En vivo de imágenes de transgénicos de la Expresión Génica en el Estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares Influencias no autónomos

Resumen

el seguimiento en directo de la retina progenitores WT individuales en los antecedentes genéticos distintos permite la evaluación de la contribución de la señalización no autónomo celular durante la neurogénesis. Aquí, una combinación de gen desmontables, la generación de quimera a través de la transferencia de embriones y la imagen de lapso de tiempo confocal in vivo se utilizó para este propósito.

Resumen

Los puntos fuertes genéticos y técnicos han hecho los vertebrados pez cebra un organismo modelo clave en el que las consecuencias de las manipulaciones genéticas pueden ser rastreados en vivo durante todo el periodo de desarrollo rápido. Múltiples procesos pueden ser estudiados incluyendo la proliferación celular, la expresión génica, la migración celular y morfogénesis. Es importante destacar que la generación de quimeras a través de trasplantes puede realizarse fácilmente, lo que permite el etiquetado de mosaico y el seguimiento de las células individuales bajo la influencia del medio ambiente host. Por ejemplo, mediante la combinación de manipulaciones de genes funcionales del embrión de acogida (por ejemplo, mediante microinyección morfolino) y las imágenes en vivo, los efectos de la extrínseca, señales celulares no autónomas (proporcionados por el entorno modificado genéticamente) en las células del donante trasplantadas individuales pueden evaluarse. Aquí se demuestra cómo se utiliza este método para comparar la aparición de la expresión transgénica fluorescente como un proxy para la sincronización de deter destino de la célulaación en diferentes entornos host genética.

En este artículo, proporcionamos el protocolo para la microinyección de embriones de pez cebra para marcar las células del donante y para provocar la precipitación de genes en embriones de acogida, una descripción de la técnica de trasplante usado para generar embriones quiméricos, y el protocolo para la preparación y administración in vivo confocal de lapso de tiempo obtención de imágenes de múltiples embriones. En particular, la realización de imágenes de varias posiciones es crucial cuando la comparación de tiempo de los eventos tales como la aparición de la expresión génica. Esto requiere la recopilación de datos de control múltiple y embriones experimentales procesados ​​simultáneamente. Este enfoque se puede ampliar fácilmente para los estudios de las influencias extrínsecas en cualquier órgano o tejido de elección accesible a imágenes en directo, siempre que los trasplantes pueden ser dirigidos fácilmente de acuerdo con los mapas de destino embrionarias establecidas.

Introducción

La capacidad de visualizar los procesos de desarrollo importantes en un vertebrado in vivo ha contribuido a que el pez cebra un modelo clave para el estudio de las condiciones normales y de enfermedad (revisado en ^{1, 2).} En particular, la retina neural es una parte accesible del sistema nervioso central. La retina se presta a realizar fácilmente estudios de la neurogénesis debido a su muy organizado, sin embargo, la estructura relativamente simple, y sus tipos de neuronas altamente conservadas a través de especies de vertebrados ^3. Dinámica de comportamientos celulares tales como la proliferación, la salida del ciclo celular, la división celular asimétrica, la especificación del destino, la diferenciación y la formación de los circuitos neuronales se pueden seguir a lo largo de todo el proceso de retinogenesis, que se completa en la retina central del pez cebra por 3 d después de la fecundación ( dpf) ^{4, 5,}ref "> ^{6, 7.}

Por otra parte, los requisitos funcionales de genes diferentes en cada una de las etapas mencionadas anteriormente se pueden evaluar de forma concomitante en la retina del pez cebra, proporcionando una ventaja sobre otros modelos de vertebrados en el que los fenotipos resultantes de la aplicación de técnicas gen knockout sólo puede ser evaluado en el examen post-mortem de fijo tejidos. En particular, el uso de líneas transgénicas en las que podemos visualizar y controlar la expresión de proteínas fluorescentes como transgenes reportero en la retina, nos permite obtener la resolución temporal de la expresión génica que subyace en la génesis de un tipo celular neuronal particular. Debido al rápido desarrollo de pez cebra, estos eventos pueden ser visualizados durante todo el periodo de desarrollo, proporcionando así una visión más profunda en la importancia temporal de la expresión génica en relación con la adquisición de identidad de la célula neuronal y el comportamiento celular.

Por último, estos enfoques pueden ser combinados de manera eficiente en el pez cebra con la generación de la quimera a través de trasplantes, lo que resulta en puntos de vista en dos aspectos clave de la función de genes. En primer lugar, las células trasplantadas de un embrión donante, en el que un gen particular fue derribado antes de que se desarrollan en un entorno de tipo salvaje no marcada en el examen, nos permite obtener información relevante acerca de la función de genes en una celda de manera autónoma. Esto conduce a importantes conocimientos sobre la función de los factores de destino determinantes de la retina dentro de las células progenitoras que normalmente se expresan en. Esto se ejemplifica por el examen de los resultados destino de desarrollo de progenitores que ya no pueden generar proteína funcional a partir de estos genes ^{4, 6, 8, 9.} Utilizando este enfoque, hemos demostrado que los factores determinantes muchos de destino (por ejemplo, Vsx1, atoh7, Ptf1a, Barhl2) actúan célula-autonomously para conducir destinos neuronales retinianas específicas; la falta de expresión de genes conduce principalmente a un conmutador de destino, de modo que las células con el gen desmontables permanecen viables mediante la adopción de un destino alternativo celular ^{4, 6, 7, 10.} En segundo lugar, tales experimentos quiméricos se pueden utilizar para evaluar la forma de tipo salvaje progenitores comportan cuando se desarrollan dentro de diferentes entornos genéticos. Por ejemplo, comparando el desarrollo de las células WT que normalmente expresan un gen de interés (y transgén reportero) en un WT frente a entorno de acogida manipulada (por ejemplo, eliminación de genes / caída), los efectos resultantes sobre la expresión génica y destino de las células se pueden evaluar . La falta de ciertos tipos de neuronas en el entorno de acogida, por ejemplo, se ha demostrado que influyen en el comportamiento progenitor de tipo salvaje de una manera no autónoma de células, al sesgo de ellos hacia la diferenciación en el o subrepresentadosr falta tipos de neuronas ^{4, 7, 11, 12.} Dado que las neuronas de la retina nacen en un orden histogenic conservada por la expresión secuencial temporizada de genes específicos destino determinantes neuronales (la expresión génica destino) (revisado en ^13), hemos utilizado estos métodos para demostrar cómo el momento de la expresión génica destino en progenitores de tipo salvaje se ve afectada cuando estos progenitores se desarrollan en entornos host de la retina con composiciones celulares aberrantes inducidos. A continuación, describimos estos enfoques como evidencia de cómo la combinación de técnicas relativamente estándar y ampliamente utilizado permite que el examen de las fechas de la expresión génica destino en el desarrollo de la retina progenitores ^{8, 9.}

Este protocolo describe un método experimental que combina imágenes de lapso de tiempo con la facilidad de performando el trasplante en el ex vivo el desarrollo de embrión de pez cebra a seguir mosaically individuo células marcadas a lo largo de todo el período de retinogenesis desarrollo. Mediante la realización de las manipulaciones de genes funcionales ya sea en el embrión de acogida, embrión donante, ambos o ninguno, uno puede evaluar la autonomía de células de la función génica. Este enfoque se puede adaptar ampliamente a las preguntas de investigación similares en cualquier otro sistema para el cual los componentes individuales descritos aquí son adecuados.

Protocolo

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las disposiciones del Código de Australia Consejo de Investigación Médica Nacional de Salud y de la práctica para el cuidado y uso de animales y fueron aprobados por los comités de ética institucionales.

1. Preparación de Pez cebra

1. apareamiento de los peces adultos
   1. Creó los peces adultos en forma de pares (o dos pares) en los tanques de cría de tamaño adecuado la noche antes de su uso.
   2. Para mantener la hembra separada del macho, utilice un divisor para permitir a los peces para ver, pero no se tocan entre sí.
   3. Por la mañana, después de encender la luz, quitar los separadores y permitir que los peces se apareen sin ser molestados.
   4. Después de aparearse con éxito poner peces adultos de nuevo en sus tanques originales.
      NOTA: Host y donantes cepas pueden ser el mismo, por ejemplo, cualquier (WT) cepas de tipo salvaje. Para este estudio, los embriones de donantes derivan de las líneas transgénicas de Tg (atoh7: gapRFP), Tg (atoh7: gapGFP) oTg (vsx1: GFP) en el que la expresión de factores determinantes destino de conducción temprano o destino neural tarde se puede visualizar, respectivamente ^{14, 15, 16.} Con el fin de comparar los efectos de diferentes entornos genéticos, los embriones huésped pueden ser mutantes o morphants específicas como se describe a continuación.
2. recogida de embriones
   1. Use un colador de té para recoger los huevos de la caja de la cría. Compruebe si hay huevos cada 15 min para determinar el momento del nacimiento y asegurar embriones en estadio de una sola célula se recogen para las etapas posteriores.
   2. Enjuague embriones con medio E3 (NaCl 5 mM, KCl 0,2 mM, 0,4 mM CaCl _2, MgCl 0,9 mM ₂ y 2% de azul de metileno en agua destilada) y colocarlos en placas de Petri que contienen ~ 40 ml E3 ¹⁷ a una densidad máxima de 50 huevos por placa de Petri de diámetro 90 mm.
   3. Etiquetar las placas de Petri con el nombre de la cepa, fecha y hora denacimiento. Usar una pipeta de transferencia Pasteur para eliminar los residuos, mientras que la visualización de los embriones en el microscopio de disección.
   4. Mantener los embriones a 28,5 ° C hasta ~ 3 h después de la fecundación (HPF) para el trasplante, o continuar con microinyecciones.
      NOTA: Para los trasplantes, el objetivo de embriones de donantes y de acogida a edades similares. Por lo tanto, utilizar diferentes temperaturas de cría entre 25 - 32 ° C de acuerdo con Kimmel et al. ¹⁸ para ralentizar o acelerar un embrague de embriones para que coincida con la otra.
   5. Mantenga ~ 20 de los embriones de donantes transgénicos no inyectadas a 32 ° C desde el momento de la recolección hasta la imagen de lapso de tiempo (24 - 28 h más tarde).
      NOTA: Estos se desarrollarán más rápido que la cohorte experimental y se expresan marcadores fluorescentes anterior. De este modo, se pueden utilizar para configurar los parámetros (láser de potencia, ganancia) para la formación de imágenes. En este ejemplo particular, la imagen de la cohorte experimental comienza antes de la expresión del transgen (para evaluarel tiempo exacto de este evento).

2. Preparación para la microinyección

1. preparación aguja de microinyección
   1. Use un extractor de aguja para sacar las agujas de cada tubo capilar de vidrio de borosilicato (ID 1,0 mm de diámetro exterior / 0,78 mm / 100 mm de largo capilares de vidrio) en el centro para obtener dos agujas de igual longitud. Trate de que las agujas que se estrechan con ejes largos.
      NOTA: La configuración de ejemplo para el extractor de aguja usada aquí se suministran en el Lista de materiales.
   2. Almacenar las agujas tirados en una placa de Petri y asegurar presionándolos en una tira de masilla moldeable o cinta adhesiva.
   3. Antes de la inyección de llevar la punta de la aguja en el foco bajo un microscopio de disección y el uso de fórceps para romper la aguja en la punta. Apunta a una punta cónica afilada con una pequeña abertura (Figura 1C).
2. morfolino preparación para los embriones de acogida
   1. oligonucleótidos de morfolino Orden diseñados específicamente para el gen de interés, así como un control estándar morfolino o un desfase de 5 pares de bases apropiado para controlar los efectos de procedimiento y de manipulación.
      NOTA: Aquí, una traducción de bloqueo Ptf1a morfolino con la secuencia 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 'que inhibe el desarrollo de las células horizontales y amacrinas nacidos intermedios, y un morfolino control de pez cebra estándar de orientación mutación intrón beta-globina humana (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA -3 ') ^7, se utilizaron ^19.
   2. Preparar una solución 1 mM de stock morfolino (~ 8 - 8.5 ng / NL) y se almacena a temperatura ambiente.
   3. En el día de la inyección, calentar una parte alícuota (10 l) de morfolino en 65 ° C durante 10 min, girar brevemente y el lugar en el hielo para enfriar desde 65 ° C (después de lo cual se puede mantener a temperatura ambiente durante el uso). Thes la voluntad de revertir cualquier agregación potencialmente dentro de la solución morfolino, lo que puede disminuir la efectividad de la caída.
      1. Para Ptf1a morfolino y morfolino control estándar equivalente, preparar una solución de trabajo de 6 ng / nl diluyendo la solución madre con agua destilada morfolino. Mantener a temperatura ambiente.
         NOTA: Utilice 2 nL del morfolino por embrión como el Ptf1a morfolino requiere una concentración relativamente alta de trabajo de 12 ng por embrión como se determinó previamente ^7. Para la mayoría de los morfolinos, 2 - 5 ng por embrión es eficaz, por lo que diluir las acciones a 2 - 5 ng / nl e inyectar 1 nl en cada embrión.
3. Preparación reportero de fusión fluorescente histona construye para los embriones de donantes etiquetado
   NOTA: Con el fin de distinguir / visualizar las células donantes dentro de los embriones de acogida, hay diferentes enfoques para etiquetar el embrión donante, incluyendo la microinyección de H2A-GFP (si se utiliza con los donantes transgénicosreporteros fluorescentes rojas) o H2B-RFP (si se utiliza donantes transgénicas con reporteros fluorescentes verdes) mRNA en la yema del embrión de una sola célula donante etapa.
   1. Alineado de al menos 1 mg de plásmido que contienen el ADN reportero.
      NOTA: Aquí pCS2 + plásmido (generada y proporcionada amablemente por el Prof. David Turner de la Universidad de Michigan y el Prof. Ralph Rupp del Biomédica Centro de Munich) que contiene H2A-H2B-GFP o RFP (generada por el Dr. Christopher Wilkinson, Royal Holloway, Universidad de Londres) se linealizó con la digestión de enzima de restricción NotI.
   2. Se purifica ADN utilizando kits disponibles comercialmente según las instrucciones del fabricante.
   3. Transcribir mRNA usando kits disponibles en el mercado con polimerasa apropiada según las instrucciones del fabricante. Para el plásmido pCS2 +, utilice un kit de polimerasa SP6.
   4. Purificar ARNm utilizando kits comerciales o extracción con fenol-cloroformo, seguido de precipitación con isopropanol como por las instrucciones del fabricantes. Diluir el ARNm en agua ultrapura (20 - 30 l), medir la concentración con un espectrofotómetro y se almacena a -80 ° C.
   5. En el día de la inyección, preparar una solución de trabajo de mRNA en agua estéril con una concentración final de 100 ng / l y mantener en hielo. Volver ARNm no utilizada de stock de nuevo a -80 ° C.

3. La microinyección de Morpholinos y / o ARNm en las células de una sola etapa embriones

NOTA: La microinyección se utilizan para marcar todas las células del donante y para preparar los diferentes entornos host (control y desmontables gen) e implican la inyección de ARNm o de oligonucleótidos antisentido de morfolino ^{20, 21.}

1. Cargar y calibrar la aguja de inyección
   1. BackLoad la aguja de inyección con 3 l de la morfolino y / o solución de fusión de mRNA de histonas fluorescente utilizando puntas de pipeta microloader.
   2. Agitar el solutiones hacia la punta de la aguja de inyección hasta que no queden burbujas restantes. Use agujas de inyección con un cristal interno insertar tal que la solución se ha desarrollado básicamente a la punta por acción capilar.
   3. Coloque la aguja de inyección a un soporte montado en un micromanipulador (micromanipulador manual de 3D) y garantizar un sellado hermético dentro de la carcasa del tubo.
   4. Abra el suministro de electricidad y gas a la presión regulada microinyector.
   5. Sumergir la punta de la aguja en una gota de aceite mineral en un plato (si se utiliza una retícula ocular) o coloque la punta de la aguja directamente sobre un portaobjetos de micrómetro para calibrar el volumen de la gota. Medir el volumen de inyección presionando el pedal de pie y ajustar la presión de gas y / o el tiempo de duración hasta que el volumen de inyección es equivalente a 1 nL (125 micras de diámetro).
      NOTA: La ventaja de la corredera micrómetro es que las mediciones son independientes del aumento que se usa en el microscopio, sin embargo mediante el uso de las ins ocular de retículatead, la caída de la inyección y la escala pueden ser enfocan de manera simultánea.
2. microinyección de embriones
   1. Colocar un portaobjetos de microscopio en una placa de Petri y el uso de una pipeta de transferencia para depositar embriones en estadio de una sola célula a lo largo del borde de diapositivas. Alinear en una sola columna usando una punta de pipeta microloader con la mitad de la punta delgada cortada. Eliminar la mayor cantidad de líquido posible con una pipeta de transferencia fina para evitar movimientos durante las inyecciones (Figura 1A).
   2. Bajar la aguja hacia cada embrión, y penetrar en el corion y la yema de un solo golpe suave (Figura 1B).
   3. Una vez que la punta de la aguja se centra en la yema, microinyectar presionando el pedal. Inyectar 1 nl de H2A-H2B GFP o ARNm-RFP en la yema de un embrión donante etapa unicelular (transgénicos). Inyectar 2 nl de MO MO estándar o Ptf1a en la yema de un escenario de una sola célula de tipo salvaje embrión de acogida presionando el pedal dos veces. El éxito de las inyecciones pueden ser visualizados por el Smal l deformación espacial en la yema.
   4. Retire la aguja de inyección, mover el plato que contiene los embriones para llevar el embrión próxima a su posición y seguir inyectando hasta que toda la columna de embriones se inyectan (50 - 60 embriones).
   5. Después de inyectar todos los embriones, levantar el plato en la posición 30 - 45 ° de ángulo y utilizar un chorro suave de E3 medio (botella flexible) para transferir los embriones inyectados en una nueva placa de Petri limpia.
   6. Coloque el plato embrión en una incubadora (ya sea en 28,5 ° C u otra temperatura para asegurar que los embriones de donantes y de destino están en edades equivalentes).
   7. Repetir los pasos 3.2.1 - 3.2.6 según sea necesario para obtener ~ 100 embriones donantes o ~ 200 - 250 embriones de acogida.
   8. A 1 - 2 HPF, comprobar los embriones bajo un microscopio de disección y eliminar cualquier huevos no fecundados que no han avanzado hasta el 2 o 4 etapas de células con una pipeta de transferencia Pasteur.

4. Preparación para trasplantes

ONTENIDO "> NOTA: Los trasplantes se utilizan para generar embriones quiméricos que permiten a los efectos de diferentes entornos host genética a evaluarse dentro equivalentes WT donantes progenitores ^{9, 22, 23.}

1. la selección de embriones de donantes
   1. A las 3 de HPF, comprobar los embriones de donantes a las 2 - 5 aumentos para la señal de etiquetado bajo un microscopio de fluorescencia. Seleccione (masa celular simétrica con células de igual tamaño) bien desarrollado embriones con una señal fluorescente fuerte usando la GFP más filtro (460-500 nm de excitación, emisión de 510 nm de largo pasa) o un filtro rojo de Texas (540 - 580 nm de excitación, 610 nm la emisión del paso largo) (Figura 1D). Los reporteros transgénicos aún no se expresan.
2. placa de inyección de agarosa y preparación placa de Petri
   1. Verter fundida agarosa al 2% diluido en medio de E3 en una placa de Petri de diámetro 90 mm y dejar que se enfríe hasta que el plato es seguratocar. agarosa caliente, ya que puede deformar el molde.
   2. Flotador un molde de plástico con salientes en forma de cuña (6 x 25 / molde) en la agarosa (Figura 2D, E). Evitar las burbujas de aire mediante la colocación de un lado del molde sobre la agarosa y poco a poco más abajo del otro lado. Asegúrese de que el molde se centra en el plato o hacia el lado del punto de los salientes en forma de cuña más profunda para permitir suficiente espacio libre para la aguja del trasplante.
   3. Deje que la agarosa solidifique por completo a temperatura ambiente.
   4. Coloque el plato de agarosa al 4 ° C durante 30 min y retirar los moldes levantando suavemente de una esquina (por ejemplo, con fórceps). Preparar placas de agarosa de inyección el día antes del experimento y se almacena a 4 ° C con un pequeño volumen de medio E3 sello y parafina película para evitar que se sequen.
   5. Antes de la transplante, llenar la placa de inyección de agarosa con medio E3 y colocar en una incubadora a 28,5 ° durante al menos 30 min.
   6. Desde embriones dechorionated se adhieren al plástico, o bien los platos de cristal de uso o recubrir el interior de placas de Petri (90 mm de diámetro) con una capa delgada de 2% de agarosa en E3. Preparar una placa de embriones de acogida dechorionated, un plato de embriones de donantes dechorionated y un plato por cada 40 embriones trasplantados. Almacenar como se describe para la placa de inyección (4.2.4).
3. preparación de transferencia de pipeta
   1. Cortar la punta de una forma larga finamente sacó vidrio punta de pipeta Pasteur (2 ml de volumen, 230 mm de longitud, 100 mm de largo TIP) a una longitud que permite la maniobra cómoda (opcional) por el rascado con una cuchilla de diamante mientras se gira hasta que las caídas de punta off (Figura 1F).
   2. Asegúrese de que el corte es recto. Esmalte de fuego el cristal de pipeta de transferencia mediante la rotación de la superficie de corte en un quemador Bunsen para generar extremos suaves a fin de no dañar los embriones dechorionated (Figura 1f).
      NOTA: Mantener la punta de la pipeta en la llama durante demasiado tiempo wconsecuencia enfermo en la abertura de ser sellada o llegar a ser demasiado pequeño para los embriones.
4. Dechorionating blástula donantes y de acogida embriones en estadio
   1. Embriones Dechorionate ya sea manualmente con dos pinzas finas por desgarrando cada corion sin tocar el embrión, o enzimáticamente usando la proteasa para permitir dechorionation rápida simultánea de un gran número de embriones ^9.
      1. Preparar una solución madre de 50 mg 100x mezcla proteasa / ml, hacer 100 alícuotas y almacenar a -20 ° C.
      2. Añadir 100 ml de la población de proteasa a 10 ml de medio E3 (concentración final de 0,5 mg / ml de la proteasa).
      3. Coloca bien desarrollados anfitriones y donantes de embriones en dos vasos pequeños de cristal Erlenmeyer separados (10 ml) y extraer la mayor cantidad de líquido posible.
      4. Añadir 5 ml de la solución de proteasa 0,5 mg / ml a cada vaso y agitar a los embriones, mientras que los observan con un microscopio de disección. Esté atento a cualquier signo de deformación del corion.
      5. Mantenga remolino. Tan pronto como la primera embrión está fuera del corion (Figura 1D, asteriscos), lleve a cabo tres lavados rápidos con medio E3 para eliminar la solución de proteasa mediante el vertido de la mayor parte del líquido y volver a llenar el matraz mediante el vertido suavemente en E3 lo largo del lado. No permita que los embriones dechorionated entren en contacto con el aire en cualquiera de los pasos siguientes hasta el final del trasplante (sección 5), ya que va a estallar. Deje la solución adecuada en el frasco entre enjuagues.
      6. Con la pipeta de transferencia de vidrio pulida al fuego, la transferencia de los embriones desde el vaso de precipitados de Erlenmeyer en placas de Petri de vidrio o de agarosa (2% en medio E3) recubierto platos de plástico. pipeta suavemente durante la transferencia para eliminar cualquier corion debilitada restante.
5. la preparación de la aguja del trasplante
   1. Use un extractor de aguja para sacar dos agujas de cada tubo de vidrio de borosilicato de pared delgada (1,0 mm de diámetro exterior/ 0,78 mm de DI / 100 mm de longitud) con la misma configuración que las pipetas de microinyección.
      NOTA: La configuración de ejemplo para el extractor de aguja usada aquí se suministran en la Lista de materiales. agujas trasplantes no tienen un inserto de vidrio, ya que este daña las células aspiradas por la aguja.
   2. Tire las agujas de antemano, almacenar en una placa de Petri y seguro presionando en una tira de masilla moldeable o cinta adhesiva.
   3. Antes del trasplante llevar la punta de la aguja en el foco bajo un microscopio de disección y el uso de fórceps para romper la aguja en la punta. Utilice unas pinzas finas para ajustar la forma de la aguja para aspirar a una flauta-forma (Figura 2G), o utilizar métodos alternativos descritos para generar la forma de la punta ^23.

5. Generación de la quimera a través Blástula Trasplante

1. configuración del trasplante
   NOTA: En este caso, se utilizó un aparato de trasplante de auto-ensamblado (Figura 2A ).
   1. Montar la aguja trasplante en el mismo soporte de la aguja utilizada para la microinyección de arriba (montado en micromanipulador, paso 3.1.3) (Figura 2A).
   2. Desconectar el tubo de inyección que une el extremo del soporte micropipeta para el microinyector regulado de presión utilizado para microinyecciones. Una el tubo de inyección que está vinculado a una jeringa de 1 ml (Figura 2A, B), que representa la plataforma de trasplante.
      1. Asegúrese de que todas las conexiones están bien selladas utilizando una película de parafina o masilla moldeable. Evitar que los embriones de entrar en contacto con el aire, asegurando que siempre hay algún medio E3 en la propia aguja del trasplante. Operar manualmente la jeringa para aspirar células / líquido dentro y fuera de la aguja del trasplante.
2. la alineación de embriones
   1. La transferencia de los embriones de donantes con la pipeta de vidrio en la primera columna del molde de agarosa. La transferencia de los embriones huésped en las columnas 2a 6 del molde de agarosa (Figura 2F). Coloque los embriones con la pipeta de modo que el lado de blastómeros hacia arriba.
3. Trasplante
   1. Descansar suavemente la aguja en el trasplante de una célula de un embrión de blastómeros de los donantes y, lentamente quite hasta unos 20 - 50 células dentro de la aguja del trasplante (Figura 2H). Se debe evitar succionar hasta la yema.
   2. Levantar la aguja del trasplante del embrión donante utilizando el micromanipulador. Mueva el plato de molde de agarosa a la izquierda e inserte la punta de la aguja del trasplante a través del lado de la masa celular en el polo animal de la primera embrión de acogida. Depósito de 5 - 10 células cerca de la superficie de acuerdo con suerte de cartografía que muestra que esta zona da lugar a el campo cerebro anterior / ojo ²⁴ (Figura 2I). Mantenga la punta de la aguja sumergida en el medio E3 durante todo el procedimiento.
4. Cuidado de los embriones trasplantados
   1. Retire el donante de embriones de unand dejar los embriones de acogida en el molde de agarosa de 1 - 2 horas a 28,5 ° C. Llenar de vidrio o plástico (recubierto con 2% de agarosa) placas de Petri con medio de E3 que contiene 0,003% de N-feniltiourea (PTU) para evitar la formación de pigmento ya que esto interfiera con las imágenes. La transferencia de los embriones de acogida en estos platos con el fuego pulido pipeta de vidrio y se incuba a 28,5 ° CO / N.
      PRECAUCIÓN: Use guantes para manipular la PTU.

6. Configuración de imágenes en vivo

NOTA: El pequeño tamaño y la transparencia óptica de pez cebra combinado con un rápido desarrollo han permitido convertirse en un modelo de vertebrados clave para formación de imágenes in vivo de las diferentes células y órganos. Imaging se puede realizar en una variedad de microscopios, que difieren en configuración y parámetros. A continuación se describe una configuración de formación de imágenes confocal adecuado para formación de imágenes del desarrollo de la retina ^{5, 8.}

1. embrión quiméricoselección
   1. A las 24 - 26 HPF, la pantalla de embriones trasplantados bajo un microscopio de disección fluorescente para seleccionar embriones sanos bien desarrolladas que muestran que las células trasplantadas del donante (H2A-H2B GFP o RFP-etiquetados) en el primordio ojo en desarrollo.
   2. Ponga a un lado hasta 40 embriones para el montaje con la pipeta en un nuevo plato y añadir 0,4 mg / ml tricaína metanosulfato (MS222) para anestesiar a los embriones.
      PRECAUCIÓN: Use guantes para manipular MS222.
2. embriones de montaje
   NOTA: Utilice el plato de montaje adecuado, dependiendo de si las imágenes se realizó en un microscopio invertido ⁸ o vertical (descrito aquí).
   1. Preparar unos tubos de plástico 1.5 ml que contenían 1 ml de 1% de agarosa de bajo fusión en 0,4 mg / ml en medio MS222 E3 y mantener fundido en un baño de agua a 40 °.
   2. Aspirar 5 embriones en una pipeta de transferencia de plástico y dejar que los embriones se acumulan en la punta por la gravedad. Toca la pipeta de transferenciasobre la superficie de uno de los tubos de plástico preparados que contienen 1% de agarosa de baja fusión y 0,4 mg / mL MS222 permitiendo que los embriones a hundirse en el tubo, mientras que la limitación de la cantidad de transferencia de E3.
   3. embriones de montaje en un diámetro del plato de Petri de 90 mm para obtener imágenes de microscopio vertical con fondo de cristal y placa de Petri (de cualquier tamaño) para la formación de imágenes en microscopio invertido. Use un marcador permanente para dividir visualmente, ya sea el plato en dos mitades a los donantes de imagen en los anfitriones WT (en un lado) o hosts morphant (el otro lado) en el mismo experimento.
   4. La transferencia de los cinco embriones del tubo de plástico de agarosa para cualquiera placa de Petri con 0,5 - 1 ml de agarosa. Eliminar el exceso de agarosa con una pipeta de transferencia de modo que sólo una pequeña gota (~ 200-300 l) se mantiene. Si la imagen con el microscopio en posición vertical, evite colocar los embriones dentro de 1 cm de la circunferencia placa de Petri. La lente de inmersión de inmersión en agua utilizado para la formación de imágenes puede no ser capaz de estar centrada en esa zona debido a la pared plato Petri (Figura 3A </ Strong>).
   5. Utilizar una pipeta microloading (con la punta rota) para alinear los embriones lateralmente hasta solidificación de la agarosa. Para ambos tipos de platos, los embriones están en ángulo lateralmente correctamente si los dos ojos a cada lado de la cabeza son completamente superpuesta (alineado en la dimensión XY) (Figura 3B). Para el uso de microscopía invertida, el ojo cerca del cubreobjetos debe ser empujado lo más cerca del cubreobjetos como sea posible, para permitir la formación de imágenes a través de la dimensión z dentro de las limitaciones de los posibles niveles de enfoque.
   6. Continuar montaje cinco embriones en un momento en gotas de agarosa individuales. Use más 1% de agarosa de baja fusión para unirse a la agarosa cae el uno al otro y el lado de la placa para evitar cualquier desprendimiento y el movimiento lateral durante la formación de imágenes (Figura 3A).
   7. Una vez solidificado completamente, cubra el plato con medio E3 (que contiene 0,003% de PTU, 0,4 mg / ml MS222) precalentado a 28,5 ° C.
   8. Utilizando el mismo enfoque descrito en los pasos 6.2.2- 6.2.8, montaje ~ 20 embriones transgénicos planteadas a 32 ° C (paso 1.2.5) en un plato aparte.
3. parámetros de imagen
   NOTA: Imaging para analizar la aparición de transgenes fluorescentes no requiere alta resolución intracelular espacial. Se puede realizar con un W Plan-Apochromat 20x / 1,0 DIC M27 70-mm objetivo en 1,5 zoom.
   1. Configurar el tiempo de exposición y la potencia del láser basado en la intensidad de los transgenes ~ 20 embriones transgénicos con un desarrollo acelerado (es decir, planteadas a los 32 ° C; el paso 6.2.8).
      NOTA: Para los estudios de la aparición de la expresión transgénica, los embriones experimentales no muestran fluorescencia en el momento en el lapso de tiempo está configurado y por lo tanto, estos embriones acelerados son cruciales para determinar los parámetros de la imagen.
   2. Para el plato experimental, visualizar cada embrión y guardar la posición y el enfoque de los niveles de embriones.
      1. Elija los embriones que tienen el ángulo de montaje correcta (es decir, con la s lateralide del ojo lo más horizontal posible) y un latido del corazón fuerte (un indicador de la salud). Elija embriones con unas pocas células del donante trasplantado (identificados por H2A-GFP o el etiquetado H2B-RFP) principalmente en el cuadrante ventral anterior de la retina en desarrollo (donde se inicia la onda de la expresión génica) (Figura 3C).
         NOTA: En embriones de pez cebra, la frecuencia cardiaca media es de 120 - 180 latidos / minuto ^25. En los embriones anestesiados, un latido del corazón sano puede estar en el rango de 60 - 120 latidos / minuto. latido cardiaco lento puede ser indicativo de reducción de la viabilidad y los embriones debe ser excluido del estudio.
   3. Conjunto z-pilas de secciones ópticas a intervalos de 2 micras a través de la retina de un máximo de 15 embriones.
      NOTA: El número total de embriones que se pueden obtener imágenes en cualquier experimento dado dependerá de los parámetros individuales (tiempo de exposición y el tamaño de pila Z). El tiempo necesario para la imagen 1 punto de tiempo para todos los embriones seleccionados debe ser shorter que el intervalo entre los puntos de tiempo. Al sacrificar alguna resolución de profundidad, más embriones se pueden obtener imágenes dentro de los intervalos de tiempo. Los límites de la pila Z se eligen como extremos lateral y medial del ojo embriones montado y se añaden 30 micras en el lado lateral en la configuración de la microscopía en posición vertical, como los ojos de los embriones en desarrollo en este cambio de configuración en la dirección z como los embriones crecen durante la noche. Esto se traduce en pilas de 100 - 170 micras de espesor (50 - 85 imágenes / ojo).
   4. Tomar imágenes cada 24 min a 32 ° C (equivalente a 0,5 hpf intervalos) utilizando el láser / canal apropiado para el transgén.
      NOTA: Los embriones se mantienen en el escenario a lo largo de todo el lapso de tiempo dentro de una cámara climatizada que abarca todo el microscopio. Mientras que el experimento puede llevarse a cabo a 28 ° C, las temperaturas más cálidas se utilizan para acelerar el desarrollo y asegurarse de que los puntos de tiempo relevantes en el experimento se crean imágenes en el 16 - período de lapso de tiempo de 24 h.
   5. Imagencanales que representa la etiqueta de donantes (H2A-H2B-GFP o RFP - opcional) y el transgén (atoh7: RFP o Vsx1: GFP) mediante exploración secuencial. Para el análisis, utilizar la etiqueta de donantes sólo para elegir embriones apropiadas como se describe (tomar uno z-pila en el comienzo de la formación de imágenes) y luego realizar de lapso de tiempo sólo en el canal para capturar la expresión de los transgenes.
      NOTA: Como alternativa, utilice la etiqueta de donantes solamente para seleccionar embriones apropiados (es decir, aquellos con células confirmados trasplantados en anterior cuadrante ventral) y la imagen sólo el canal transgén, más o menos reducir a la mitad el tiempo de formación de imágenes y casi duplicando el número de embriones que se pueden obtener imágenes y analizadas por experimento (Figura 4).

Resultados

Este trabajo presenta un protocolo experimental para evaluar los cambios en el gen de expresión cuando la sincronización de tipo salvaje retina progenitores desarrollan dentro de un embrión de acogida morphant. Los embriones de acogida experimentales son morphants Ptf1a, que carecen de las interneuronas horizontales y amacrinas nacidos intermedios de la retina ^{7, 26.} Éstos se han comparado con el control de los embriones de a...

Discusión

La comprensión de la medida en que las células vecinas influencia de sincronización de la expresión de factores que determinan el destino celular crucial es esencial cuando el objetivo de instruir eficazmente células madre multipotentes embrionarias o inducidas a diferenciarse en un tipo de célula post-mitótico específico o incluso tejido patrón. Además, el examen de estos eventos moleculares en las células en desarrollo del animal vivo, además, proporciona dinámica relevante información (temporal y espaci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bioline	BIO-41025	Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C
Agarose low melt	Sigma	A9414-100G	Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
borosillicate glass capillary tube w/o filament	SDR Scientfic	30-0035	alternatives with similar diameter can be used
borosillicate glass capillary tube with filament	SDR Scientfic	30-0038	alternatives with similar diameter can be used
glass petri dishes (60 mm diameter)	Science Supply	1070506	any glass alternative of any size
Injection tube (2 m)	Eppendorf	524616004	This connects the needle holder to the syringe during transplantation
Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)	Adaptive Science Tools	PT-1	alternatives with similar shape can be use
microneedle holder	Narishige	M-152	any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
microinjector	Narishige or Eppendorf Femtojet		Pneumatic injector using gas pressure
micromanipulator	Coherent Scientific	M330IR	similar alternatives can be used
microloader tip	Eppendorf	5242956003
Mineral oil	Sigma	M5904-500ML
needle puller	Sutter Instruments	Model P-2000	Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
Parafilm	Interpath	PM996	any paraffin film
Pasteur pipette plastic	Samco Scientific	202
Pasteur pipette glass	Hirschmann Laborgeraete	9260101
Pronase	Sigma	P5942-25MG	Protease Type XIV
N-phenyl thiourea	Sigma	P7629-25G	PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use.
Qiaquick gel extraction	Qiagen	28704	any alternatives to purify DNA can be used
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104	any alternatives to purify RNA can be used
SP6 mMessage kit	Qiagen	AM1340	any alternatives to transcribe DNA using SP6