إيداع 5-10 خلايا بالقرب من السطح وفقا لرسم الخرائط مصير تبين أن هذا المجال يثير مجال الدماغ الأمامي / العين ²⁴ (الشكل 2I). الحفاظ على طرف إبرة منغمسين في المتوسط ​​E3 في جميع أنحاء الإجراء بأكمله.
4. رعاية الأجنة المزروعة
   1. إزالة المانحة الأجنة لالثانية ترك الأجنة المضيفة في قالب الاغاروز ل1 - 2 ساعة في 28.5 درجة مئوية. ملء الزجاج أو البلاستيك (المغلفة مع 2٪ الاغاروز) أطباق بتري مع المتوسط ​​E3 تحتوي على 0.003٪ N-الفنيل (PTU) لمنع تشكيل الصباغ لأن هذا سوف تتداخل مع التصوير. نقل الأجنة المضيفة إلى هذه الأطباق مع النار مصقول ماصة الزجاج واحتضان عند 28.5 درجة CO / N.
      تنبيه: ارتداء القفازات عند التعامل مع PTU.

6. إعداد تصوير لايف

ملاحظة: حجم صغير والشفافية البصرية من الزرد جنبا إلى جنب مع التطور السريع قد أتاحت لها أن تصبح نموذجا الفقاريات رئيسيا في الجسم الحي التصوير من الخلايا والأعضاء المختلفة. التصوير لا يمكن أن يؤديها على مجموعة متنوعة من المجاهر، والتي سوف تختلف في الإعداد والمعلمات. فيما يلي وصف لإعداد متحد البؤر التصوير مناسبة للتصوير للتنمية الشبكية ^{5، 8.}

1. الجنين خياليةاختيار
   1. في 24-26 HPF، وشاشة الأجنة المزروعة تحت نطاق الفلورسنت تشريح لتحديد الأجنة صحية متطورة التي تظهر الخلايا التي تم زرعها المانحة (H2A-GFP أو H2B-RFP المسمى) في منشم العين النامية.
   2. توضع جانبا حتى 40 الأجنة للتركيب من قبل pipetting إلى طبق جديد وإضافة 0.4 ملغ / مل تريكين methanesulfate (MS222) لتخدير الأجنة.
      تنبيه: ارتداء القفازات عند التعامل مع MS222.
2. الأجنة تصاعد
   ملاحظة: استخدم طبق تصاعد المناسب، وهذا يتوقف على ما إذا كان سيتم إجراء التصوير على مجهر مقلوب ⁸ أو تستقيم (الموصوفة هنا).
   1. إعداد عدد قليل من 1.5 مل أنابيب بلاستيكية تحتوي على 1 مل من 1٪ انخفاض الاغاروز تذوب في 0.4 ملغ / مل MS222 في E3 المتوسطة والحفاظ على المنصهر في 40 ° C حمام الماء.
   2. تمتص 5 الأجنة في ماصة نقل البلاستيك والسماح للأجنة تتراكم في الطرف عن طريق الجاذبية. المس نقل ماصةعلى سطح واحد من الأنابيب البلاستيكية المعدة تحتوي على 1٪ تذوب منخفض الاغاروز و 0.4 ملغ / مل MS222 السماح للأجنة لتغرق في أنبوب بينما الحد من كمية نقل E3.
   3. الأجنة جبل في 90 مم طبق بيتري للتصوير في المجهر تستقيم وأسفل الزجاج طبق بتري (أي حجم) للتصوير في مجهر مقلوب. استخدام علامة دائمة لتقسيم بصريا إما طبق إلى نصفين للمانحين الصورة في المضيفين WT (على جانب واحد) أو المضيفين morphant (الجانب الآخر) في التجربة نفسها.
   4. نقل الأجنة خمسة من أنبوب بلاستيكي الاغاروز إما طبق بيتري مع 0،5-1 مل الاغاروز. إزالة الاغاروز الزائدة مع ماصة نقل بحيث (~ 200-300 ميكرولتر) سوى قطرة صغيرة لا يزال قائما. إذا التصوير مع المجهر تستقيم، وتجنب وضع الأجنة داخل 1 سم من محيط طبق بيتري. عدسة غمس غمر المياه المستخدمة في التصوير قد لا تكون قادرة على أن تركز في هذا المجال بسبب الجدار طبق بيتري (الشكل 3A </ قوي>).
   5. استخدام ماصة microloading (مع طرف قطعت) لمحاذاة الأجنة أفقيا حتى يتصلب الأغاروس. لكلا النوعين من الأطباق، والزاوية الأجنة بشكل صحيح أفقيا إذا كانت العينان اثنين على كل جانب من جانبي الرأس هي متداخلة تماما (محاذاة في XY البعد) (الشكل 3B). للاستخدام المجهر المقلوب، والعين بالقرب من ساترة يجب دفع أقرب إلى ساترة وقت ممكن، لتمكين التصوير من خلال البعد ض ضمن قيود مستويات التركيز الممكنة.
   6. تواصل تصاعد خمسة أجنة في وقت قطرات الأغاروس الفردية. استخدام المزيد من 1٪ منخفضة ذوبان الاغاروز للانضمام إلى الاغاروز قطرات من بعضها البعض وعلى جانب الطبق لمنع أي تهجير والحركة الجانبية أثناء التصوير (الشكل 3A).
   7. مرة واحدة توطد تماما، وتغطي الطبق مع E3 المتوسطة (التي تحتوي على 0.003٪ PTU، 0.4 ملغ / مل MS222) prewarmed إلى 28.5 درجة مئوية.
   8. باستخدام نفس النهج هو موضح في الخطوات 6.2.2- 6.2.8، جبل ~ 20 الأجنة وراثيا التي أثيرت في 32 درجة مئوية (الخطوة 1.2.5) في طبق منفصل.
3. المعلمات التصوير
   ملاحظة: التصوير لتحليل بداية من الجينات المحورة الفلورسنت لا تتطلب دقة عالية داخل الخلايا المكاني. لا يمكن أن يؤديها مع W خطة-امزيغ 20X / 1.0 DIC M27 الهدف 70 ملم على 1.5 التكبير.
   1. إعداد الوقت قوة الليزر والتعرض على أساس كثافة التحوير ل~ 20 الأجنة وراثيا مع التنمية المتسارعة (رفع أي في 32 درجة مئوية، خطوة 6.2.8).
      ملاحظة: للحصول على دراسات من بداية التعبير التحوير، الأجنة التجريبية تظهر أي مضان في الوقت الذي يتم ضبط الوقت الفاصل بين أعلى وبالتالي، فإن هذه الأجنة تسارع حاسمة لتحديد معالم التصوير.
   2. للطبق التجريبية، تصور كل جنين وإنقاذ الموقف والتركيز مستويات الأجنة.
      1. اختيار الأجنة التي لديها زاوية التركيب الصحيحة (أي مع الصورة الجانبيةبيئة تطوير متكاملة من العين كما الأفقي ممكن) وضربات القلب القوي (وهو مؤشر على الصحة). اختيار الأجنة مع عدد قليل من الخلايا المانحة المزروعة (التي حددها H2A-GFP أو العلامات H2B-RFP) في المقام الأول في الربع البطني الأمامي من شبكية العين النامية (حيث تبدأ موجة من التعبير الجيني) (الشكل 3C).
         ملاحظة: في الأجنة الزرد، ومتوسط سرعة القلب هو 120-180 نبضة / دقيقة ^25. في الأجنة تخدير، قد تكون ضربات القلب السليم في نطاق 60-120 نبضة / دقيقة. قد يكون أبطأ ضربات القلب يدل على انخفاض الجدوى ولا ينبغي استبعاد تلك الأجنة من الدراسة.
   3. تعيين مداخن Z من المقاطع البصرية في 2 ميكرون فترات من خلال شبكية العين تصل إلى 15 الأجنة.
      ملاحظة: إجمالي عدد الأجنة التي يمكن تصوير في أي تجربة معينة سوف تعتمد على المعلمات الفردية (زمن التعرض وحجم ض المكدس). الوقت الذي يستغرقه لصورة 1 نقطة في الوقت لجميع الأجنة المختارة يجب أن يكون SHorter من الفاصل الزمني بين نقاط الوقت. من خلال التضحية ببعض قرار العمق، والمزيد من الأجنة يمكن تصوير داخل فترات زمنية. ويتم اختيار حدود ض المكدس كما النقيضين الجانبية وسطي من الأجنة العين محمولة و 30 ميكرون يضاف إلى الجانب الوحشي في الإعداد المجهر تستقيم، وعيون الأجنة النامية في هذا التحول الإعداد في اتجاه z كما الأجنة تنمو بين عشية وضحاها. وهذا يؤدي إلى أكوام 100-170 ميكرون سمك (50-85 الصور / العين).
   4. التقاط صور كل 24 دقيقة في 32 ° C (ما يعادل 0.5 HPF فترات) باستخدام الليزر المناسب / القناة إلى التحوير.
      ملاحظة: تبقى الأجنة على المسرح في جميع أنحاء كامل الوقت الفاصل داخل غرفة ساخنة تشمل المجهر بأكمله. بينما يمكن إجراء التجربة على 28 درجة مئوية، وتستخدم درجات الحرارة لتسريع التنمية وضمان نقاط الزمنية ذات الصلة في التجربة يتم تصوير داخل 16-24 ساعة مدة مرور الزمن.
   5. صورةالقنوات التي تمثل التسمية المانحة (H2A-GFP أو H2B-طلب تقديم العروض - اختياري) والتحوير (Atoh7: طلب تقديم العروض أو Vsx1: GFP) باستخدام المسح المتتابع. لتحليلها، والاستفادة من التسمية المانحة فقط لاختيار الأجنة المناسبة كما هو موضح (تأخذ واحدة ض المكدس في بداية التصوير) ثم نفذ الوقت الفاصل فقط على قناة لالتقاط التعبير التحوير.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم تسمية المانحة فقط لتحديد الأجنة المناسبة (أي تلك بخلايا أكد المزروع في الأمامي الربع البطني) وصورة فقط القناة التحوير، ما يقرب من خفض وقت التصوير وأي ما يعادل ضعف عدد الأجنة التي يمكن تصويرها وتحليلها في تجربة (الشكل 4).

النتائج

يعرض هذا العمل بروتوكول تجريبي لتقييم التغيرات في التعبير الجيني توقيت عندما تتطور النوع البري الأسلاف الشبكية داخل الجنين المضيف morphant. الأجنة المضيفة التجريبية هي morphants Ptf1a، التي تفتقر إلى interneurons المتوسطة ولد الأفقي وعديم الاستطالات الشبكية

Discussion

فهم إلى أي مدى الخلايا المجاورة تؤثر توقيت التعبير عن العوامل التي تحدد مصير خلية حاسم من الضروري عندما تهدف إلى إرشاد كفاءة الخلايا الجذعية الجنينية متعدد القدرات أو حمله على التمايز إلى نوع خلية معينة في مرحلة ما بعد الإنقسامية أو حتى الأنسجة المزخرفة. وعلاوة على ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bioline	BIO-41025	Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C
Agarose low melt	Sigma	A9414-100G	Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
borosillicate glass capillary tube w/o filament	SDR Scientfic	30-0035	alternatives with similar diameter can be used
borosillicate glass capillary tube with filament	SDR Scientfic	30-0038	alternatives with similar diameter can be used
glass petri dishes (60 mm diameter)	Science Supply	1070506	any glass alternative of any size
Injection tube (2 m)	Eppendorf	524616004	This connects the needle holder to the syringe during transplantation
Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)	Adaptive Science Tools	PT-1	alternatives with similar shape can be use
microneedle holder	Narishige	M-152	any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
microinjector	Narishige or Eppendorf Femtojet		Pneumatic injector using gas pressure
micromanipulator	Coherent Scientific	M330IR	similar alternatives can be used
microloader tip	Eppendorf	5242956003
Mineral oil	Sigma	M5904-500ML
needle puller	Sutter Instruments	Model P-2000	Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
Parafilm	Interpath	PM996	any paraffin film
Pasteur pipette plastic	Samco Scientific	202
Pasteur pipette glass	Hirschmann Laborgeraete	9260101
Pronase	Sigma	P5942-25MG	Protease Type XIV
N-phenyl thiourea	Sigma	P7629-25G	PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use.
Qiaquick gel extraction	Qiagen	28704	any alternatives to purify DNA can be used
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104	any alternatives to purify RNA can be used
SP6 mMessage kit	Qiagen	AM1340	any alternatives to transcribe DNA using SP6