Imagerie in vivo de Transgenic Gene Expression en Retinal individuelle progéniteurs dans chimériques Zebrafish Embryons à étudier cellulaires Influences non autonomes

Résumé

Suivi en direct des progéniteurs rétiniens WT individuels dans des contextes génétiques distincts permet l'évaluation de la contribution de la signalisation non-autonome cellule pendant la neurogenèse. Ici, une combinaison de knock - down de gènes, la génération par la transplantation d' embryons chimères et in vivo d' imagerie confocale time-lapse a été utilisé à cette fin.

Résumé

Les forces génétiques et techniques ont fait le vertébré zebrafish un modèle d'organisme clé dans lequel les conséquences des manipulations génétiques peuvent être retracées in vivo tout au long de la période de développement rapide. Plusieurs procédés peuvent être étudiés, y compris la prolifération cellulaire, l'expression des gènes, la migration cellulaire et la morphogenèse. Fait important, la production de chimères à travers la transplantation peut être effectuée facilement, ce qui permet l'étiquetage de la mosaïque et le suivi des cellules individuelles sous l'influence de l'environnement de l'hôte. Par exemple, en combinant manipulations fonctionnelles de gènes de l'embryon hôte (par exemple, par le biais de morpholino microinjection) et l' imagerie en direct, les effets de extrinsèque, des signaux non autonomes cellulaires (fournis par l'environnement génétiquement modifié) sur les cellules du donneur transplantées individuels peuvent être évalués. Ici, nous montrons comment cette approche est utilisée pour comparer l'apparition de l'expression du transgène fluorescent comme un proxy pour le moment du destin cellulaire détermination dans différents environnements d'accueil génétique.

Dans cet article, nous fournissons le protocole de micro - injection d' embryons de poisson zèbre pour marquer les cellules du donneur et pour provoquer knockdown de gènes dans des embryons hôtes, une description de la technique de transplantation utilisé pour générer des embryons chimériques, et le protocole pour la préparation et l' exécution in vivo time-lapse confocal imagerie de plusieurs embryons. En particulier, la réalisation d'imagerie multiposition est crucial lorsque l'on compare le calendrier des événements tels que l'apparition de l'expression génique. Cela nécessite la collecte de données de contrôle multiples et les embryons expérimentaux traités simultanément. Une telle approche peut être facilement étendu pour les études des influences extrinsèques dans un organe ou d'un tissu de choix accessible pour vivre l'imagerie, à condition que les transplantations peuvent être ciblés facilement selon les cartes du destin embryonnaires établies.

Introduction

La capacité à visualiser les processus de développement importants dans un vertébré in vivo a contribué à faire du zebrafish un modèle clé pour l' étude des conditions normales et pathologiques (revue en ^{1, 2).} En particulier, la rétine neurale est une partie accessible du système nerveux central. La rétine se prête à exécuter aisément des études de la neurogenèse en raison de sa très organisée, mais la structure relativement simple, et les types de neurones hautement conservées entre les espèces de vertébrés ^3. Dynamique des comportements cellulaires tels que la prolifération, la sortie du cycle cellulaire, la division cellulaire asymétrique, la spécification du destin, la différenciation et la formation des circuits neuronaux peuvent être suivis tout au long de l'ensemble du processus de rétinogenèse, qui est complétée dans la rétine centrale du poisson zèbre par 3 d post-fécondation ( dpf) ^{4, 5,}ref "> ^{6, 7.}

En outre, les exigences fonctionnelles des différents gènes dans chacune des étapes mentionnées ci-dessus peuvent être concomitantly évalués dans la rétine de poisson zèbre, fournissant un avantage sur les autres modèles vertébrés dans lequel phénotypes résultant de l'application des techniques de knock-out du gène ne peut être évaluée lors de l'examen post-mortem des tissus fixe. En particulier, l'utilisation de lignées transgéniques dans lesquelles nous pouvons visualiser et de contrôler l'expression de protéines fluorescentes comme transgènes rapporteurs dans la rétine, nous permet d'obtenir une résolution temporelle de l'expression des gènes qui sous-tend la genèse d'un type neuronal particulier de cellules. En raison du développement rapide de poisson-zèbre, ces événements peuvent être visualisés au cours de toute la période du développement, fournissant ainsi une connaissance plus approfondie de l'importance temporelle de l'expression des gènes en relation avec l'acquisition de l'identité de la cellule neuronale et le comportement des cellules.

Enfin, ces approches peuvent être combinées de manière efficace dans le poisson zèbre avec la génération d'une chimère via la transplantation, ce qui entraîne un aperçu de deux aspects clés de la fonction des gènes. Tout d'abord, en examinant les cellules transplantées à partir d'un embryon de donneur, dans laquelle un gène particulier a été renversé alors qu'ils se développent dans un environnement non marqué de type sauvage, nous permet d'obtenir des informations pertinentes sur la fonction des gènes d'une manière cellulaire autonome. Cela conduit à des informations importantes sur la fonction de la rétine facteurs sort déterminants au sein des cellules progénitrices ils sont normalement exprimés. Ceci est illustré par l'examen du sort des résultats de développement des progéniteurs qui ne peuvent plus générer une protéine fonctionnelle de ces gènes ^{4, 6, 8, 9.} En utilisant cette approche, nous avons montré que les facteurs déterminants du devenir beaucoup (par exemple, Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) agissent cellule-autonomously à conduire destins neuronales rétiniennes spécifiques; l'absence d'expression du gène conduit principalement à un commutateur sort, de telle sorte que les cellules avec le gène knockdown restent viables en adoptant un sort de remplacement cellulaire ^{4, 6, 7, 10.} Deuxièmement, ces expériences chimériques peuvent être utilisés pour évaluer la façon dont sauvage progéniteurs de type se comportent quand ils se développent dans différents environnements génétiques. Par exemple, en comparant le développement des cellules WT qui expriment habituellement un gène d'intérêt (et journaliste transgène) dans un WT contre environnement hôte manipulé (par exemple, KO génique / knockdown), les effets induits sur l' expression génique et le destin des cellules peuvent être évaluées . L'absence de certains types de neurones dans l'environnement hôte, par exemple, a été montré, pour influencer le comportement progénitrices de type sauvage d'une manière non-autonome cellulaire, pour solliciter eux vers la différenciation dans l'o sous-représentéesr manquant types de neurones ^{4, 7, 11, 12.} Étant donné que les neurones de la rétine sont nés dans un ordre histogène conservé par l'expression séquentiellement chronométré de gènes spécifiques sort déterminants neuronales (expression du gène sort) (revue dans ^13), nous avons utilisé ces méthodes pour démontrer comment le moment de l' expression du gène sort dans les progéniteurs de type sauvage est affectée lorsque ces progéniteurs se développent dans des environnements d'accueil rétiniens avec des compositions cellulaires aberrantes induites. Ici, nous présentons ces approches comme preuve de la façon dont la combinaison des techniques relativement standard et largement utilisé permet l'examen du moment de l' expression du gène sort dans le développement de progéniteurs rétiniens ^{8, 9.}

Ce protocole décrit une approche expérimentale combinant imagerie time-lapse avec la facilité de parformant la transplantation dans l'ex vivo développement embryon de poisson zèbre à suivre mosaically individuelle des cellules marquées pendant toute la période de rétinogenèse développement. En effectuant des manipulations génétiques fonctionnels, soit dans l'embryon hôte, donneur de l'embryon, les deux ou aucun, on peut évaluer l'autonomie de la cellule de la fonction des gènes. Cette approche peut être adaptée largement aux questions de recherche similaires dans tout autre système pour lequel les composants individuels décrits ici sont appropriés.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux dispositions du code Australian Medical Research Council Santé nationale et de la pratique pour les soins et l'utilisation des animaux et ont été approuvés par les comités d'éthique institutionnels.

1. Préparation de Zebrafish

1. Adulte appariement des poissons
   1. Mettre en place les poissons adultes sous forme de paires (ou deux paires) en bassins d'élevage de taille appropriée le soir avant de l'utiliser.
   2. Pour garder la femelle séparée du mâle, utiliser un diviseur pour permettre au poisson de voir, mais pas toucher.
   3. Dans la matinée, après avoir allumé la lumière, retirez les diviseurs et permettre aux poissons de s'accoupler tranquillement.
   4. Après l'accouplement mis les poissons adultes dans leurs réservoirs d'origine.
      NOTE: les souches de l' hôte et les donateurs peuvent être identiques, par exemple, tout type sauvage (WT) souches. Pour cette étude , les embryons donneurs obtenus à partir des lignées transgéniques Tg (atoh7: gapRFP) Tg (atoh7: gapGFP) ouTg (vsx1: GFP) dans laquelle l'expression de facteurs déterminants sort conduire tôt ou tard le destin neuronal peut être visualisé, respectivement ^{14, 15, 16.} Afin de comparer les effets des différents environnements génétiques, les embryons hôtes peuvent être des mutants ou morphants spécifiques comme décrit ci-dessous.
2. collection Embryo
   1. Utilisez une passoire à thé pour recueillir les oeufs dans la zone de reproduction. Vérifiez les oeufs toutes les 15 minutes pour déterminer le moment de la naissance et de veiller à embryons au stade unicellulaires sont recueillies pour les étapes ultérieures.
   2. Rincez les embryons avec du milieu E3 (NaCl 5 mM , KCl 0,2, 0,4 mM de _CaCl2, mM MgCl 0,9 ₂ et 2% de bleu de méthylène dans de l' eau distillée) et les placer dans des boîtes de Pétri contenant ~ 40 mL E3 ¹⁷ à une densité maximale de 50 œufs par 90 mm de diamètre boîte de Pétri.
   3. Etiqueter les boîtes de Pétri avec le nom de la souche, la date et l'heure denaissance. Utilisez un transfert pipette Pasteur pour enlever les débris tout en regardant les embryons sous le microscope de dissection.
   4. Garder les embryons à 28,5 ° C jusqu'à ce que ~ 3 h post-fécondation (HPF) pour la transplantation, ou continuer avec microinjections.
      NOTE: Pour les transplantations, viser donateurs et d'accueil des embryons à des âges similaires. Par conséquent, d' utiliser des températures différentes d'élevage entre 25 - 32 ° C selon Kimmel et al. ¹⁸ pour ralentir ou accélérer un embrayage d'embryons pour correspondre à l'autre.
   5. Gardez ~ 20 des embryons donateurs transgéniques non injecté à 32 ° C à partir du moment de la collecte jusqu'à l'imagerie time-lapse (24 - 28 h plus tard).
      NOTE: Ces développeront plus vite que la cohorte expérimentale et expriment des marqueurs fluorescents plus tôt. Ils peuvent ainsi être utilisés pour régler les paramètres (puissance laser, gain) pour l'imagerie. Dans cet exemple particulier, l'imagerie de la cohorte expérimentale commence avant l'expression du transgène (pour évaluerle moment exact de cet événement).

2. Préparation de microinjection

1. préparation de l'aiguille de microinjection
   1. Utilisez un extracteur d'aiguille pour tirer les aiguilles de chaque tube capillaire en verre borosilicate (1,0 mm OD / 0,78 mm ID / 100 mm de long capillaires en verre) dans le centre pour obtenir deux aiguilles de longueur égale. Visez des aiguilles qui se rétrécissent avec de longs arbres.
      REMARQUE: Exemple de réglages pour l'extracteur d'aiguille utilisé ici sont fournis dans le Liste des matériaux.
   2. Stocker les aiguilles tirées dans une boîte de Pétri et sécuriser en les pressant dans une bande de mastic moulable ou de ruban adhésif.
   3. Avant l'injection amener la pointe de l'aiguille dans la mise au point sous un microscope à dissection et utiliser des pinces pour briser l'aiguille à la pointe. Visez une pointe effilée pointue avec une petite ouverture (figure 1C).
2. Préparation morpholino pour les embryons hôtes
   1. oligonucléotides ordonner morpholino spécialement conçus pour le gène d'intérêt ainsi qu'un morpholino de contrôle standard ou un 5 paires de bases non-concordance appropriée pour contrôler les effets de procédure et de manutention.
      Remarque: ici, une traduction de blocage Ptf1a morpholino ayant la séquence 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 'qui inhibe le développement des cellules horizontales et amacrines nées intermédiaires et un groupe morpholino contrôle de poisson-zèbre étalon de ciblage intron mutation bêta-globine humaine (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA -3) ^{7, 19} ont été utilisés.
   2. Préparer un morpholino solution stock 1 mM (~ 8 à 8,5 ng / nL) et stocker à température ambiante.
   3. Le jour de l'injection, chauffer une partie aliquote (10 pi) de morpholino à 65 ° C pendant 10 minutes, centrifuger brièvement et placer sur de la glace pour refroidir de 65 ° C (après quoi il peut être conservé à température ambiante pendant l'utilisation). thest renversera toute potentiellement agrégation au sein de la solution morpholino, ce qui peut diminuer l'efficacité de l'effet de choc.
      1. Pour Ptf1a morpholino et morpholino équivalent de commande standard, préparer une solution de travail de 6 ng / nL par dilution de la solution de morpholino avec de l'eau distillée. Conserver à la température ambiante.
         REMARQUE: Utiliser 2 nL de l'morpholino par embryon comme Ptf1a morpholino nécessite une concentration de travail relativement élevée de 12 ng par embryon tel que déterminé précédemment ^7. Pour la plupart des morpholinos, 2-5 ng par embryon est efficace, alors diluer le stock à 2 - 5 ng / nL et injecter 1 nL dans chaque embryon.
3. Préparation fluorescente histone fusion journaliste construit pour les embryons étiquetage des donateurs
   NOTE: Afin de distinguer / visualiser les cellules du donneur dans les embryons hôtes, il existe différentes approches pour étiqueter l'embryon donneur, y compris la micro-injection de H2A-GFP (si vous utilisez les donateurs transgéniques avecreporters fluorescents rouges) ou H2B-RFP (si vous utilisez les donateurs transgéniques avec des journalistes fluorescents verts) ARNm dans le jaune de l'unique cellule donneur de stade embryonnaire.
   1. Linéariser au moins 1 pg de plasmide contenant l'ADN rapporteur.
      NOTE: Ici pCS2 + plasmide (généré et aimablement fourni par le professeur David Turner de l'Université du Michigan et le professeur Ralph Rupp du centre biomédical de Munich) contenant H2A-GFP ou H2B-RFP (généré par le Dr Christopher Wilkinson, Royal Holloway, Université de Londres) a été linéarisé par digestion avec des enzymes de restriction Notl.
   2. Purifier l'ADN en utilisant des kits disponibles dans le commerce selon les instructions du fabricant.
   3. Transcrire ARNm en utilisant des kits disponibles dans le commerce avec la polymérase appropriée selon les instructions du fabricant. Pour le plasmide pCS2 +, utilisez un kit SP6 polymerase.
   4. Purifier l'ARNm en utilisant des kits commerciaux ou l'extraction phénol-chloroforme suivie par précipitation à l'isopropanol comme par les instructions du fabricants. Diluer l'ARNm dans l'eau ultrapure (20 - 30 pi), mesurer la concentration avec un spectrophotomètre et conserver à -80 ° C.
   5. Le jour de l'injection, préparer une solution de travail de l'ARNm dans l'eau stérile à une concentration finale de 100 ng / pl et de garder sur de la glace. Retour utilisé ARNm stocks retour à -80 ° C.

3. microinjection de Morpholinos et / ou l'ARNm en une seule cellule étape Embryons

NOTE: microinjections sont utilisés pour marquer toutes les cellules du donneur et de préparer les différents environnements d'accueil (contrôle et knockdown de gènes) et impliquent des injections d'ARNm ou morpholino oligonucléotides antisens ^{20, 21.}

1. Chargement et étalonnage de l'aiguille d'injection
   1. Backloading l'aiguille d'injection avec 3 pi de la morpholino et / ou solution fusion ARNm histone-fluorescente utilisant des conseils microloader de pipette.
   2. Agiter le solutions vers la pointe de l'aiguille d'injection jusqu'à ce qu'il n'y a pas de bulles restantes. Utiliser des aiguilles d'injection avec un verre interne insérer telle que la solution sera principalement attirée sur la pointe par action capillaire.
   3. Fixer l'aiguille d'injection à un support monté dans un micromanipulateur (micromanipulateur manuel 3D) et d'assurer un joint étanche à l'intérieur du boîtier tubulaire.
   4. Allumez la puissance et la fourniture de gaz à la micro-injecteur de pression régulée.
   5. Immerger la pointe de l'aiguille dans une goutte d'huile minérale dans un plat (si vous utilisez un oculaire réticule) ou passez la pointe de l'aiguille directement sur une lame micrométrique pour calibrer le volume de la goutte. Mesurer le volume d'injection en appuyant sur la pédale et régler la pression du gaz et / ou du temps de la durée jusqu'à ce que le volume d'injection est équivalente à 1 nL (125 um de diamètre).
      REMARQUE: L'avantage du micromètre est que les mesures sont indépendantes du grossissement utilisé au microscope, mais en utilisant les compléments de réticule oculaireTEAD, la chute de l'injection et de l'échelle peuvent être mis au point en même temps.
2. Embryo microinjection
   1. Placez une lame de microscope dans une boîte de Pétri et d'utiliser une pipette de transfert pour déposer des embryons au stade unicellulaires le long du bord de la diapositive. Aligner dans une colonne unique à l'aide d'une pointe de pipette microloader avec la moitié de la pointe fine coupée. Retirez autant de liquide que possible avec une pipette de transfert fine pour empêcher les mouvements lors des injections (figure 1A).
   2. Abaisser l'aiguille vers chaque embryon, et pénétrer dans le chorion et le jaune d'un seul coup lisse (figure 1B).
   3. Une fois que la pointe de l'aiguille est centrée dans le jaune, micro-injection en appuyant sur la pédale. Injecter 1 nL de H2A-GFP ou H2B-RFP ARNm dans le jaune d'un embryon de donneur de stade unicellulaire (transgénique). Injecter 2 nL de MO standard ou Ptf1a MO dans le jaune d'un stade une cellule de type sauvage embryon hôte en appuyant deux fois sur la pédale. injections réussies peuvent être visualisées par le smal l déformation spatiale dans le jaune.
   4. Retirer l'aiguille d'injection, déplacer le plat contenant les embryons pour amener le prochain embryon en position et continuer à injecter jusqu'à ce que l'ensemble de la colonne d'embryons sont injectés (50 - 60 embryons).
   5. Après l'injection tous les embryons, soulever le plat jusqu'à à un 30 - angle de 45 ° et d'utiliser un léger courant d'E3 moyen (bouteille compressible) pour transférer les embryons injectés dans une nouvelle boîte de Pétri propre.
   6. Placer le récipient de l'embryon dans un incubateur (soit 28.5 ° C ou autre température pour assurer que les embryons de donneur et l'hôte sont à un âge équivalent).
   7. Répétez les étapes 3.2.1 - 3.2.6 que nécessaire pour obtenir ~ 100 embryons donateurs ou ~ 200 - 250 embryons hôtes.
   8. A 1 - 2 HPF, vérifier les embryons sous un microscope à dissection et supprimer tous les œufs non fécondés qui ne sont pas avancés pour les 2 ou 4 cellules étapes avec un transfert pipette Pasteur.

4. Préparation de Transplantations

ONTENU "> NOTE: Transplantations sont utilisés pour générer des embryons chimères permettant des effets de différents environnements d'accueil génétique à être évalués dans les progéniteurs des donateurs WT équivalents ^{9, 22, 23.}

1. la sélection d'embryons de donneurs
   1. A 3 HPF, vérifier les embryons donneurs de 2 - grossissement 5X pour le signal d'étiquetage sous un microscope à fluorescence. Sélectionnez bien développé (masse cellulaire symétrique avec des cellules de taille égale) embryons avec un signal fluorescent fort à l'aide de la GFP plus filtre (460-500 nm excitation, 510 nm émission longue passe) ou un filtre rouge Texas (540-580 nm d'excitation, 610 nm longue passe émission) (figure 1D). Les journalistes transgéniques ne sont pas encore exprimés.
2. plaque d'injection Agarose et Petri préparation de plat
   1. Verser fondu 2% d'agarose dilué dans du milieu E3 dans un diamètre boîte de Pétri de 90 mm et le laisser refroidir jusqu'à ce que le plat est sécuritairetoucher. agarose chaud peut autrement déformer le moule.
   2. Faire flotter un moule en matière plastique avec des protubérances en forme de coin (6 x 25 / moisissures) sur l'agarose (figure 2D, E). Évitez les bulles d'air en plaçant un côté du moule sur l'agarose et lentement plus bas de l'autre côté. Assurez-vous que le moule est centré dans le plat ou vers le côté de la pointe des saillies en forme de coin le plus profond pour permettre suffisamment d'espace de dégagement pour l'aiguille de transplantation.
   3. Laisser l'agarose se solidifier complètement à la température ambiante.
   4. Placer le plat d' agarose à 4 ° C pendant 30 min et retirez les moules en soulevant doucement d'un coin (par exemple, avec une pince). Préparer des plaques d'injection d'agarose le jour avant l'expérience et conserver à 4 ° C avec un petit volume de l'E3 opercule de moyen et de la paraffine pour les empêcher de se dessécher.
   5. Avant la transplantation, remplir la plaque d'injection agarose avec du milieu E3 et le placer dans un incubateur à 28,5 ° C pendant au moins 30 min.
   6. Depuis embryons dechorionated collent au plastique, soit des plats de verre d'utilisation ou enduire l'intérieur des boîtes de Pétri (diamètre 90 mm) avec une mince couche de 2% d'agarose en E3. Préparer un plat pour les embryons hôtes dechorionated, un plat pour les embryons donneurs dechorionated et un plat pour 40 embryons transplantés. Stocker comme décrit pour la plaque d'injection (4.2.4).
3. Préparation Transfert de pipette
   1. Couper l'extrémité d'une longue forme finement tiré verre embout pipette Pasteur (2 ml de volume, 230 mm de longueur, 100 mm de long pointe) à une longueur qui permet de manoeuvre confortable (en option) en grattant avec un couteau de diamant tout en tournant jusqu'à ce que les chutes de pointe off (figure 1F).
   2. Assurez-vous que la coupe est droite. Vernis à feu le verre de pipette de transfert en faisant tourner la surface de coupe dans un brûleur Bunsen pour générer des extrémités lisses afin de ne pas endommager les embryons dechorionated (figure 1F).
      NOTE: Garder la pointe de la pipette dans la flamme pendant trop longtemps wmauvais résultat dans l'ouverture étant scellée ou de devenir trop petit pour les embryons.
4. Dechorionating blastula donateurs et d'accueil des embryons au stade
   1. Embryons Dechorionate soit manuellement avec deux pinces fines par déchirer chaque chorion sans toucher l'embryon, ou enzymatiquement en utilisant la protéase pour permettre simultanée dechorionation rapide d'un grand nombre d'embryons ^9.
      1. Préparer une solution mère 100x de 50 mg / mL mélange protease, faire 100 aliquotes pi et les stocker à -20 ° C.
      2. Ajouter 100 ul du stock protéase à 10 moyenne E3 mL (concentration finale de 0,5 mg / protéase mL).
      3. Placez hôtes et donneurs d'embryons bien développés dans deux béchers petit verre de Erlenmeyer séparés (10 ml) et retirer le plus de liquide possible.
      4. Ajouter 5 ml de la solution de protease 0,5 mg / ml à chaque bécher et agiter doucement les embryons tout en les regardant sous un microscope de dissection. Surveillez tous les signes de déformation du chorion.
      5. Gardez tourbillonnant. Dès que le premier embryon est hors de chorion (figure 1D, astérisques), effectuer trois rinçages rapides avec un milieu E3 pour éliminer la solution de protéase en versant la majeure partie du liquide et le remplissage du flacon en versant doucement en E3 sur le côté. Ne pas laisser les embryons dechorionated à venir en contact avec l'air dans l'une des étapes suivantes jusqu'à la fin de la transplantation (section 5), comme ils éclateront. Laissez solution adéquate dans le ballon entre les rinçages.
      6. Avec le feu poli transfert de verre pipette, transférer les embryons du bêcher Erlenmeyer en verre ou des boîtes de Pétri agarose (2% en milieu E3) revêtu de vaisselle en plastique. pipette doucement pendant le transfert pour éliminer tout chorion affaibli restant.
5. préparation de l'aiguille de transplantation
   1. Utilisez un extracteur d'aiguille pour tirer deux aiguilles de chaque tube mince de verre borosilicate de paroi (1,0 mm OD/ 0,78 mm ID / 100 mm de longueur) avec les mêmes paramètres que les pipettes microinjection.
      REMARQUE: Exemple de réglages pour l'extracteur d'aiguille utilisé ici sont fournis dans la liste des matières. aiguilles Transplantations ne disposent pas d'un insert en verre, en ce qui endommage les cellules aspirées dans l'aiguille.
   2. Tirez les aiguilles à l'avance, magasin dans une boîte de Pétri et de sécuriser en appuyant sur une bande de mastic moulable ou de ruban adhésif.
   3. Avant la transplantation amener la pointe de l'aiguille mise au point sous un microscope à dissection et utiliser des pinces pour briser l'aiguille à la pointe. Utilisez une pince fine pour ajuster la forme de l'aiguille à viser une flûte en forme (figure 2G), ou utiliser d' autres méthodes décrites pour générer la forme de la pointe ^23.

5. Chimera Generation via Blastula Transplantation

1. configuration de la transplantation
   NOTE: Ici, un appareil de transplantation auto-assemblée a été utilisé (figure 2A ).
   1. Monter l'aiguille de transplantation dans le même porte-aiguille utilisée pour microinjection ci - dessus (monté sur micromanipulateur, étape 3.1.3) (figure 2A).
   2. Déconnecter le tuyau par injection qui relie l'extrémité du support de la micropipette au micro-injecteur régulé en pression utilisé pour la microinjection. Fixer le tube d'injection qui est reliée à une seringue de 1 ml (figure 2A, B), qui représente la plate - forme de la transplantation.
      1. Assurez-vous que toutes les connexions sont hermétiquement fermés en utilisant un film de paraffine ou du mastic moulable. Empêcher les embryons d'entrer en contact avec de l'air en faisant en sorte qu'il y ait toujours un certain milieu E3 dans l'aiguille de transplantation elle-même. Faire fonctionner la seringue pour aspirer manuellement cellules / liquide dans et hors de l'aiguille de transplantation.
2. alignement Embryo
   1. Transférer les embryons de donneur avec la pipette de verre dans la première colonne du moule d'agarose. Transférer les embryons hôtes dans les colonnes 26 du moule d' agarose (figure 2F). Positionner les embryons avec la pipette de sorte que le côté blastomère vers le haut.
3. Transplantation
   1. Reposer délicatement l'aiguille de transplantation sur une cellule de blastomère d'un embryon donneur et sucer lentement environ 20-50 cellules dans l'aiguille de transplantation (figure 2H). Évitez de sucer le jaune.
   2. Soulever l'aiguille de transplantation de l'embryon de donneur à l'aide du micromanipulateur. Déplacez le plat de moule d'agarose à gauche et insérez la pointe de l'aiguille de transplantation à travers le côté de la masse cellulaire dans le pôle animal du premier embryon hôte. Dépôt 5 - 10 cellules près de la surface selon la cartographie sort montrant que cette zone donne lieu au champ prosencéphale / oeil ²⁴ (Figure 2I). Gardez la pointe de l'aiguille immergé dans le milieu E3 tout au long de la procédure.
4. Soins d'embryons transplantés
   1. Retirer le donneur d'embryons and laisser les embryons hôtes dans le moule d'agarose pour 1 - 2 h à 28,5 ° C. Remplissez verre ou en plastique (enduit de 2% d'agarose) des boîtes de Pétri avec un milieu E3 contenant 0,003% de N-phénylthiourée (PTU) pour empêcher la formation de pigment car cela va interférer avec l'imagerie. Transférer les embryons hôtes dans ces plats avec le feu poli pipette en verre et incuber à 28,5 ° CO / N.
      ATTENTION: Porter des gants lors de la manipulation PTU.

6. Configuration en direct d'imagerie

NOTE: La petite taille et la transparence optique du zebrafish combinée avec le développement rapide ont permis de devenir un modèle vertébré clé pour l' imagerie in vivo de différentes cellules et des organes. L'imagerie peut être effectuée sur une variété de microscopes, qui diffèrent par la configuration et les paramètres. Ce qui suit décrit une installation d'imagerie confocale approprié pour l' imagerie du développement de la rétine ^{5, 8.}

1. embryon chimèresélection
   1. A 24 - 26 HPF, l'écran des embryons transplantés sous un champ de dissection fluorescent pour sélectionner les embryons sains sont bien développés qui montrent les cellules transplantées donateurs (H2A-GFP ou H2B-RFP marqués) dans le primordium des yeux en développement.
   2. Mettre de côté jusqu'à 40 embryons pour le montage par pipetage dans un nouveau plat et ajouter 0,4 mg / mL tricaïne methanesulfate (MS222) pour anesthésier les embryons.
      ATTENTION: Porter des gants lors de la manipulation MS222.
2. embryons de montage
   REMARQUE: Utiliser le plat de montage approprié, selon que l' imagerie sera réalisée sur un microscope inversé ⁸ ou verticale (décrit ici).
   1. Préparer quelques tubes en plastique de 1,5 ml contenant 1 ml de 1% d'agarose à faible fusion à 0,4 mg / ml dans du milieu MS222 E3 et maintenir en fusion dans un bain d'eau à 40 ° C.
   2. Aspirer 5 embryons dans une pipette de transfert en plastique et laisser les embryons accumulent dans la pointe par gravité. Appuyez sur la pipette de transfertsur la surface de l'un des tubes en matière plastique préparés contenant 1% d'agarose bas point de fusion et de 0,4 mg / ml MS222 permettant aux embryons de couler dans le tube tout en limitant la quantité de transfert E3.
   3. embryons de montage dans un diamètre plat de 90 mm de Pétri pour l'imagerie au microscope droit et à fond de verre boîte de Pétri (toute taille) pour l'imagerie au microscope inversé. Utilisez un marqueur permanent pour diviser visuellement soit plat en deux moitiés aux donateurs d'image dans les hôtes WT (d'un côté) ou des hôtes morphant (autre côté) dans la même expérience.
   4. Transférer les cinq embryons du tube en plastique d'agarose soit boîte de Pétri avec 0,5 à 1 ml d'agarose. Enlever l'excès d'agarose avec une pipette de transfert de sorte que seule une petite goutte (~ 200-300 pi) reste. Si l'imagerie par microscopie verticale, évitez de placer des embryons à moins de 1 cm de circonférence le plat de Pétri. La lentille d'immersion d'immersion dans l'eau utilisée pour l' imagerie peut ne pas être en mesure d'être centré dans ce domaine en raison de la boîte de Petri mur (figure 3A </ Strong>).
   5. Utiliser une pipette de microloading (avec la pointe cassée) pour aligner les embryons latéralement jusqu'à solidification agarose. Pour les deux types de plats, les embryons sont correctement inclinés latéralement si les deux yeux de chaque côté de la tête sont complètement chevauchement (aligné dans la dimension XY) (figure 3B). Pour l'utilisation de la microscopie inversée, l'œil près de la lamelle doit être poussé aussi près de la lamelle que possible, afin de permettre l'imagerie par la dimension z dans les limites des niveaux de discussion possibles.
   6. Continuer le montage cinq embryons à la fois dans des gouttes d'agarose individuelles. Utiliser plus de 1% d' agarose à bas point de fusion se joindre à l'agarose tombe à l'autre et du côté de la coupelle pour empêcher tout délogement et le déplacement latéral lors de l' imagerie (figure 3A).
   7. Une fois complètement solidifié, couvrir le plat avec du milieu E3 (contenant 0,003% PTU, 0,4 mg / mL MS222) préchauffée à 28,5 ° C.
   8. En utilisant la même approche décrite dans les étapes 6.2.2- 6.2.8, montage ~ 20 embryons transgéniques élevés à 32 ° C (étape 1.2.5) dans un plat séparé.
3. Les paramètres d'imagerie
   NOTE: L'imagerie pour analyser l'apparition de transgènes fluorescents ne nécessite pas une grande résolution spatiale intracellulaire. Elle peut être réalisée avec un 70 mm objectif W Plan-Apochromat 20X / 1.0 DIC M27 à 1,5 zoom.
   1. Mettre en place le temps de la puissance du laser et de l' exposition sur la base de l'intensité du transgène pour les ~ 20 embryons transgéniques avec un développement accéléré (ie soulevées à 32 ° C; l' étape 6.2.8).
      NOTE: Pour les études de l'apparition de l'expression du transgène, les embryons expérimentaux montrent aucune fluorescence au moment où le time-lapse est mis en place et donc, ces embryons accélérés sont essentiels pour déterminer les paramètres de l'image.
   2. Pour le plat expérimental, de visualiser chaque embryon et enregistrer la position et de se concentrer niveaux des embryons.
      1. Choisissez des embryons qui ont l'angle de montage correct (ie avec le s latéralide de l'œil aussi horizontale que possible) et un battement de coeur fort (un indicateur de la santé). Choisissez embryons avec quelques cellules du donneur transplanté (identifiées par H2A-GFP ou l' étiquetage H2B-RFP) principalement dans le quadrant ventrale antérieure de la rétine en développement (où la vague de l' expression génique commence) (figure 3C).
         NOTE: Dans les embryons de poisson zèbre, la fréquence cardiaque moyenne est de 120 - 180 battements / minute ^25. Dans les embryons anesthésiés, un battement de coeur en bonne santé peut être dans la gamme de 60 - 120 battements / minute. rythme cardiaque plus lent peut être le signe de la viabilité réduite et ces embryons doivent être exclus de l'étude.
   3. Définir z empilements de coupes optiques à des intervalles de 2 um à travers la rétine jusqu'à 15 embryons.
      NOTE: Le nombre total d'embryons qui peuvent être imagés dans toute expérience donnée dépendra de paramètres individuels (temps d'exposition et la taille z-stack). Le temps pris pour l'image 1 point de temps pour tous les embryons choisis doit être shOrter que l'intervalle entre les points temporels. En sacrifiant une résolution en profondeur, plus d'embryons peuvent être visualisés dans les intervalles de temps. Les limites de la z-stack sont choisis comme extrêmes latéral et médial de l'embryon oeil monté et 30 um est ajouté au côté latéral dans la configuration verticale de la microscopie, comme les yeux des embryons en développement dans cette configuration décalage dans la direction z comme les embryons se développer pendant une nuit. Il en résulte des piles 100-170 um d'épaisseur (50 - 85 images / oeil).
   4. Prenez des images toutes les 24 min à 32 ° C (équivalent à 0,5 HPF intervalles) en utilisant le laser / canal approprié au transgène.
      NOTE: Les embryons restent sur la scène tout au long du time-lapse dans une chambre chauffée englobant l'ensemble du microscope. Bien que l'expérience peut être effectuée à 28 ° C, des températures plus élevées sont utilisées pour accélérer le développement et veiller à ce que les points de temps pertinents dans l'expérience sont imagés dans le 16 - période de temps de défaillance 24 h.
   5. Imagecanaux représentant le marqueur donneur (H2A-GFP ou H2B-RFP - en option) et transgène (Atoh7: DP ou Vsx1: GFP) en utilisant un balayage séquentiel. Pour l'analyse, utiliser le marqueur donneur qu'à choisir les embryons appropriés comme décrit (prendre un z-stack au début de l'imagerie), puis effectuer time-lapse uniquement sur le canal pour capturer l'expression du transgène.
      REMARQUE: Vous pouvez également utiliser l'étiquette du donneur que pour sélectionner des embryons appropriés (ceux avec des cellules confirmées transplantées dans antérieure quadrant ventrale) et l' image que le canal de transgène, à peu près réduire de moitié le temps d'imagerie et presque doublé le nombre d'embryons qui peuvent être imagés et analysées par l' expérience (figure 4).

Résultats

Ce travail présente un protocole expérimental pour évaluer les changements dans le gène timing d'expression lorsque type sauvage progéniteurs rétiniens se développent dans un embryon morphant hôte. Les embryons hôtes expérimentaux sont morphants Ptf1a, qui manquent de interneurones intermédiaires nés horizontales et amacrines de la rétine ^{7, 26.} Celles-ci ont été comparées pour contrôler les embryons hôtes, ...

Discussion

Comprendre la mesure dans laquelle les cellules voisines influencent le moment de l'expression des facteurs déterminant du destin cellulaire essentiel est essentiel lorsque l'objectif est d'instruire efficacement les cellules souches multipotentes embryonnaires ou induites à se différencier en un type de cellule post-mitotique spécifique ou même des tissus à motifs. En outre, l' examen de ces événements moléculaires dans les cellules en développement de l'animal vivant fournit en outre dyna...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bioline	BIO-41025	Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C
Agarose low melt	Sigma	A9414-100G	Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
borosillicate glass capillary tube w/o filament	SDR Scientfic	30-0035	alternatives with similar diameter can be used
borosillicate glass capillary tube with filament	SDR Scientfic	30-0038	alternatives with similar diameter can be used
glass petri dishes (60 mm diameter)	Science Supply	1070506	any glass alternative of any size
Injection tube (2 m)	Eppendorf	524616004	This connects the needle holder to the syringe during transplantation
Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)	Adaptive Science Tools	PT-1	alternatives with similar shape can be use
microneedle holder	Narishige	M-152	any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
microinjector	Narishige or Eppendorf Femtojet		Pneumatic injector using gas pressure
micromanipulator	Coherent Scientific	M330IR	similar alternatives can be used
microloader tip	Eppendorf	5242956003
Mineral oil	Sigma	M5904-500ML
needle puller	Sutter Instruments	Model P-2000	Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
Parafilm	Interpath	PM996	any paraffin film
Pasteur pipette plastic	Samco Scientific	202
Pasteur pipette glass	Hirschmann Laborgeraete	9260101
Pronase	Sigma	P5942-25MG	Protease Type XIV
N-phenyl thiourea	Sigma	P7629-25G	PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use.
Qiaquick gel extraction	Qiagen	28704	any alternatives to purify DNA can be used
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104	any alternatives to purify RNA can be used
SP6 mMessage kit	Qiagen	AM1340	any alternatives to transcribe DNA using SP6