In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג'ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

Summary

מעקב חיה של אבות רשתית WT בודדים רקע גנטי מובהק מאפשר הערכה של תרומת איתות שאינו אוטונומי התא במהלך הנוירוגנזה. כאן, שילוב של מציאת גן, דור הכימרה באמצעות השתלה העובר בתחום הדמית confocal זמן לשגות vivo נוצל למטרה זו.

Abstract

החוזק הגנטי וטכני הפכו את חוליות דג הזברה אורגניזם מודל מפתח אשר ההשלכות של מניפולציות הגן ניתן לייחס in vivo לאורך כל תקופת ההתפתחות המהירה. ניתן ללמוד מספר רב של תהליכים כולל התפשטות תאים, ביטוי גנים, נדידת תאים ומורפוגנזה. חשוב לציין, הדור של מפלצות באמצעות השתלות יכול להתבצע בקלות, ומאפשר תיוג פסיפס ומעקב של תאים בודדים תחת שפעת הסביבה המארחת. לדוגמא, על ידי שילוב של מניפולציות גן פונקציונליות של עובר המארח (למשל, באמצעות microinjection morpholino) ו הדמיה לחיות, את ההשפעות של חיצוני, אותות nonautonomous תא (המסופקים על ידי הסביבה המהונדסת הגנטי) על תאי תורם מושתלים בודדים ניתן להעריך. כאן אנו מדגימים כיצד גישה זו משמשת כדי להשוות את התחלתה של ביטוי transgene ניאון כמדד עיתוי determin גורל התאation בסביבות מארח גנטי שונה.

במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול עבור microinjecting עוברי דג זברה כדי לסמן תאים תורמים לגרום מציאת גן בעוברים מארחים, תיאור של טכניקת ההשתלה השתמשה כדי ליצור עבר chimeric, ואת הפרוטוקול להכנה והפעלה בתוך confocal הזמן לשגות vivo הדמיה של עוברים מרובים. בפרט, ביצוע הדמיה multiposition הוא קריטי כאשר משווים עיתוי אירועים כגון התפרצות של ביטוי גנים. זה דורש איסוף נתונים מתוך שליטה מרובה ועובר ניסיוני מעובד בו זמנית. גישה כזו ניתן להרחיב בקלות ללימודים של השפעות חיצוניות בכל איבר או רקמה של בחירה נגישה לחיות הדמיה, ובלבד השתלות ניתן לכוון בקלות על פי מפות גורל עובריות הוקמו.

Introduction

היכולת לחזות תהליכים התפתחותיים חשובים בתוך חוליות vivo ב תרמה להפיכת דג הזברה כמודל מפתח ללימוד תנאים נורמלים ומחלות (הנסקרת ב ^{1, 2).} בפרט, הרשתית העצבית היא חלק בלתי נגיש של מערכת העצבים המרכזית. הרשתית משאיל את עצמו לבצע מחקרים בקלות הנוירוגנזה בשל מבנהו מאורגן, אך פשוט יחסית, וסוגים נוירון שלה שמור ביותר על פני מינים בעלי חוליות ^3. דינמיקה של התנהגויות הסלולר כגון התפשטות, יציאת מחזור התא, חלוקת תא סימטרית, מפרט גורל, בידול, והיווצרות מעגלים עצבית ניתן בעקבות לאורך כל התהליך של retinogenesis, אשר הושלם ברשתית המרכזית של דג הזברה על ידי 3 ד postfertilization ( ^{4 DPF), 5,}נ"צ "> ^{6, 7.}

יתר על כן, הדרישות הפונקציונליות של גנים שונים בכל השלבים שהוזכרו לעיל ניתן להעריך בו זמנית ברשתית דג הזברה, מתן יתרון על פני דגמים חוליות אחרים בהם פנוטיפים וכתוצאה מיישום של טכניקות נוקאאוט גנטי ניתן להעריך רק בבדיקה שלאחר המוות של קבוע רקמות. בפרט, השימוש בקווים מהונדסים שבו אנו יכולים לחזות את ולנטר את הביטוי של חלבוני ניאון כמו transgenes כתב ברשתית, מאפשר לנו להשיג החלטה זמנית של ביטוי גנים העומדים בבסיס ראשיתו של סוג תאים עצבי בפרט. בשל ההתפתחות המהירה של דג זברה, אירועים אלה ניתן דמיינו בתקופה התפתחותית כולו, ובכך לספק תובנה עמוקות יותר את החשיבות הזמנית של ביטוי גנים ביחס לרכישת זהות תאים עצבית ועל התנהגות תא.

לבסוף, גישות אלה ניתן לשלב ביעילות של דג הזברה עם הדור של הכימרה באמצעות השתלות, וכתוצאה מכך תובנות שני היבטים מרכזיים של תפקוד הגן. ראשית, בחינת תאים המושתלים מעובר תורם, שבו גן מסוים ופל תוך שהם מפתחים בסביבת סוג ברה ללא תווית, מאפשר לנו להשיג מידע רלוונטי על תפקוד גן באופן תא אוטונומי. זה מוביל לתובנות חשובות לגבי הפונקציה של גורמים הקובע גורל רשתית בתוך ובתאים הם באים לידי ביטוי בדרך כלל. זה בא לידי ביטוי על ידי בחינה של התוצאה גורל התפתחותי של אבות כי כבר לא יכול ליצור חלבון פונקציונלי מן הגנים האלה ^{4, 6, 8, 9.} ניצול גישה זו, הראינו כי גורמים הקובעים גורל רב (למשל, Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) לפעול תא-autonomously לנהוג גורלות עצביים ברשתית ספציפית; חוסר ביטוי גנים מוביל בעיקר למתג גורל, כך התאים עם גן המציאה להישאר קיימא על ידי אימוץ גורל ⁴ תאים ^{חלופי, 6, 7, 10.} שנית, ניסויי כימרי כזה יכול לשמש כדי להעריך כמה פרא סוג אבות להתנהג כאשר הם מפתחים בתוך סביבות גנטיות שונות. לדוגמא, על ידי השוואת התפתחות תאי WT שבדרך כלל לבטא את גן של עניין (ו transgene כתב) בתוך WT לעומת סביבת מארח מניפולציות (למשל, נוקאאוט גנטי / מציאה), את ההשפעות הנובעות על ביטוי גני גורל תא ניתן להעריך . חוסר סוגי נוירונים מסוימים בסביבת המארחת, למשל, מוכיח להשפיע על התנהגות אב סוג בר באופן תאים שאינם אוטונומי, להטות אותם לכיוון הבחנה לתוך o מיוצגת כראויr חסר סוגי נוירונים ^{4, 7, 11, 12.} בהתחשב בכך נוירונים ברשתית נולדים צו histogenic נשמר על ידי ביטוי מתוזמן ברצף של גנים הקובעים גורל ספציפיים עצביים (ביטוי גני גורל) (הנסקרת ב ^13), השתמשנו בשיטות אלה כדי להדגים כיצד התזמון של ביטוי גני גורל אבות סוג ברים מושפע כאשר אבות כאלה לפתח בסביבות מארח רשתית עם קומפוזיציות הסלולר סוטות מושרות. כאן, אנו מתארים גישות אלה כעדות איך השילוב לסטנדרטים יחסית בשימוש נרחב בטכניקות מאפשר בחינת המועדים של ביטוי גני גורל בפיתוח אבות רשתית ^{8, 9.}

פרוטוקול זה מתאר גישה ניסויית שילוב הדמיה זמן לשגות עם הקלות של לכללהרכיב השתלת בעובר דג הזברה פיתוח vivo לשעבר כדי לעקוב אחר תאים בודדים mosaically שכותרתו לאורך כל תקופת retinogenesis התפתחותית. על ידי ביצוע מניפולציות גן פונקציונלי או בעובר המארח, העובר התורם, שניהם או אף אחד, אפשר להעריך את האוטונומיה תאים של תפקוד הגן. גישה זו ניתן להתאים נרחבת לשאלות מחקר דומות בכל מערכת אחרת עבורו הרכיבים הבודדים המפורטים כאן מתאימים.

Protocol

כל הנהלים בוצעו על פי הוראות הקוד המועצה למחקר רפואי ובריאות הלאומית של אוסטרליה עיסוק לטיפול ולשימוש בחיות ואת אושרו על ידי ועדות האתיקה של המוסד הרפואי.

1. הכנת דג הזברה

1. זיווג דגים למבוגר
   1. הגדרת דגים בוגרים כזוגות (או שני זוגות) במיכלים רבייה בגודל מתאים בערב לפני השימוש.
   2. כדי לשמור על האישה הפרודה מן הזכר, להשתמש מחלק כדי לאפשר את הדגים כדי לראות, אבל לא נוגע זה בזה.
   3. בבוקר, לאחר מדליק את האור, להסיר את המחיצות ולאפשר הדגים להזדווג באין מפריע.
   4. לאחר הזדווגות מוצלחת לשים דגים בוגרים בחזרה לתוך הטנקים המקוריים שלהם.
      הערה: Host וללחצים תורמים עשויים להיות זהים, למשל, כל סוג בר (WT) זנים. במחקר זה את העוברים התורם נגזר קווי מהונדס Tg (atoh7: gapRFP), Tg (atoh7: gapGFP) אוTg (vsx1: GFP) שבו הביטוי של גורמים הקובעים גורל הנהיגה מוקדם או ניתן דמיינו גורל עצבי מאוחר, בהתאמה ^{14, 15, 16.} על מנת להשוות את ההשפעות של שוני סביבות גנטיות, עוברת מארח יכול להיות מוטציות ספציפיות או morphants כמתואר להלן.
2. אוסף העובר
   1. השתמש מסננת תה לאסוף את הביצים מן התיבה הרבייה. בדוק ביצים כל 15 דקות כדי לקבוע את מועד הלידה ולהבטיח בעוברים תא בודד נאספים על הצעדים הבאים.
   2. לשטוף עוברים עם המדיום E3 (5 mM NaCl, 0.2 KCl מ"מ, 0.4 מ"מ ₂ CaCl, 0.9 מ"מ MgCl ₂ ו -2% מתילן כחול במים מזוקקים) ומניחים אותם צלחות פטרי המכילות ~ 40 מ"ל E3 ¹⁷ בצפיפות מקסימלית של 50 ביצים לכל 90 מ"מ קוטר צלחת פטרי.
   3. לייבל צלחות פטרי עם המתח שם, תאריך ושעתהוּלֶדֶת. השתמש פיפטה העברת פסטר כדי להסיר כל פסולת תוך הצגה עוברת תחת מיקרוסקופ לנתח.
   4. שמור את העוברים על 28.5 ° C עד ~ 3 שעות postfertilization (hpf) להשתלה, או להמשיך עם microinjections.
      הערה: לקבלת השתלות, לשאוף עובר תורם מארח בגילים דומים. לכן, לנצל טמפרטורות גידול שונות בין 25 - 32 מעלות צלזיוס על פי קימל et al. ¹⁸ להאט או להאיץ מצמד אחד של עוברים כדי להתאים את השני.
   5. שמור ~ 20 של עוברי תורם המהונדסים uninjected על 32 מעלות צלזיוס מרגע איסוף עד הזמן לשגות הדמיה (24 - 28 h מאוחר יותר).
      הערה: אלה יפתחו מהר יותר מאשר הדור ניסיוניים יביע סמנים ניאון קודם לכן. הם יוכלו לשמש כדי להגדיר את הפרמטרים (לייזר כוח, רווח) עבור הדמיה. בדוגמא זו בפרט, הדמיה של הדור הניסיון מתחילה לפני ביטוי transgene (כדי להעריךהתזמון המדויק של האירוע הזה).

2. הכנה עבור Microinjection

1. הכנה מחט Microinjection
   1. השתמש חולץ מחט למשוך מחטים מצינור כל נימי בורוסיליקט זכוכית (1.0 מ"מ OD / 0.78 מזהים מ"מ / 100 מ"מ זכוכית נימים ארוכות) במרכז להשיג שתי מחטים שווים באורכם. כוון מחטים כי להתחדד עם פירים ארוכים.
      הערה: הגדרות דוגמה עבור חולץ מחט משמש כאן מצוינות ב רשימת חומרים.
   2. אחסן את מחטי משך בצלחת הפטר ומאובטחים על ידי לחיצה אותם למפצל של מרק moldable או סרט דביק.
   3. לפני הזריקה להביא את קצה המחט בפוקוס תחת מיקרוסקופ לנתח ולהשתמש מלקחיים לפרוץ את המחט בקצה. כוון טיפ מחודד חד עם פתח קטן (איור 1 ג).
2. הכנה Morpholino עבור לארח עוברי
   1. oligonucleotides morpholino להזמין שתוכנן במיוחד עבור הגן של עניין, כמו גם morpholino שליטה רגילה או חוסר סימטריה מתאים 5 בסיס-זוג לשלוט על השפעות פרוצדורליים וטיפול.
      הערה: כאן, תרגום חוסם Ptf1a morpholino עם הרצף 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 'אשר מעכב את התפתחות התאים האופקיים amacrine נולדו הביניים, וכן morpholino דג זברה מלאת תקן מיקוד מוטצית אינטרון בטא-גלובין אנושי (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA -3 ') ^{7, 19} היו בשימוש.
   2. כן פתרון מניות morpholino 1 מ"מ (~ 8 - 8.5 ng / nL) ולאחסן בטמפרטורת חדר.
   3. ביום ההזרקה, אל תחממו aliquot (10 μL) של morpholino ב 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ספין בקצרה ומניחים על קרח כדי להתקרר מ- 65 ° C (שלאחריהן הוא יכול להישמר בטמפרטורת החדר במהלך השימוש). thהוא יתהפך כל צבירה פוטנציאלית בתוך פתרון morpholino, אשר יכול להפחית האפקטיביות של המציאה.
      1. לקבלת Ptf1a morpholino ו morpholino שליטה תקן מקביל, להכין פתרון עבודה של 6 ng / nL על ידי דילול פתרון המניות morpholino עם מים מזוקקים. שמור ב RT.
         הערה: השתמש 2 nL של morpholino לכל עובר כמו morpholino Ptf1a דורש ריכוז עבודה גבוה יחסית של 12 ng לכל עובר כפי שנקבע בעבר ^7. עבור רוב morpholinos, 2 - 5 ng לכל עובר הוא יעיל, כך לדלל את המניות - 2 5 ng / nL ולהזריק 1 NL לתוך כל עובר.
3. הכנת כתב היתוך היסטון פלורסנט בונה עבור עוברי תורם תיוג
   הערה: כדי להבדיל / לדמיין תאים התורם בתוך לארח העוברי, ישנן גישות שונות לתייג את העובר התורם, כולל microinjection של H2A-GFP (אם באמצעות תורמים מהונדסים עםכתבי ניאון אדומים) או H2B-RFP (אם באמצעות תורמים מהונדסים עם כתבי ניאון ירוקים) mRNA בחלמון של עובר תורם שלב התא הבודד.
   1. Linearize לפחות 1 מיקרוגרם פלסמיד המכיל את ה- DNA הכתב.
      הערה: כאן pCS2 + פלסמיד (שנוצר בתנאי בחביבות על ידי פרופ 'דוד טרנר מאוניברסיטת מישיגן ופרופ ראלף רופ מן מינכן מרכז ביו-רפואית) המכיל H2A-GFP או-RFP H2B (שנוצר על ידי ד"ר כריסטופר וילקינסון, Royal Holloway, University of London) היה לינארית עם עיכול אנזים הגבלה NotI.
   2. לטהר DNA באמצעות ערכות זמינות מסחרי לפי הוראות יצרן.
   3. לתמלל mRNA באמצעות ערכות זמינות מסחרי עם פולימראז המתאים לפי הוראות יצרן. עבור פלסמיד + pCS2, השתמש בערכת פולימראז SP6.
   4. לטהר mRNA באמצעות ערכות מסחריות או מיצוי פנול, כלורופורם ואחריו משקעים isopropanol לפי הוראה של היצרןים. לדלל את ה- mRNA במי ultrapure (20 - 30 μL), למדוד את הריכוז עם ספקטרופוטומטר ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
   5. ביום ההזרקה, להכין פתרון עובד של mRNA במים סטריליים עם ריכוז סופי של 100 ng / μL ולשמור על הקרח. החזר למניה mRNA בשימוש בחזרה ל -80 מעלות צלזיוס.

3. Microinjection של Morpholinos ו / או mRNA לעוברי שלב-תא יחיד

הערה: microinjections משמשת כדי לסמן את כל התאים תורמים להכין את סביבות מארחת השונות (מלא מציאת גן) ולערב זריקות של mRNA או מולקולות אנטיסנס morpholino ^{20, 21.}

1. העמסת כיול מחט הזריקה
   1. Backload מחט הזריקה עם 3 μL של morpholino ו / או פתרון mRNA היתוך פלורסנט היסטון באמצעות טיפים פיפטה microloader.
   2. לנער את solutיון לעבר קצה הזרקת המחט עד שאין בועות הנותרות. השתמש במחטי זריקה עם זכוכית פנימית להכניס כזה שהפתרון יצויר בעיקר אל הקצה על ידי פעולת נימים.
   3. צרף את מחט הזריקה לבעל רכוב micromanipulator (micromanipulator ידנית 3D) ולהבטיח חותם חזק בתוך דיור צינור.
   4. הפעל את אספקת החשמל והגז microinjector מוסדר הלחץ.
   5. לטבול את קצה המחט בתוך טיפה של שמן מינרלים בצלחת (אם באמצעות עינית graticule) או העבר את קצה המחט ישירות על שקופית מיקרומטר לכייל את נפח הירידה. מדוד את עוצמת הזריקה על ידי לחיצה על דוושת הרגל ולהתאים את לחץ הגז ו / או משך זמן עד נפח ההזרקה שווה 1 NL (125 מיקרומטר קוטר).
      הערה: היתרון של שקופית מיקרומטר היא שמדידות שאינן תלויות מן ההגדלה על המיקרוסקופ, אולם באמצעות התוספות העיניות graticuletead, הטיפה בקנה מידת ההזרקה יכולות להיות בפוקוס בעת ובעונה אחת.
2. microinjection העובר
   1. מקום שקופית מיקרוסקופ בצלחת הפטר ולהשתמש פיפטה העבירה להפקיד בעוברי תא בודד בשולי השקופית. יישר לתוך עמודה אחת באמצעות קצה פיפטה microloader עם מחצית הקצה הדק המנותק. להסיר כמה שיותר נוזלים ככל האפשר עם טפטפת העברה בסדר למנוע תנועות במהלך זריקות (איור 1 א).
   2. מנמיך את המחט לכיוון כל עובר, ולחדור הסיסי והחלמון במכה אחת חלקה (איור 1B).
   3. ברגע שקצה המחט מרוכז החלמון, microinject ידי לחיצה על דוושת הרגל. להזריק 1 NL של H2A-GFP או H2B-RFP mRNA בחלמון של עובר תורם שלב תא בודד (מהונדס). להזריק 2 nL לסטנדרטי MO או Ptf1a MO בחלמון של עובר מארח סוג בר בשלב תא בודד על ידי לחיצה על דוושת רגל פעמים. ניתן דמיינו זריקות מוצלחות של smal l עיוות מרחבי החלמון.
   4. הסר את מחט הזריקה, להזיז את הצלחת המכילה את העוברים להביא את העובר הבא להמקום ולהמשיך הזרקה עד העמודה השלמה של עוברים מוזרקות (50 - 60 עוברת).
   5. לאחר הזרקת כל העוברים, להרים את המנה למעלה ב 30 - זווית ° 45 ולהשתמש זרם עדין של מדיום E3 (מבקבוק לחיץ) להעביר את העוברים מוזרק לתוך צלחת חדשה נקייה פטרי.
   6. מניח את צלחת העובר באינקובטור (או על 28.5 מעלות צלזיוס או טמפרטורה אחרת על מנת להבטיח כי עובר תורם המארח הם בגילים דומים להם).
   7. חזור על שלבי 3.2.1 - 3.2.6 ככל שיידרש כדי להשיג ~ 100 עוברים תורמים או ~ 200 - 250 לארח עוברי.
   8. בשעת 1 - 2 hpf, לבדוק את העוברים תחת מיקרוסקופ לנתח ולהסיר את כל ביצים מופרות שלא העפילו לשלבים 2 או 4 תאים עם טפטפת העברת פסטר.

4. הכנה עבור השתלות

הערת ontent ">: השתלות משמשות ליצירת עבר chimeric המאפשרים את ההשפעות של סביבות מארח גנטי שונות יוערך בתוך אבות תורם מקבילים WT ^{9, 22, 23.}

1. מבחר עובר תורם
   1. בשעה 3 hpf, לבדוק את העוברים התורמים ל 2 - גדלת 5X לאות תיוג תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בחר מפותח (מסת תאים סימטרית עם תאים בגודל אחיד) עובר עם אות ניאון חזקה באמצעות GFP בתוספת המסנן (עירור ננומטר 460-500, 510 פליטת מסירה ארוכה ננומטר) או מסנן אדום טקסס (540 - 580 עירור ננומטר, 610 ננומטר פליטת מסירה ארוכה) (איור 1D). הכתבים המהונדסים אינם באים לידי ביטוי עד כה.
2. צלחת הזרקת Agarose והכנת צלחת פטרי
   1. יוצקי agarose 2% מותכים מדולל E3 בינוני לתוך צלחת 90 ​​מ"מ קוטר הפטר ולתת לו להתקרר עד המנה היא בטוחהלגעת. agarose חם יכול אחרת לעוות את התבנית.
   2. Float תבנית פלסטיק עם בליטות בצורת טריז (6 x 25 / עובש) על agarose (איור 2 ד, ה). הימנע בועות אוויר על ידי נחת צד אחד של העובש על agarose ותחתון לאט במורד הצד השני. ודא העובש מרוכז בצלחת או כלפי צד של הנקודה העמוקה ביותר של בליטות בצורת טריז כדי לאפשר מרחב אישור מספיק המחט ההשתלה.
   3. אפשר agarose כדי לחזק לחלוטין ב RT.
   4. מניח את צלחת agarose ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולהסיר את התבניות ידי הרמה בעדינות מפינה אחת (למשל, עם מלקחיים). כן צלחות הזרקת agarose היום לפני הניסוי ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עם נפח קטן של חותם סרט בינוני פרפין E3 כדי למנוע מהם להתייבש.
   5. לפני ההשתלה, למלא את צלחת הזרקת agarose עם מדיום E3 ומקום לתוך חממת 28.5 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.
   6. מאז עוברים dechorionated מקל פלסטיק, או כלים מזכוכית לשימוש או המעיל הפנימי של צלחות פטרי (90 מ"מ קוטר) עם שכבה דקה של agarose 2% ב E3. כן צלחת אחת עבור לארח עוברי dechorionated, צלחת אחת עבור עוברי תורם dechorionated ואת צלחת אחת על כל 40 עוברי מושתלים. אחסן כמתואר עבור צלחת ההזרקה (4.2.4).
3. הכנת פיפטה העברה
   1. חותך את קצה צורה ארוכה אסופה דק פיפטה פסטר הקצה של כוס (2 נפחי מיליליטר, 230 מ"מ אורך, 100 מ"מ קצה ארוך) באורך המאפשר תמרון נוח (אופציונאלי) על ידי גירוד עם סכין יהלום תוך סיבוב עד מפלי טיפ הנחה (איור 1F).
   2. ודא כי הוא חתך ישר. אש פולנית פיפטה העברה זכוכית על ידי החלפה של המשטח לחתוך עם מבער בונזן כדי ליצור קצוות חלקים כדי לא לפגוע עוברי dechorionated (איור 1F).
      הערה: שמירה על קצה פיפטה בתוך הלהבה במשך זמן רב מדי wתוצאה חולה בפתיחה להיות חתומה או להיות קטן מדי עבור העוברים.
4. Dechorionating blastula עובר תורם מארח בשלב
   1. עובר dechorionate באופן ידני עם שני מלקחיים בסדר ידי קריעה פתוחה כל סיסי בלי לגעת העובר, או enzymatically באמצעות פרוטאז לאפשר dechorionation המהיר סימולטני של מספר גדול של עוברים ^9.
      1. כן פתרון מניות 100x של 50 מ"ג / תערובת פרוטאז מיליליטר, לעשות 100 aliquots μL ולאחסן אותם ב -20 ° C.
      2. הוספת 100 μL של פרוטאז המניה עד 10 בינוני מ"ל E3 (הריכוז הסופי של 0.5 מ"ג / מ"ל ​​פרוטאז).
      3. מניח היטב עובר מארח תורם מפותח בשני כוסות זכוכית Erlenmeyer הקטן נפרדות (10 מיליליטר) ולהסיר נוזל ככל האפשר.
      4. הוסף 5 מ"ל של הפתרון פרוטאז 0.5 מ"ג / מ"ל ​​לכל כוס בעדינות מערבולת את העוברים תוך הסתכלות אותם תחת מיקרוסקופ לנתח. Watch עבור כל סימני עיוות של סיסית.
      5. שמור מתערבל. ברגע העובר הראשון הוא מתוך הסיסי (איור 1D, כוכביות), לבצע שלוש שטיפות מהירות עם מדיום E3 כדי להסיר את פתרון פרוטאז ידי שפיכה את רוב הנוזל מילוי הבקבוק על ידי השפיכה בעדינות E3 בצד. אל תאפשר עובר dechorionated לבוא במגע עם האוויר כל אחד מהשלבים הבאים, עד סוף שנת ההשתלה (סעיף 5), כפי שהם יפרצו. השאר פתרון הולם בבקבוק בין שטיפות.
      6. עם טפטפת העברת זכוכית מלוטשת אש, להעביר את העוברים מן הקנקן Erlenmeyer לתוך צלחות זכוכית פטרי או agarose (2% בטווח הבינוני E3) מצופה צלחות פלסטיק. בעדינות פיפטה במהלך ההעברה כדי להסיר כל סיסית נחלש הנותרים.
5. הכנה מחט השתלה
   1. השתמש חולץ מחט למשוך שתי מחטים מכל שפופרת זכוכית קיר דק בורוסיליקט (1.0 מ"מ OD/ 0.78 מזהה מ"מ / 100 מ"מ אורך) עם אותן הגדרות כמו טפטפות microinjection.
      הערה: הגדרות דוגמא עבור חולץ מחט משמש כאן מסופקות ברשימת החומרים. מחטי השתלות אין להכניס זכוכית, כפיצויים זה התא נשאב לתוך המחט.
   2. משוך מחטים מראש, חנות בצלחת פטרי ומאובטח על ידי לחיצה למפצל של מרק moldable או סרט דביק.
   3. לפני ההשתלה להביא את קצה המחט בפוקוס תחת מיקרוסקופ לנתח ולהשתמש מלקחיים לפרוץ את המחט בקצה. שימוש במלקחיים בסדר כדי להתאים את הצורה של המחט לשאוף שיטות חליל-צורה (האיור 2G), או להשתמש חלופיות המתואר על מנת ליצור את צורת קצה ^23.

5. דור כימרה באמצעות blastula השתלה

1. התקנה להשתלות
   הערה: כאן, מנגנון השתלה עצמית התאספו שימש (איור 2 א ).
   1. הר מחט ההשתלה באותו בעל מחט המשמש microinjection לעיל (רכוב על micromanipulator, צעד 3.1.3) (איור 2 א).
   2. ניתק את צינורות ההזרקה מקשרות סוף בעל micropipette אל microinjector וסת הלחץ המשמש microinjections. צרף צינורות ההזרקה מקושר מזרק 1 מיליליטר (איור 2 א ', ב'), המייצג את אסדת ההשתלה.
      1. ודא שכל החיבורים אטומים בחוזקה באמצעות סרט פרפין או מרק moldable. למנוע עובר מלבוא במגע עם אוויר על ידי ההבטחה כי תמיד יש איזה מדיום E3 את מחט ההשתלה עוצמה. הפעל את המזרק באופן ידני למצוץ תאים / נוזל לתוך והחוצה של מחט ההשתלה.
2. יישור עובר
   1. מעביר את העוברים התורמים עם פיפטה הזכוכית לתוך הטור הראשון של עובש agarose. מעביר את עוברי מארח לטורים 2עד 6 מתוך עובש agarose (איור 2F). מקם את העוברים עם פיפטה כך שהצד blastomere פונה כלפי מעלה.
3. הַשׁתָלָה
   1. בעדינות לנוח המחט השתלה אל תא blastomere של עובר תורם לאט להתחנף כ -20 - 50 תאים לתוך מחט ההשתלה (האיור 2H). הימנע מתחנף החלמון.
   2. הרם את המחט השתלת מעובר התורם באמצעות micromanipulator. הזז את צלחת עובש agarose שמאלה והכנס את קצה מחט השתלת דרך הצד של מסת התאים לתוך מוט החיה של עובר המארח הראשון. הפקדה 5 - 10 תאים קרוב לפני השטח על פי מיפוי גורל מראה כי בתחום זה מוליד בתחום המוח הקדמי / עין ²⁴ (איור 2I). שמרו על קצה המחט שקוע בינוני E3 לאורך ההליך כולו.
4. טיפול של עוברים מושתלים
   1. הסר א עובר התורםnd לעזוב את עוברי מארח עובש agarose עבור 1 - 2 שעות ב 28.5 ° C. מלאו זכוכית או פלסטיק (מצופה 2% agarose) צלחות פטרי עם המדיום E3 המכיל 0.003% N-phenylthiourea (PTU) כדי למנוע היווצרות פיגמנט כמו זה יפריע הדמיה. מעבירים את העוברים המארח לתוך הכלים האלה עם פיפטה זכוכית מלוטשת אש לדגור על 28.5 ° CO / N.
      זהירות: יש להשתמש בכפפות בעת טיפול PTU.

6. הגדרת הדמיה חיה

הערה: הגודל הקטן שקיפות אופטית של דג הזברה בשילוב עם ההתפתחות המהירה אפשרו לה להיות מודל חוליות מפתח בתחום ההדמיה vivo של תאים ואיברים שונים. הדמיה יכולה להתבצע על מגוון רחב של מיקרוסקופים, אשר יהיה שונה התקנה ופרמטרים. הסעיפים הבאים מתאר את התקנת הדמית confocal מתאימה הדמיה של התפתחות רשתית ^{5, 8.}

1. עובר chimericבְּחִירָה
   1. בשעה 24 - 26 hpf, להקרין את העוברים המושתלים מתחת היקף הניתוחים ניאון כדי לבחור עוברים בריאים מפותח המראים את התאים התורם מושתלים (H2A-GFP או H2B-RFP שכותרתו) ב primordium העין מתפתחות.
   2. מניחים בצד עד 40 עוברים הרכבה על ידי pipetting לתוך צלחת חדשה ולהוסיף 0.4 מ"ג / מ"ל ​​tricaine methanesulfate (MS222) להרדים את העוברים.
      זהירות: יש להשתמש בכפפות בעת טיפול MS222.
2. עוברים הרכבה
   הערה: משתמשת צלחת ההרכבה המתאימה, תלוי אם הדמיה תבוצע על מיקרוסקופ הפוכה ⁸ או זקוף (מתואר כאן).
   1. הכן כמה 1.5 צינורות פלסטיק מ"ל המכילה 1 מ"ל של agarose נמוכה להמיס 1% ב 0.4 מ"ג / מ"ל ​​MS222 במדיום E3 ולשמור מותכת באמבט מים 40 מעלות צלזיוס.
   2. להתחנף 5 העוברים לתוך טפטף פלסטיק העברה ולתת את העוברים להצטבר הקצה על ידי כוח הכביד. גע פיפטה ההעברהעל פני השטח של אחד הצינורות פלסטיק מוכן המכיל agarose 1% נמוך להמיס ו -0.4 מ"ג / מ"ל ​​MS222 המאפשר את העוברים לשקוע לתוך הצינור תוך הגבלת סכום ההעברה E3.
   3. עוברים הר בצלחת בקוטר 90 מ"מ פטרי בתחום ההדמיה מיקרוסקופ זקוף צלחת זכוכית התחתונה פטרי (בכל גודל) בתחום ההדמיה מיקרוסקופ הפוכה. השתמש בטוש בלתי מחיק לחלק חזותי או צלחת לשני חצאים לתורמי תמונת מארחי WT (בצד אחד) או מארחי morphant (צד שני) באותו הניסוי.
   4. העבר חמשת העוברים מצינור פלסטיק agarose מאכל או פטרי עם 0.5 - 1 agarose המ"ל. הסר agarose עודף עם טפטפת העברת כך טיפה קטנה בלבד (~ 200 - 300 μL) נשאר. אם הדמיה עם מיקרוסקופ זקוף, למנוע הצבת עוברים בתוך 1 ס"מ מהיקף צלחת פטרי. עדשת טבילת הטבילה במים המשמשת הדמיה ייתכן שלא תוכל להיות מרוכזים באזור זה בשל קיר צלחת פטרי (איור 3 א </ Strong>).
   5. השתמש פיפטה microloading (עם הקצה הנשבר) כדי ליישר את העוברים רוחביים עד agarose מתמצק. עבור שני סוגי מאכלים, העוברים הם בזווית רוחבית תקינה אם שתי העיניים משני צדי הראש הם חופפים לחלוטין (מיושרים בממד XY) (איור 3 ב). לשימוש במיקרוסקופ הפוך, העין ליד coverslip חייבת להיות דחף קרוב ככל כדי coverslip ככל האפשר, כדי לאפשר הדמיה באמצעות z-הממד במסגרת המגבלות של רמות ההתמקדות האפשריות.
   6. המשך הרכבת חמש עוברים בכל פעם בטיפות agarose פרט. השתמש יותר 1% agarose נמוכה להמיס להצטרף agarose טיפות זה לזה בצד של המנה, כדי למנוע כל פירוק ותנועה לרוחב במהלך ההדמיה (איור 3 א).
   7. לאחר מלא הקרושה, לכסות את המנה עם מדיום E3 (המכיל 0.003% PTU, 0.4 מ"ג / מ"ל ​​MS222) prewarmed ל -28.5 מעלות צלזיוס.
   8. תוך שימוש באותה גישה כמתואר בשלבים 6.2.2- 6.2.8, הר ~ 20 עוברים מהונדס העלה על 32 מעלות צלזיוס (שלב 1.2.5) בצלחת נפרדת.
3. פרמטרי הדמיה
   הערה: הדמיה להעריך ההתפתחות של transgenes פלורסנט אינו מחייבת רזולוציה מרחבית גבוהה תאית. זה יכול להתבצע עם מטרה W Plan-Apochromat 20X / 1.0 דסק"ש M27 70 מ"מ 1.5 זום.
   1. הגדרת זמן כוח וחשיפת ליזר המבוסס על עוצמת transgene עבור ~ 20 עובר מהונדס עם התפתחות מואצת (העלה כלומר על 32 מעלות צלזיוס; צעד 6.2.8).
      הערה: עבור מחקרים מהופעת ביטוי transgene, עוברי ניסיוני מראות קרינה בזמן הזמן לשגות מוגדר וכך, עובר אלה מואצות הם קריטיים לקביעת הפרמטרים של ההדמיה.
   2. לקבלת המנה הניסיונית, לדמיין כל עובר ולשמור את המיקום ואת להתמקד רמות של העוברים.
      1. בחר עובר כי יש זווית ההרכבה הנכונה (כלומר עם הים לרוחבIDE של העין כמו אופקי ככל האפשר) ואת לב חזק (אינדיקטור של בריאות). בחר עובר עם כמה תאי תורם מושתל (מזוהים על ידי ה- GFP-H2A או תיוג H2B-RFP) בעיקר ברבע הגחון הקדמי של הרשתית מתפתחת (שם הגל של ביטוי גנים מתחיל) (איור 3 ג).
         הערה: עוברי דג הזברה, את דופק הממוצע הוא 120 - 180 פעימות / ²⁵ דקות. בשינה עוברת בהרדמה, פעימות לב בריאות עשויות להיות בטווח 60 - 120 פעימות / דקה. איטי דופק היכול להוות מדד הכדאיות מופחת ואלה עוברים צריך להיות מהמחקר.
   3. גדר Z- ערימות של חלקים אופטיים ב 2 מיקרומטר במרווחים דרך הרשתית של עד 15 עובר.
      הערה: המספר הכולל של עוברים ניתן הדמיה בכל ניסוי נתון יהיה תלויים פרמטרים בודדים (זמן חשיפה וגדל Z- מחסנית). הזמן שלוקח לתמונת פעם 1 נקודות עבור כל העוברים נבחרו חייב להיות shorter מאשר המרווח בין נקודות הזמן. על ידי הקרבה כמה רזולוצית עומק, יותר עוברים ניתן הדמיה בתוך מרווחי הזמן. המגבלות של Z- המחסנית נבחרות כמו קצוות לרוחב המדיאלי של העין העוברית רכוב ו -30 מיקרומטר מתווספים הצד לרוחב בהגדרת מיקרוסקופיה הזקופה, כמו בעיני העוברים המתפתחים משמרת התקנה זו בכיוון z כמו העוברים לגדול בין לילה. תוצאת ערימות 100 - 170 עובי מיקרומטר (50 - 85 תמונות / עין).
   4. צלמו תמונות בכל 24 דקות ב 32 מעלות צלזיוס (שווה ערך ל 0.5 hpf במרווחים) באמצעות המתאים לייזר / ערוץ אל transgene.
      הערה: עובר להישאר על הבמה לאורך כל הזמן לשגות כולו בתוך מחומם חדר המקיף את המיקרוסקופ כולו. בעוד ניתן לבצע את הניסוי על 28 מעלות צלזיוס, בטמפרטורות חמות משמשות כדי להאיץ פיתוח ולהבטיח כי נקודות הזמן הרלוונטיות בניסוי הם צלמו בתוך 16 - 24 שעות הזמן לשגות התקופה.
   5. תמונהערוצים המייצגים את תווית התורם (H2A-GFP או-RFP H2B - אופציונאלי) transgene (Atoh7: RFP או Vsx1: GFP) באמצעות סריקה סדרתית. לניתוח, לנצל את תווית התורם רק לבחור עובריים מתאים כמתואר (לקחת אחד Z- מחסנית בתחילת ההדמיה) ולאחר מכן לבצע זמן לשגות רק בערוץ ללכוד את ביטוי transgene.
      הערה: לחילופין, להשתמש בתווית התורם רק כדי לבחור עוברי המתאים (שאוכלוסייתן מונה התאים המושתלים אישר ברבע הגחון הקדמי) ותמונה רק בערוץ transgene, ומורידים בחצי זמן הדמיה וכמעט הכפלה של מספר העוברים ניתן הדמיה וניתח לכל הניסוי (איור 4).

תוצאות

עבודה זו מציגה פרוטוקול ניסוי להעריך שינויים בעיתוי ביטוי גנים כאשר אבות רשתית סוג בר להתפתח בתוך עובר מארח morphant. עובר מארח ניסיוני הם morphants Ptf1a, אשר חסרים את interneurons האופקי amacrine ביניים הנולד של הרשתית ^{7, 26.} אלה היו לעומת...

Discussion

הבנתי את המידה שבה תאי שכנים להשפיע עיתוי של הביטוי של גורמים בקביעת גורל תא חיוני חיוני כאשר מכוונים להורות עוברי או מושרה ביעילות תאי גזע מולטיפוטנטיים להתמיין לסוג תא ספציפי שלאחר mitotic או אפילו רקמה בדוגמת. יתר על כן, בחינת האירועים המולקולריים האלה בתאים המתפתחי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bioline	BIO-41025	Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C
Agarose low melt	Sigma	A9414-100G	Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
borosillicate glass capillary tube w/o filament	SDR Scientfic	30-0035	alternatives with similar diameter can be used
borosillicate glass capillary tube with filament	SDR Scientfic	30-0038	alternatives with similar diameter can be used
glass petri dishes (60 mm diameter)	Science Supply	1070506	any glass alternative of any size
Injection tube (2 m)	Eppendorf	524616004	This connects the needle holder to the syringe during transplantation
Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)	Adaptive Science Tools	PT-1	alternatives with similar shape can be use
microneedle holder	Narishige	M-152	any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
microinjector	Narishige or Eppendorf Femtojet		Pneumatic injector using gas pressure
micromanipulator	Coherent Scientific	M330IR	similar alternatives can be used
microloader tip	Eppendorf	5242956003
Mineral oil	Sigma	M5904-500ML
needle puller	Sutter Instruments	Model P-2000	Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
Parafilm	Interpath	PM996	any paraffin film
Pasteur pipette plastic	Samco Scientific	202
Pasteur pipette glass	Hirschmann Laborgeraete	9260101
Pronase	Sigma	P5942-25MG	Protease Type XIV
N-phenyl thiourea	Sigma	P7629-25G	PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use.
Qiaquick gel extraction	Qiagen	28704	any alternatives to purify DNA can be used
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104	any alternatives to purify RNA can be used
SP6 mMessage kit	Qiagen	AM1340	any alternatives to transcribe DNA using SP6