In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

Zusammenfassung

Live Verfolgung einzelner WT retinalen Progenitoren in verschiedenen genetischen Hintergründen ermöglicht die Bewertung des Beitrags der Zelle nicht autonomen Signalisierung während der Neurogenese. Hier wird eine Kombination von Knock-Down, Chimäre Generation über Embryo - Transplantation und in - vivo - Zeitraffer-konfokale Abbildung wurde für diesen Zweck verwendet.

Zusammenfassung

Die genetischen und technischen Stärken haben die Zebrabärbling wirbel ein wichtiger Modellorganismus , in dem die Folgen von Gen - Manipulationen vorgenommen können während des schnellen Entwicklungszeit in vivo verfolgt werden. Mehrere Prozesse können einschließlich der Zellproliferation, der Genexpression, Zellmigration und Morphogenese untersucht werden. Wichtig ist, kann die Erzeugung von Chimären durch Transplantationen leicht durchgeführt werden, mosaic Kennzeichnung und Verfolgung einzelner Zellen unter dem Einfluß der Host-Umgebung ermöglicht. Zum Beispiel durch funktionelle Genmanipulationen des Wirtsembryo Kombination (zB durch Morpholino Mikroinjektions) und die Live - Darstellung, die Auswirkungen von extrinsischen, Zelle nichtautonomen Signale (von der gentechnisch veränderten Umgebung zur Verfügung gestellt) auf einzelnen transplantierten Spenderzellen beurteilt werden. Hier zeigen wir, wie dieser Ansatz verwendet wird, das Auftreten von fluoreszierenden Transgen-Expression als Proxy für den Zeitpunkt des Zellschicksals determin zu vergleichenation in verschiedenen genetischen Host-Umgebungen.

In diesem Artikel stellen wir das Protokoll für Mikroinjizierung Genaktivität Spenderzellen zu markieren und Knock-Down in Wirts Embryonen zu verursachen, eine Beschreibung des Transplantationstechnik verwendeten chimären Embryonen zu erzeugen, und das Protokoll für die Vorbereitung und in - vivo - Zeitraffer-konfokale läuft Bildgebungs mehrerer Embryonen. Insbesondere Multipositions-Bildverarbeitung ist entscheidend, wenn Timing von Ereignissen wie dem Ausbruch der Genexpression zu vergleichen. Dies erfordert die Datenerfassung von mehreren Kontroll- und Versuchs Embryonen gleichzeitig verarbeitet. Ein solcher Ansatz leicht für Studien der extrinsische Einflüsse in jedem Organ oder Gewebe der Wahl erweitert werden kann, zugänglich Bildgebung zu leben, vorausgesetzt, dass Transplantationen leicht nach etablierten embryonalen Schicksal Karten ausgerichtet werden können.

Einleitung

Die Fähigkeit , wichtige Entwicklungsprozesse in einem in - vivo wirbel sichtbar zu machen , um die Herstellung der Zebrabärbling einen Schlüssel Modell für die Untersuchung normalen und Krankheitszuständen ( beschrieben in ^{1, 2)} beigetragen hat. Insbesondere ist die neurale Netzhaut eine zugängliche Teil des zentralen Nervensystems. Die Netzhaut eignet sich für leicht Studien der Neurogenese führen aufgrund ihrer hoch organisierten, aber relativ einfache Struktur, und seine hochkonservierten Neuron - Typen über Vertebratenarten ^3. Dynamik der zellulären Verhaltensweisen wie Proliferation, Zellzyklus Ausgang, asymmetrische Zellteilung, Schicksal Spezifikation, Differenzierung und neuronalen Schaltkreise Bildung kann über den gesamten Prozess von Retinogenese folgen, die in der zentralen Netzhaut des Zebrabärbling von 3 d postfertilization abgeschlossen ist ( dpf) ^{4, 5,}ref "> ^{6, 7.}

Darüber hinaus können die funktionalen Anforderungen verschiedener Gene in jeder der oben genannten Stufen gleichzeitig in der Zebrabärbling Retina beurteilt werden, einen Vorteil gegenüber anderen Wirbel Modelle, in denen die Bereitstellung Phänotypen aus der Anwendung der Gen-Knockout-Techniken, kann sie nur auf Obduktion bewertet werden von Geweben fixiert. Insbesondere die Verwendung von transgenen Linien in dem wir die Expression von fluoreszierenden Proteinen als Reporter Transgenen in der Netzhaut zu visualisieren und zu überwachen, ermöglicht es uns, die zeitliche Auflösung der Genexpression zu erhalten, die die Entstehung eines bestimmten neuronalen Zelltyp zu Grunde liegt. Aufgrund der schnellen Entwicklung von Zebrabärbling können diese Ereignisse während der gesamten Entwicklungszeit visualisiert werden, wodurch tiefere Einblicke in die zeitliche Bedeutung der Genexpression Verhalten in Bezug auf neuronale Zellidentitätserfassung und Zellenbereitstellt.

Schließlich können diese Ansätze wirksam mit der Erzeugung von Chimären über Transplantationen in der Zebrabärbling kombiniert werden, was zu Einsichten in zwei wesentliche Aspekte der Genfunktion. Erstens Zellen transplantiert von einem Spender Embryo untersuchen, in denen ein bestimmtes Gen wurde umgeworfen, während sie in einem unbeschrifteten Wildtyp-Umgebung zu entwickeln, ermöglicht es uns, relevante Informationen über die Genfunktion in einem zellautonome Weise zu erhalten. Dies führt zu wichtigen Erkenntnissen über die Funktion der retinalen Schicksal bestimmenden Faktoren in den Vorläuferzellen sie in der Regel ausgedrückt in. Dies wird durch die Prüfung des Entwicklungsschicksal Ergebnis von Vorläufern exemplifiziert , die nicht mehr funktionsfähiges Protein aus diesen Genen erzeugen können ^{4, 6, 8, 9.} Unter Verwendung dieses Ansatzes haben wir gezeigt , dass viele Schicksal bestimmenden Faktoren (zB Vsx1, Atoh7, PTF1A, Barhl2) handeln Zelle-autonomously spezifische Retina-Nerven Schicksale zu treiben; der Mangel der Genexpression führt in erster Linie zu einem Schicksal Schalter, so dass die Zellen mit Gen lebensfähig bleiben , durch Knockdown eine alternative Zellschicksal ^{4, 6, 7, 10} übernehmen. Zweitens kann eine solche Chimären-Experimente verwendet werden, um zu beurteilen, wie Wildtyp-Vorläufern verhalten, wenn sie in verschiedenen genetischen Umgebungen zu entwickeln. Zum Beispiel durch die Entwicklung von WT - Zellen zu vergleichen , die in der Regel ein Gen von Interesse (und Reporter - Transgen) in einem WT gegen manipulierte Host - Umgebung (zB Gen - Knockout / Knockdown), die daraus resultierenden Auswirkungen auf die Genexpression und Zellschicksal zum Ausdruck bringen kann beurteilt werden . Der Mangel an bestimmten Neuronentypen in der Host-Umgebung, zum Beispiel, sie Wildtyp-Vorläuferverhalten nicht autonom in einer Zelle Art und Weise ist, um Bias gezeigt zu beeinflussen Richtung in das unterrepräsentierte o Differenzierungsr fehlt neuron Typen ^{4, 7, 11, 12.} Da die Netzhautneuronen in einer konservierten histogenic Reihenfolge durch die sequentiell zeitlich Expression spezifischer neuronaler Schicksal Determinante Gene (Schicksal Genexpression) ( beschrieben in ¹³⁾ geboren, haben wir diese Methoden zu zeigen , wie der Zeitpunkt des Ausdrucks Schicksal Gen in Wildtyp - Vorläufern betroffen ist, wenn eine solche Vorläufern in Retina-Host-Umgebungen mit induzierten anomale Zellzusammensetzungen zu entwickeln. Hier erläutern wir diese Ansätze als Beweis dafür , wie die Kombination aus relativ Standard und weit verbreitete Techniken , um die Prüfung des Timing des Schicksals Genexpression ermöglicht retinalen Vorläufern ⁸ in der ^{Entwicklung, 9.}

Dieses Protokoll beschreibt einen experimentellen Ansatz, Zeitraffer-Bildgebung mit der Leichtigkeit proBildung Transplantation in der ex vivo Entwicklung Zebrafischembryo einzelne mosaik markierten Zellen während der gesamten Dauer der Entwicklungs Retinogenese zu folgen. Durch das Durchführen funktioneller Genmanipulationen entweder im Wirtsembryo, Spenderembryo, beide oder keines von beiden, kann man die Zelle Autonomie der Genfunktion bewerten. Dieser Ansatz kann in jedem anderen System weitgehend auf ähnliche Forschungsfragen angepasst werden, für die die einzelnen Komponenten hier skizzierten geeignet sind.

Protokoll

Alle Verfahren wurden nach der Australian National Health und Medical Research Council Verhaltenskodex der Bestimmungen durchgeführt für die Pflege und Verwendung von Tieren und wurden von den institutionellen Ethikkommissionen genehmigt.

1. Herstellung von Zebrabärbling

1. Erwachsene Fische Paarung
   1. Richten Sie wachsene Fische als Paare (oder zwei Paare) in geeigneter Größe Zuchtbecken am Abend vor der Verwendung.
   2. Um die Weibchen vom Männchen getrennt zu halten, verwenden Sie einen Teiler, den Fisch zu ermöglichen, um zu sehen, aber nicht berühren.
   3. Am Morgen nach dem Einschalten der Beleuchtung, entfernen Sie die Trennwände und lassen die Fische ungestört zu paaren.
   4. Nach erfolgreicher Paarung setzen wachsene Fische wieder in ihre ursprüngliche Tanks.
      HINWEIS: Host und Donorstämme können die gleichen sein, zum Beispiel alle Wildtyp (WT) Stämme. (: GapRFP atoh7), Tg (atoh7: gapGFP) Für diese Studie wurden die Spender Embryonen aus den transgenen Linien Tg abgeleitet oderTg (vsx1: GFP) in denen die Expression von Faktoren Schicksal Determinante antreibende frühen oder späten neuralen Schicksal visualisiert werden jeweils ^{14, 15, 16.} Um können die Auswirkungen von unterschiedlichen genetischen Umgebungen, Wirt Embryonen spezifische Mutanten oder morphants sein zu vergleichen, wie weiter unten beschrieben.
2. Besamungs
   1. Verwenden Sie ein Teesieb die Eier aus dem Brutkasten zu sammeln. Prüfen Sie, ob Eier alle 15 Minuten die Zeit der Geburt zu ermitteln und sicherzustellen, dass Single-Zell-Stadium Embryonen für die nachfolgenden Schritte gesammelt.
   2. Spülen Embryonen mit E3 - Medium (5 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,4 mM CaCl _2, 0,9 mM MgCl ₂ und 2% Methylenblau in destilliertem Wasser) und sie in Petrischalen mit ~ 40 ml E3 ¹⁷ bei einer maximalen Dichte von 50 Eier pro 90 mm Durchmesser Petrischale.
   3. Beschriften Sie die Petrischalen mit dem Stamm Namen, Datum und Uhrzeit derGeburt. Verwenden Sie eine Pasteur Transferpipette alle Ablagerungen zu entfernen, während gerade die Embryonen unter dem Binokular.
   4. Halten Sie die Embryonen bei 28,5 ° C bis ca. 3 h postfertilization (HPF) für die Transplantation, oder fahren Sie mit Mikroinjektionen.
      HINWEIS: Bei Transplantationen, Ziel für Spender und Empfänger Embryonen bei ähnlichen Alters. Daher verwenden unterschiedliche Aufzucht Temperaturen zwischen 25 - 32 ° C nach Kimmel et al. ¹⁸ zu verlangsamen oder eine Kupplung von Embryonen zu beschleunigen , um den anderen passen.
   5. Halten ~ 20 der transgenen Spenderembryonen uninjizierten bei 32 ° C aus der Zeit der Sammlung bis Zeitraffer-Bildgebung (24-28 h später).
      HINWEIS: Diese werden schneller entwickeln als die experimentellen Kohorte und Fluoreszenzmarker früher auszudrücken. Sie können somit die Parameter verwendet werden, einzurichten (Laserleistung, Verstärkung) für die Bildgebung. In diesem speziellen Beispiel Bildgebung der experimentellen Kohorte beginnt Transgen-Expression vor der Anwendung (zu beurteilender genaue Zeitpunkt dieses Ereignisses).

2. Vorbereitung für Mikroinjektions

1. Mikroinjektionsnadel Vorbereitung
   1. Mit einer Nadel Abzieher ziehen Nadeln aus jedem Borosilicatglas Kapillarrohr (1,0 mm OD / 0,78 mm ID / 100 mm lange Glaskapillare) in der Mitte zwei Nadeln von gleicher Länge zu erhalten. Ziel ist es für Nadeln, die mit langen Wellen hin verjüngen.
      HINWEIS: Beispieleinstellungen für die Nadel Abzieher hier verwendet werden, in die geliefert Materialliste.
   2. Lagern Sie die gezogen Nadeln in einer Petrischale und sichern, indem sie in einem Streifen von formbaren Kitt oder Klebeband drücken.
   3. Vor der Injektion bringen die Spitze der Nadel im Fokus unter einem Binokular und verwenden Zange an der Spitze offen, die Nadel zu brechen. Ziel für eine scharfe konische Spitze mit einer kleinen Öffnung (1C).
2. Morpholino Vorbereitung für Host-Embryonen
   1. Bestellen Morpholino-Oligonukleotide für das Gen von Interesse sowie eine Standard-Steuer Morpholin oder einem geeigneten 5-Basenpaar-Mismatch zu steuern, um Verfahrens- und Handhabungseffekte entwickelt.
      HINWEIS: Hier wird eine Übersetzung PTF1A morpholino mit der Sequenz 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 'blockiert, die die Entwicklung der Zwischen geboren horizontal und amakrinen Zellen hemmt, und ein Standard-morpholino Steuer Zebrabärbling Targeting menschlichen beta-Globin-Intron-Mutation (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA -3 ') ^{7, 19} wurden verwendet.
   2. Bereiten Sie eine 1 mM Morpholino-Stammlösung (~ 8-8,5 ng / nL) und bei Raumtemperatur lagern.
   3. Am Tag der Injektion, bei 65 ° C eine aliquote Menge (10 ul) Morpholin Wärme für 10 min, drehen kurz und auf Eis von 65 ° C abkühlen (nach dem es bei Raumtemperatur während des Betriebs gehalten werden kann). thist umkehren wird möglicherweise innerhalb der Morpholino Lösung Aggregation jede, die Wirksamkeit des Zuschlags verringern kann.
      1. Für PTF1A Morpholin und gleichwertigen Standard-Steuer Morpholino-, eine funktionierende Lösung von 6 ng / nL herzustellen, indem man die Morpholino-Stammlösung mit destilliertem Wasser verdünnt wird. Halten Sie bei RT.
         HINWEIS: Verwenden Sie 2 nL des Morpholin pro Embryo als PTF1A Morpholino erfordert einen relativ hohen Arbeitskonzentration von 12 ng pro Embryo wie zuvor ⁷ bestimmt. Für die meisten Morpholinos mit 2 - 5 ng pro Embryo ist wirksam, so verdünnen, um die Lager auf 2 - 5 ng / nL und injizieren 1 nL in jedem Embryo.
3. fluoreszierende Histon Fusion Reporter Vorbereitung Konstrukte für Embryonen Kennzeichnung Spender
   ANMERKUNG: Um Spenderzellen innerhalb der Wirtsembryos zu unterscheiden / sichtbar zu machen, gibt es verschiedene Ansätze, um die Spenderembryo zu markieren, einschließlich Mikroinjektion von H2A-GFP (bei Verwendung von transgenen Spendern mitrot fluoreszierenden Reporter) oder H2B-RFP (wenn transgene Spender mit grün fluoreszierenden Reporter) mRNA in den Dotter der Single-Zell-Stadium Spender Embryo verwendet wird.
   1. Linearisieren mindestens 1 & mgr; g Plasmid, das das Reporter-DNA enthält.
      HINWEIS: Hier pCS2 + Plasmid (erzeugt und freundlicherweise von Prof. David Turner von der University of Michigan und Prof. Ralph Rupp vom Biomedizinischen Zentrum München zur Verfügung gestellt), die H2A-GFP oder H2B-RFP (erzeugt durch Dr. Christopher Wilkinson, Royal Holloway, University of London) wurde mit NotI Restriktionsenzymverdau linearisiert.
   2. Reinige DNA unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   3. Transkribieren mRNA im Handel erhältlichen Kits mit geeigneten Polymerase gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für die pCS2 + Plasmid, verwenden Sie einen SP6-Polymerase-Kit.
   4. Reinige mRNA durch Isopropanolpräzipitation gefolgt von kommerziellen Kits oder Phenol-Chloroform-Extraktion unter Verwendung von nach Herstellerangabens. Verdünnen Sie die mRNA in Reinstwasser (20 - 30 & mgr; l), messen die Konzentration mit einem Spektralphotometer und bei -80 ° C.
   5. Am Tag der Injektion, eine Arbeitslösung von mRNA in sterilem Wasser mit einer Endkonzentration von 100 ng / ul und auf Eis halten vorzubereiten. Nicht verwendete mRNA Lager zurück bis -80 ° C.

3. Mikroinjektion von Morpholinos und / oder mRNA in Einzelzell-Stadium Embryos

HINWEIS: Mikroinjektionen werden verwendet , um alle Spenderzellen zu markieren und die verschiedenen Host - Umgebungen (Kontrolle und Knock-Down) und beinhalten Injektionen von mRNA oder Morpholino Antisense - Oligonukleotide ^{21 20,} vorzubereiten.

1. Laden und die Injektionsnadel Kalibrierung
   1. Backload die Injektionsnadel mit 3 ul der Morpholino und / oder Histon-fluoreszierendes Fusions mRNA Lösung Micropipettenspitzen.
   2. Schütteln Sie die solutIonen in Richtung der Spitze Injektionsnadel, bis es noch keine Blasen sind. Verwenden Injektionsnadeln mit einem inneren Glaseinsatz, so dass die Lösung wird in erster Linie an der Spitze durch Kapillarwirkung gezogen werden.
   3. Bringen Sie die Injektionsnadel an einer Halterung montiert in einem Mikromanipulator (3D manuelle Mikromanipulator) und eine gute Abdichtung im Rohrgehäuse gewährleisten.
   4. Schalten Sie die Strom- und Gasversorgung der Druck geregelt Mikroinjektors.
   5. Tauchen Sie die Nadelspitze in einem Tropfen Mineralöl in einer Schale (wenn ein graticule Okular) oder fahren Sie mit der Nadelspitze direkt über einem Mikrometer Folie, um das Tropfenvolumen zu kalibrieren. Messen der Einspritzmenge durch das Fußpedal gedrückt und stellen den Gasdruck und / oder die Dauer der Zeit, bis das Einspritzvolumen auf 1 nL äquivalent ist (125 & mgr; m Durchmesser).
      HINWEIS: Der Vorteil des Mikrometers Rutsche ist, daß die Messungen unabhängig von der Vergrößerung im Mikroskop verwendet wird, jedoch durch die Verwendung Okularstrichplatte instead, die Injektion Abfall und Maßstab können gleichzeitig im Fokus sein.
2. Embryo Mikroinjektions
   1. Platzieren Sie einen Objektträger in einer Petrischale und die Verwendung einer Transferpipette Einzelzellenstadium Embryos entlang der Schiebekante zu deponieren. Richten Sie in einer einzigen Spalte eine Micropipettenspitze mit der Hälfte der dünner Spitze abgeschnitten. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich mit einer feinen Transferpipette Bewegungen während Injektionen (Abbildung 1A) zu verhindern.
   2. Senken Sie die Nadel in Richtung jedem Embryo, und dringen in das Chorion und Eigelb in einer glatten Hub (Abbildung 1B).
   3. Sobald die Nadelspitze in den Dotter, microinject zentriert durch das Fußpedal drücken. Injizieren 1 nL von H2A-GFP oder RFP H2B-mRNA in den Dotter eines einzelnen Zellstadium Spenderembryo (transgene). Inject 2 nL von Standard-MO oder PTF1A MO in den Dotter eines einzelnen Zellstadium Wirtsembryo Wildtyp durch das Fußpedal zweimal drücken. Erfolgreiche Injektionen können durch die Smal sichtbar gemacht werden l räumliche Verformung im Eigelb.
   4. Entfernen Sie die Injektionsnadel, bewegen Sie die Schüssel, die Embryonen mit dem nächsten Embryo in die richtige Position zu bringen und weiterhin die Injektion, bis die gesamte Spalte von Embryonen injiziert werden (50 - 60 Für Embryonen).
   5. Nachdem alle Embryonen eingespritzt wird, heben Sie die Schale in einem 30 bis - ° Winkel 45 und einen sanften Strom von E3 Medium (Squeeze-Flasche) verwenden, um die injizierten Embryonen in eine neue, saubere Petrischale zu übertragen.
   6. Platzieren Sie den Embryo Schale in einem Inkubator (entweder bei 28,5 ° C oder einer anderen Temperatur, um sicherzustellen, dass die Spender- und Aufnahme Embryonen bei äquivalenter Alters sind).
   7. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1 - 3.2.6 als notwendig ~ 100 Spender Embryonen zu erhalten oder ~ 200-250 Host-Embryonen.
   8. Bei 1 bis 2 HPF, überprüfen Sie die Embryonen unter einem Binokular und entfernen Sie alle unbefruchtete Eier, die nicht so weit fortgeschritten sind, um die 2- oder 4-Zellen-Stufen mit einer Pasteur-Transferpipette.

4. Vorbereitung für Transplantationen

ontent "> HINWEIS: Transplantationen verwendet werden chimären Embryonen zu erzeugen , um die Effekte der verschiedenen genetischen Host - Umgebungen ermöglicht innerhalb äquivalenten WT Donator Progenitoren ^{9, 22, 23} zu beurteilen.

1. Spender Embryo-Auswahl
   1. Bei 3 HPF, überprüfen Sie die Spenderembryonen bei 2 - 5-fach Vergrößerung für die Kennzeichnung Signal unter einem Fluoreszenzmikroskop. Wählen Sie gut entwickelte (symmetrische Zellmasse mit gleich großen Zellen) Embryonen mit einem starken Fluoreszenzsignal mit dem GFP-Plus-Filter (460-500 nm Anregung, 510 nm langen Pass Emission) oder Texas-Rot-Filter (540-580 nm Anregung, 610 nm lang~~POS=TRUNC) (1D). Die transgenen Reporter sind noch nicht zum Ausdruck gebracht.
2. Agarose Injektion Platte und Petrischale Vorbereitung
   1. Gießen Agarose geschmolzen 2% verdünnt in E3 Medium in einen Durchmesser von 90 mm Petrischale und abkühlen lassen, bis das Gericht sicher istberühren. Hot Agarose kann sonst die Form verformen.
   2. Schwimmer eine Plastikform mit keilförmigen Vorsprüngen (6 x 25 / Schimmel) auf dem Agarose (2D, E). Vermeiden Sie Luftblasen durch eine Seite der Form auf die Agarose platzieren und langsam weiter unten auf der anderen Seite. Sicherstellen, dass die Form in der Schale oder in Richtung der Seite der tiefsten Stelle der keilförmigen Vorsprünge zentriert ist genügend Freiraum für die Transplantation Nadel zu ermöglichen.
   3. Lassen Sie die Agarose vollständig bei RT erstarren.
   4. Legen Sie die Agarose - Schale bei 4 ° C für 30 min und entfernen Sie die Formen durch sanft von einer Ecke anheben (zB mit einer Pinzette). Bereiten Sie Agarose Injektion Platten am Tag vor dem Experiment und lagern bei 4 ° C mit einem kleinen Volumen von E3 Medium und Paraffinfilm Dichtung zu verhindern, dass sie vor dem Austrocknen.
   5. Vor der Transplantation, füllen Sie die Agarose Injektion Platte mit E3 Medium und in einen 28,5 ° C Inkubator für mindestens 30 min.
   6. Da dechorionated Embryonen Kunststoff-Stick, entweder Verwendung Glasschalen oder Beschichtung der Innenseite von Petrischalen (90 mm Durchmesser) mit einer dünnen Schicht von 2% Agarose in E3. Bereiten Sie ein Gericht für dechorionated Host Embryonen, ein Gericht für dechorionated Spenderembryonen und ein Gericht für alle 40 transplantierten Embryonen. Speichern Sie wie für die Einspritzplatte beschrieben (4.2.4).
3. Transferpipette Vorbereitung
   1. Schneiden Sie die Spitze eines langen Form fein Glasspitze Pasteurpipette gezogen (2 ml Volumen, 230 mm Länge, 100 mm lange Spitze) auf eine Länge, die während drehen, bis die Spitze fällt für bequemes Rangieren (optional) durch Kratzen mit einem Diamantmesser erlaubt aus (1F).
   2. Stellen Sie sicher, dass der Schnitt gerade ist. Feuerpolitur der Glastransferpipette durch Drehen der Schnittfläche in einem Bunsenbrenner glatten Enden zu erzeugen, um nicht die dechorionated Embryonen (1F) beschädigt werden .
      HINWEIS: Halten Sie die Pipettenspitze in der Flamme zu lange wkrank Ergebnis in der Öffnung für die Embryonen werden versiegelt oder zu klein zu werden.
4. Dechorionating Blastulastadium Spender und Wirt Embryonen
   1. Dechorionate Embryonen entweder manuell mit zwei feinen Pinzette durch Aufreißen jedes Chorion , ohne den Embryo zu berühren, oder enzymatisch Protease unter Verwendung von ⁹ gleichzeitige schnelle dechorionation einer großen Anzahl von Embryonen zu ermöglichen.
      1. Bereiten Sie eine 100x Stammlösung von 50 mg / ml Protease-Mischung, stellen 100 & mgr; l-Aliquots und lagern Sie sie bei -20 ° C.
      2. Füge 100 & mgr; l der Stamm Protease zu 10 mL E3 Medium (Endkonzentration von 0,5 mg / ml Protease).
      3. Platzieren Sie gut entwickelte Host und Spenderembryonen in zwei separaten kleinen Erlenmeyer-Glasbecher (10 ml) und so viel Flüssigkeit wie möglich zu entfernen.
      4. 5 ml der 0,5 mg / ml Protease-Lösung zu jedem Becher und vorsichtig schwenken die Embryonen, während mit Blick auf sie unter einem Binokular. Achten Sie auf Anzeichen von Verformung des Chorion.
      5. Halten Sie wirbelnden. Sobald der erste Embryo aus dem Chorion (1D, Sternchen) ist, führen drei schnelle Spülungen mit E3 Medium durch Ausgießen der größte Teil der Flüssigkeit und Nachfüllen der Flasche , die die Protease - Lösung zu entfernen , indem Sie vorsichtig an der Seite in der E3 zu gießen. Nicht in dechorionated Embryonen in Kontakt mit der Luft in einem der nachfolgenden Schritte bis zum Ende der Transplantation (Abschnitt 5) zu kommen, da sie platzen wird. Lassen Sie ausreichend Lösung in dem Kolben zwischen Spülungen.
      6. Mit dem feuerpolierten Transferpipette Glas, übertragen Sie die Embryonen aus dem Erlenmeyer-Becher in Petrischalen aus Glas oder Agarose (2% in E3 Medium) beschichtet Plastikschalen. Gently Pipette während der Übertragung alle verbleibenden geschwächt Chorion zu entfernen.
5. Transplantation Nadel Vorbereitung
   1. Mit einer Nadel Abzieher zwei Nadeln aus jeder Borosilikat dünnwandiger Glasrohr zu ziehen (1,0 mm Außendurchmesser/ 0,78 mm ID / 100 mm Länge) mit den gleichen Einstellungen wie die Mikroinjektionspipetten.
      HINWEIS: Beispiel Einstellungen für die Nadel puller hier verwendet werden, in der Materialliste geliefert. Transplantations Nadeln haben keine Glaseinsatz, da dies schädigt die in die Nadel gesaugt Zellen.
   2. Ziehen Nadeln im Voraus, lagern in einer Petrischale und sichern, indem sie in einen Streifen von formbaren Kitt oder Klebeband drücken.
   3. Vor der Transplantation bringen die Spitze der Nadel im Fokus unter einem Binokular und verwenden Zange an der Spitze offen, die Nadel zu brechen. Verwenden feinen Pinzette die Form der Nadel einzustellen , um eine Flöte-Form (2G), oder verwenden Sie alternative Methoden , um die Spitzenform ²³ zu erzeugen , beschrieben , um zu zielen.

5. Chimera-Generation über Blastula Transplantation

1. Transplantation Setup
   HINWEIS: Hier wird eine selbstorganisierende Transplantationsvorrichtung verwendet wurde (2A ).
   1. Montieren Sie die Transplantation Nadel in der gleichen Nadelhalter verwendet für Mikroinjektions oben (montiert auf Mikromanipulator, Schritt 3.1.3) (2A).
   2. Trennen Sie das Injizieren Schlauch, der das Ende der Mikropipette Halter auf den Druck geregelt Mikroinjektors für Mikroinjektionen verwendet verbindet. Befestigen der Einspritzschlauch, der auf eine 1 - ml - Spritze (2A, B) verbunden ist, die die Transplantation rig darstellt.
      1. Stellen Sie sicher, dass alle Anschlüsse dicht sind mit Paraffinfilm oder formbaren Kitt. Verhindern, dass Embryonen aus mit Luft in Berührung kommen, indem sichergestellt wird, dass es immer einige E3 Medium bei der Transplantation Nadel selbst ist. Betreiben Sie die Spritze manuell Zellen / Flüssigkeit in die und aus der Transplantation Nadel zu saugen.
2. Embryo Ausrichtung
   1. Übertragen Sie die Spenderembryonen mit der Glaspipette in die erste Säule der Agarose Form. Übertragen Sie die Host-Embryonen in den Spalten 2bis 6 der Agarose - Form (Figur 2F). Positionieren Sie die Embryonen mit der Pipette, so dass die Blastomere Seite nach oben zeigt.
3. Transplantation
   1. Die Transplantation Nadel auf eine Blastomere Zelle eines Spenders Embryo sanft ruhen und langsam etwa 20 saugen - 50 Zellen in die Transplantation Nadel (Abbildung 2H). Vermeiden Sie das Eigelb aufsaugt.
   2. Heben Sie die Transplantation Nadel aus dem Spender Embryo mit dem Mikromanipulator. Bewegen Sie die Agarose-Formschale auf der linken Seite und legen Sie die Transplantation Nadelspitze durch die Seite der Zellmasse in das Tier Pol des ersten Host-Embryo. Kaution von 5 bis 10 Zellen in der Nähe der Oberfläche nach dem Schicksal Mapping zeigt , dass dieser Bereich gibt Anlass zu der Vorderhirns / Augenfeld ²⁴ (2i). Halten Sie die Nadelspitze in der E3 getaucht Medium während des gesamten Verfahrens.
4. Pflege von transplantierten Embryonen
   1. Entfernen Sie die Spenderembryonen einnd lassen Sie die Host-Embryonen in der Agarose-Form mit 1 - 2 h bei 28,5 ° C. Füllen Glas oder Kunststoff (beschichtet mit 2% Agarose) Petrischalen mit E3-Medium, enthaltend 0,003% N-Phenylthioharnstoff (PTU) Pigmentbildung zu verhindern, wie dies mit bildgebenden stören. Übertragen Sie die Host-Embryonen in diese Gerichte mit der feuerpolierten Glaspipette und Inkubation bei 28,5 ° CO / N.
      ACHTUNG: Handschuhe tragen, wenn PTU Handhabung.

6. Live-Imaging-Setup

HINWEIS: Die geringe Größe und optische Transparenz von Zebrabärbling mit der raschen Entwicklung kombiniert haben erlaubt es für in - vivo - Bildgebung von verschiedenen Zellen und Organe ein Schlüsselwirbel Modell zu werden. Imaging kann auf einer Vielzahl von Mikroskopen durchgeführt werden, die in Aufbau und Parameter unterscheiden. Nachfolgend wird eine geeignete konfokale Bildgebung Einrichtung zum Abbilden der Netzhautentwicklung ^{5, 8.}

1. chimärer EmbryoAuswahl
   1. Am 24. - 26. HPF schirmen die transplantierten Embryonen unter einem Fluoreszenz-Binokular gesunde gut entwickelte Embryonen auszuwählen, die die transplantierten Spenderzellen (H2A-GFP oder H2B-RFP markiert) in der Entwicklung Auge primordium zeigen.
   2. Nehmen Sie sich bis zu 40 Embryonen durch Pipettieren in eine neue Schale Montage und fügen 0,4 mg / ml Tricaine methanesulfate (MS222) die Embryonen zu betäuben.
      ACHTUNG: Handschuhe tragen, wenn MS222 Handhabung.
2. Montage Embryonen
   HINWEIS: Verwenden Sie die geeigneten Einbauschale, je nachdem , ob die Darstellung auf einem invertierten ⁸ oder aufrechten Mikroskop (hier beschrieben) durchgeführt werden.
   1. Bereiten Sie ein paar 1,5 ml Kunststoffröhrchen mit 1 ml 1% niedriger Schmelz Agarose in 0,4 mg / ml MS222 in E3 Medium und halten Schmelze in einem 40 ° C Wasserbad.
   2. Saugen bis 5 Embryonen in eine Plastiktransferpipette und lassen Sie die Embryonen in der Spitze durch die Schwerkraft ansammeln. Berühren Sie die Transferpipetteauf die Oberfläche eines der vorbereiteten Rohre aus Kunststoff, enthaltend wodurch 1% niedrigschmelzende Agarose und 0,4 mg / mL MS222 die Embryonen in das Rohr zu sinken, während die Menge der E3 Übertragungs begrenzen.
   3. Berg Embryonen in einem Durchmesser von 90 mm Petrischale für die Bildgebung in aufrechten Mikroskop und Glasboden Petrischale (jeglicher Größe) für die Bildgebung in inverses Mikroskop. Verwenden Sie eine dauerhafte Markierung, um visuell teilen entweder Gericht in zwei Hälften zu Bild Geber in den WT-Hosts (auf einer Seite) oder morphant Gastgeber (andere Seite) im gleichen Experiment.
   4. Übertragen Sie die fünf Embryonen aus dem Agarose-Kunststoffrohr entweder Petrischale mit 0,5 bis 1 ml Agarose. Entfernen Sie überschüssige Agarose mit einer Transferpipette, so dass nur ein kleiner Tropfen (~ 200 bis 300 & mgr; l) bleibt. Wenn Bildgebung mit aufrechter Mikroskopie, vermeiden Embryonen innerhalb von 1 cm von der Petrischale Umfang platzieren. Das Eintauchen in Wasser Tauchlinse für die Bildgebung verwendet wird, kann nicht in der Lage sein , in diesem Bereich der Petrischale Wand (3A aufgrund zentriert werden </ Strong>).
   5. Verwenden Sie eine Microloading Pipette (mit der Spitze abgebrochen) die Embryonen auszurichten seitlich, bis die Agarose erstarrt. Für beide Arten von Gerichten werden die Embryonen richtig abgewinkelt seitlich , wenn die beiden Augen auf beiden Seiten des Kopfes vollständig überlappend sind (ausgerichtet in XY - Dimension) (3B). Für invertierte Mikroskopie Verwendung muß das Auge in der Nähe des Deckglases so nahe wie möglich an dem Deckglas gedrückt werden, Abbildungs ​​durch die z-Dimension innerhalb der Einschränkungen der möglichen Fokusebenen zu ermöglichen.
   6. Weiterhin Befestigungs fünf Embryonen zu einer Zeit in einzelne Agarose Tropfen. Verwenden Sie mehr 1% niedriger Schmelz Agarose zu verbinden die Agarose miteinander fällt und die Seite der Schale jede Verdrängen und seitliche Bewegung während der Bildgebung (3A) zu verhindern.
   7. Einmal vollständig verfestigten decken die Schale mit E3-Medium (enthaltend 0,003% PTU, 0,4 mg / mL MS222) vorgewärmt auf 28,5 ° C.
   8. Mit dem gleichen Ansatz in den Schritten 6.2.2- 6.2.8 montieren ~ 20 transgenen Embryonen bei 32 ° C (Schritt 1.2.5) in einer separaten Schale angehoben.
3. Imaging-Parameter
   HINWEIS: Imaging das Auftreten von fluoreszierenden Transgene zu analysieren keine hohe räumliche intrazelluläre Auflösung erfordern. Es kann mit einem W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC M27 70-mm-Ziel bei 1,5 Zoom durchgeführt werden.
   1. Eingerichtet , um die Laserleistung und Belichtungszeit basierend auf dem Transgen Intensität für die ~ 20 transgener Embryonen mit beschleunigten Entwicklung ( das heißt , auf 32 ° C erhöht, Schritt 6.2.8).
      HINWEIS: Bei Studien von Beginn der Transgen-Expression, die experimentellen Embryonen zeigen keine Fluoreszenz zum Zeitpunkt der Zeitraffer eingerichtet ist und somit diese beschleunigte Embryonen sind von entscheidender Bedeutung für die Parameter der Bildgebung zu bestimmen.
   2. Für die experimentelle Gericht, jeder Embryo zu visualisieren und die Position speichern und konzentrieren Ebenen der Embryonen.
      1. Wählen Sie Embryonen , die die richtige Montagewinkel (dh mit der seitlichen s habenide des Auges möglichst horizontal) und einem starken Herzschlag (ein Indikator für die Gesundheit). Wählen Sie Embryonen mit einigen transplantierten Spenderzellen (identifiziert durch H2A-GFP oder H2B-RFP - Markierung) in erster Linie in der vorderen ventralen Quadranten der Entwicklung von Netzhaut (wo die Welle der Genexpression beginnt) (3C).
         HINWEIS: In Genaktivität ist die durchschnittliche Herzfrequenz 120 bis 180 Schläge / Minute ^25. 120 Schläge / Minute - In den narkotisierten Embryonen, eine gesunde Herzschlag im Bereich von 60 sein kann. Langsamer Herzschlag kann ein Hinweis auf eine verminderte Lebensfähigkeit sein und diese Embryonen sind von der Untersuchung ausgeschlossen werden.
   3. Gesetzt z-Stapel von optischen Schnitten bei 2 & mgr; m Intervallen über die Netzhaut von bis zu 15 Embryonen.
      HINWEIS: Die Gesamtzahl der Embryonen, die in einem bestimmten Experiment abgebildet werden kann auf einzelnen Parametern abhängen (Belichtungszeit und z-Stapelgröße). Die benötigte Zeit, um Bild 1 Zeitpunkt für alle der ausgewählten Embryonen müssen sh seinOrter als das Intervall zwischen den Zeitpunkten. Durch Verzicht auf eine gewisse Tiefe Auflösung können mehr Embryonen innerhalb der Zeitintervalle abgebildet werden. Die Grenzen der z-Stapel als laterale und mediale Extremen des montierten Embryonen Auge ausgewählt und 30 & mgr; m ist auf der lateralen Seite in die aufrechte Mikroskopie Aufbau wie die Augen der sich entwickelnden Embryonen in dieser Konfiguration Verschiebung in der z-Richtung hinzugefügt, wie die Embryonen wachsen über Nacht. Dies führt zu Stapeln von 100 bis 170 & mgr; m Dicke (50 bis 85 Bilder / Auge).
   4. Nehmen Sie Bilder alle 24 min bei 32 ° C (entspricht 0,5 HPF-Intervalle) mit dem Laser / Kanal entsprechend dem Transgen.
      HINWEIS: Die Embryonen bleiben auf der Bühne während der gesamten Zeitraffer innerhalb einer beheizten Kammer das gesamte Mikroskop umfasst. Während das Experiment kann bei 28 ° C, wärmere Temperaturen durchgeführt werden, werden verwendet, die Entwicklung zu beschleunigen und sicherzustellen, dass die entsprechenden Zeitpunkten in dem Experiment in der 16 abgebildet werden - 24 h Zeitraffer-Zeitraum.
   5. BildKanäle die Donormarkierung (H2A-GFP oder H2B-RFP - optional) darstellt und Transgen (Atoh7: RFP oder Vsx1: GFP) unter Verwendung von sequentiellen Abtastung. Zur Analyse nutzen nur die Donor-Markierung geeignete Embryonen zu wählen, wie beschrieben (nehmen einen z-Stapel zu Beginn des Abbildungs) und dann Zeitraffer nur auf dem Kanal führen die Transgen-Expression zu erfassen.
      HINWEIS: Alternativ können Sie die Donormarkierung nur geeignete Embryonen auszuwählen (dh diejenigen mit bestätigten transplantierten Zellen in vorderen ventralen Quadranten) und Bild nur das Transgen Kanal, etwa Belichtungszeit zu halbieren und fast die Anzahl der Embryonen zu verdoppeln , die abgebildet und analysiert werden können pro Experiment (Abbildung 4).

Ergebnisse

Diese Arbeit stellt eine experimentelle Protokoll Veränderungen in der Genexpression Timing zu beurteilen, wenn Wildtyp-Retina-Vorläufern in einem morphant Wirtsembryo entwickeln. Die experimentellen Host Embryonen sind PTF1A morphants, die die Zwischen geboren horizontal und amacrine lnterneurone der Retina ^{7, 26} fehlen. Diese wurden verglichen Wirtsembryos zu steuern, die mit einer Standard-Steuer morpholino injiziert.

Diskussion

das Ausmaß, in dem Verständnis benachbarten Zellen Timing der Expression von entscheidender Zellschicksal bestimmenden Faktoren beeinflussen ist wichtig, wenn embryonale oder induziert multipotenter Stammzellen in eine bestimmte post-mitotischen Zelltyp oder sogar gemusterten Gewebe zu unterscheiden, um effizient anweisen Ziel. Darüber hinaus in den Entwicklungs Zellen des lebenden Tieres , diese molekularen Vorgänge der Prüfung stellt zusätzlich relevante dynamische (zeitliche und räumliche) Informationen über ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bioline	BIO-41025	Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C
Agarose low melt	Sigma	A9414-100G	Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
borosillicate glass capillary tube w/o filament	SDR Scientfic	30-0035	alternatives with similar diameter can be used
borosillicate glass capillary tube with filament	SDR Scientfic	30-0038	alternatives with similar diameter can be used
glass petri dishes (60 mm diameter)	Science Supply	1070506	any glass alternative of any size
Injection tube (2 m)	Eppendorf	524616004	This connects the needle holder to the syringe during transplantation
Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)	Adaptive Science Tools	PT-1	alternatives with similar shape can be use
microneedle holder	Narishige	M-152	any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
microinjector	Narishige or Eppendorf Femtojet		Pneumatic injector using gas pressure
micromanipulator	Coherent Scientific	M330IR	similar alternatives can be used
microloader tip	Eppendorf	5242956003
Mineral oil	Sigma	M5904-500ML
needle puller	Sutter Instruments	Model P-2000	Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
Parafilm	Interpath	PM996	any paraffin film
Pasteur pipette plastic	Samco Scientific	202
Pasteur pipette glass	Hirschmann Laborgeraete	9260101
Pronase	Sigma	P5942-25MG	Protease Type XIV
N-phenyl thiourea	Sigma	P7629-25G	PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use.
Qiaquick gel extraction	Qiagen	28704	any alternatives to purify DNA can be used
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104	any alternatives to purify RNA can be used
SP6 mMessage kit	Qiagen	AM1340	any alternatives to transcribe DNA using SP6