Imaging in vivo del transgenico espressione genica nei singoli retinica Progenitori in embrioni di zebrafish Chimerico da Cell studio Influenze non autonomo

Riepilogo

Live tracking dei singoli progenitori retinici WT in background genetici distinti consente la valutazione del contributo delle cellule di segnalazione non autonomo durante la neurogenesi. Qui, una combinazione di knockdown gene, generazione chimera tramite trasferimento di embrioni in time-lapse imaging confocale vivo è stata utilizzata per questo scopo.

Abstract

I punti di forza genetici e tecnici hanno fatto la vertebrati zebrafish organismo modello chiave in cui le conseguenze di manipolazioni genetiche possono essere rintracciate in vivo per tutto il periodo di sviluppo rapido. Più processi possono essere studiati tra cui la proliferazione cellulare, l'espressione genica, la migrazione delle cellule e la morfogenesi. È importante sottolineare che la generazione di chimere attraverso trapianti possa essere effettuata facilmente, permettendo etichettatura mosaico e monitoraggio delle singole celle sotto l'influenza dell'ambiente host. Ad esempio, mediante la combinazione di manipolazioni funzionali di geni dell'embrione host (ad esempio, attraverso morfolino microiniezione) e l'imaging dal vivo, gli effetti di estrinseco, segnali non autonomi cellulari (forniti dall'ambiente geneticamente modificati) su singole cellule del donatore trapiantate possono essere valutate. Qui mostriamo come questo approccio viene utilizzato per confrontare l'insorgenza di espressione del transgene fluorescente come proxy per i tempi del destino delle cellule determinzione in diversi ambienti host genetica.

In questo articolo, forniamo il protocollo per microinjecting embrioni di zebrafish per marcare cellule del donatore e di causare silenziamento genico in embrioni di accoglienza, una descrizione della tecnica di trapianto usato per generare embrioni chimerici, e il protocollo per la preparazione e l'esecuzione in vivo confocale time-lapse imaging più embrioni. In particolare, l'esecuzione di imaging multiposizione è cruciale quando si confrontano tempistica di eventi come l'insorgenza di espressione genica. Ciò richiede la raccolta di dati dal controllo multiplo e embrioni sperimentali elaborati contemporaneamente. Tale approccio può essere facilmente esteso per gli studi di influenze estrinseche in qualsiasi organo o tessuto di scelta accessibili a vivere l'imaging, a condizione che i trapianti possono essere mirati facilmente in base alle mappe destino embrionali stabiliti.

Introduzione

La possibilità di visualizzare importanti processi di sviluppo in un vertebrato in vivo ha contribuito a rendere il pesce zebra un modello chiave per lo studio condizioni normali e di malattia (recensione in ^{1, 2).} In particolare, la retina neurale è una parte accessibile del sistema nervoso centrale. La retina si presta per effettuare facilmente studi di neurogenesi per la sua altamente organizzata, ma struttura relativamente semplice, ed i suoi tipi di neuroni altamente conservati tra le specie di vertebrati ^3. Dinamica dei comportamenti cellulari come la proliferazione, l'uscita del ciclo cellulare, la divisione cellulare asimmetrica, specifica il destino, la differenziazione, e la formazione di circuiti neurali possono essere seguiti durante tutto il processo di retinogenesi, che si completa nella retina centrale del pesce zebra da 3 d postfertilization ( dpf) ^{4, 5,}ref "> ^{6, 7.}

Inoltre, i requisiti funzionali dei diversi geni in ciascuna delle fasi di cui sopra possono essere contemporaneamente valutati nella retina zebrafish, fornendo un vantaggio rispetto ad altri modelli di vertebrati in cui fenotipi derivanti dall'applicazione di tecniche di gene knockout può essere valutata solo dopo l'esame post-mortem di fisso tessuti. In particolare, l'uso di linee transgeniche in cui possiamo visualizzare e monitorare l'espressione di proteine ​​fluorescenti come transgeni giornalista nella retina, ci permette di ottenere risoluzione temporale di espressione genica che sottende la genesi di un particolare tipo di cellule neuronali. A causa del rapido sviluppo di zebrafish, questi eventi possono essere visualizzati durante l'intero periodo di sviluppo, fornendo in tal modo una più profonda comprensione sull'importanza temporale di espressione genica in relazione all'acquisizione identità delle cellule neuronali e il comportamento delle cellule.

Infine, questi approcci possono essere combinati in modo efficiente nel pesce zebra con la generazione di chimere via trapianti, con conseguente intuizioni in due aspetti fondamentali della funzione del gene. In primo luogo, esaminando le cellule trapiantate da un embrione donatore, in cui un particolare gene è stato abbattuto mentre si sviluppano in un ambiente senza etichetta wild type, ci permette di ottenere le informazioni pertinenti circa la funzione del gene in modo cellula-autonomo. Questo porta a importanti intuizioni circa la funzione di fattori destino determinanti della retina all'interno delle cellule progenitrici sono normalmente espressi in. Questo è esemplificato dal l'esame dei risultati destino di sviluppo dei progenitori che non può più generare proteina funzionale di questi geni ^{4, 6, 8, 9.} Utilizzando questo approccio, abbiamo dimostrato che i fattori determinanti molti Fate (ad esempio, Vsx1, Atoh7, PTF1A, Barhl2) agiscono cellule-autonomously guidare specifici sorti neuronali della retina; la mancanza di espressione genica comporta principalmente un interruttore destino, tale che le cellule con silenziamento genico rimangono vitali adottando un destino alternativo cella ^{4, 6, 7, 10.} In secondo luogo, tali esperimenti chimerici possono essere utilizzati per valutare come selvaggio di tipo progenitori si comportano quando si sviluppano all'interno di diversi ambienti genetici. Ad esempio, confrontando lo sviluppo di cellule WT che normalmente esprimono un gene di interesse (e giornalista transgene) in un WT rispetto ambiente host manipolato (ad esempio, gene knockout / knockdown), gli effetti derivanti sull'espressione genica e destino cellulare possono essere valutati . La mancanza di alcuni tipi di neuroni in ambiente host, ad esempio, è stato dimostrato di influenzare wild type comportamento progenitore in maniera cellule non autonomo, per sollecitare loro verso differenziazione nel o sottorappresentatir mancante tipi di neuroni ^{4, 7, 11, 12.} Dato che i neuroni della retina sono nati in un ordine histogenic conservata dalla fasatura sequenziale espressione di specifici geni destino determinanti neuronali (destino espressione genica) (rivisto in ^13), abbiamo utilizzato questi metodi per dimostrare come la tempistica di espressione genica destino in progenitori di tipo selvatico è influenzato quando tali progenitori si sviluppano in ambienti host della retina con composizioni cellulari aberranti indotte. Qui, descriviamo questi approcci come prova di come la combinazione di tecniche relativamente standard e ampiamente utilizzati consente l'esame della tempistica di espressione genica destino nello sviluppo di progenitori retinici ^{8, 9.}

Questo protocollo descrive un approccio sperimentale che combina l'imaging time-lapse con la facilità di ogniformando il trapianto nella ex vivo in via di sviluppo dell'embrione zebrafish per seguire mosaically individuale cellule marcate durante l'intero periodo di retinogenesi sviluppo. Eseguendo manipolazioni genetiche funzionali sia nell'embrione di accoglienza, embrione donatore, entrambi o nessuno, si può valutare l'autonomia delle cellule della funzione del gene. Questo approccio può essere adattato ampiamente domande di ricerca simili a qualsiasi altro sistema per cui i singoli componenti descritti qui sono adatti.

Protocollo

Tutte le procedure sono state effettuate secondo le disposizioni del codice australiana National Health and Medical Research Council di pratica per la cura e l'uso di animali e sono stati approvati dai comitati etici istituzionali.

1. Preparazione di Zebrafish

1. Adulti abbinamento pesce
   1. Impostare pesci adulti come coppie (o due coppie) in vasche di allevamento di dimensioni in modo appropriato la sera prima dell'uso.
   2. Per mantenere la femmina separata dal maschio, utilizzare un divisore per consentire il pesce di vedere, ma non si toccano.
   3. Al mattino, dopo l'accensione la luce, togliere i divisori e permettere ai pesci di accoppiano indisturbati.
   4. Dopo l'accoppiamento con successo messo pesci adulti nelle loro vasche originali.
      NOTA: ceppi di host e donatore può essere lo stesso, ad esempio, eventuali wild type (WT) ceppi. Per questo studio gli embrioni donatori derivano dalle linee transgeniche Tg (atoh7: gapRFP), Tg (atoh7: gapGFP) oTg (vsx1: GFP) in cui l'espressione di fattori determinanti destino di guida in anticipo o in ritardo destino neurale possono essere visualizzati, rispettivamente di ^{14, 15, 16.} Al fine di confrontare gli effetti di diversi ambienti genetici, gli embrioni host può essere mutanti o morphants specifici come descritto di seguito.
2. raccolta degli embrioni
   1. Utilizzare un colino da tè per raccogliere le uova dalla casella di allevamento. Verificare la presenza di uova ogni 15 minuti per determinare il momento della nascita e garantire embrioni stadio unicellulari sono raccolti per le fasi successive.
   2. Risciacquare embrioni con mezzo E3 (5 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,4 mM CaCl _2, 0.9 mM MgCl ₂ e 2% di blu di metilene in acqua distillata) e metterli in piastre di Petri contenenti ~ 40 mL E3 ¹⁷ ad una densità massima di 50 uova per 90 millimetri di diametro Petri.
   3. Etichettare le piastre di Petri con il nome ceppo, data e ora dinascita. Utilizzare una pipetta Pasteur di trasferimento per rimuovere eventuali detriti, mentre la visualizzazione degli embrioni sotto il microscopio da dissezione.
   4. Mantenere gli embrioni a 28,5 ° C fino a ~ 3 ore postfertilization (HPF) per il trapianto, o continuare con microiniezioni.
      NOTA: Per i trapianti, obiettivo per gli embrioni di donatori e di accoglienza in età simili. Pertanto, utilizzare diverse temperature di allevamento tra 25 - 32 ° C secondo Kimmel et al. ¹⁸ di rallentare o accelerare una frizione di embrioni per abbinare l'altro.
   5. Mantenere ~ 20 degli embrioni donatori transgenici uninjected a 32 ° C dal momento della raccolta fino time-lapse imaging (24 - 28 ore più tardi).
      NOTA: Queste svilupperanno più velocemente di quanto la coorte sperimentale e potranno esprimere marcatori fluorescenti in precedenza. Essi possono quindi essere utilizzati per impostare i parametri (laser di potenza, guadagno) per l'imaging. In questo particolare esempio, l'imaging della coorte sperimentale comincia prima espressione del transgene (per valutarel'esatta tempistica di questo evento).

2. Preparazione per la microiniezione

1. preparazione microiniezione ago
   1. Utilizzare un estrattore ago per tirare gli aghi da ciascun tubo capillare di vetro borosilicato (1,0 mm di diametro / 0,78 mm ID / 100 mm di lunghezza capillari di vetro) al centro per ottenere due aghi di uguale lunghezza. Obiettivo per gli aghi che si assottigliano con alberi lunghi.
      NOTA: Le impostazioni di esempio per l'estrattore ago usato qui sono forniti nel Lista dei materiali.
   2. Conservare gli aghi tirati in una capsula di Petri e fissare premendoli in una striscia di stucco modellabile o nastro adesivo.
   3. Prima dell'iniezione portare la punta dell'ago a fuoco in un microscopio da dissezione e utilizzare pinze per rompere l'ago sulla punta. Obiettivo per una punta conica tagliente con una piccola apertura (Figura 1C).
2. preparazione Morpholino per gli embrioni di accoglienza
   1. oligonucleotidi ordine morpholino specificamente progettati per il gene di interesse, nonché un morfolino controllo standard o un adeguato mancata corrispondenza 5 paia di basi per controllare gli effetti procedurali e di movimentazione.
      NOTA: Qui, una traduzione bloccando Ptf1a morfolino con la sequenza 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 'che inibisce lo sviluppo delle cellule orizzontali e amacrine nati intermedi, e morfolino controllo zebrafish serie di targeting beta-globina umana introne mutazione (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA -3 ') ^{7, 19} sono stati utilizzati.
   2. Preparare una soluzione 1 mM morfolino magazzino (~ 8-8,5 ng / NL) e conservare a temperatura ambiente.
   3. Il giorno dell'iniezione, riscaldare una aliquota (10 mL) di morfolino a 65 ° C per 10 minuti, centrifugare brevemente e posto sul ghiaccio per raffreddare da 65 ° C (dopo di che può essere conservato a temperatura ambiente durante l'uso). thè invertirà qualsiasi potenziale aggregazione all'interno della soluzione morfolino, che può diminuire l'efficacia della atterramento.
      1. Per Ptf1a morfolino ed equivalente morfolino controllo standard, preparare una soluzione di lavoro di 6 ng / NL diluendo la soluzione madre morfolino con acqua distillata. Mantenere a temperatura ambiente.
         NOTA: L'uso 2 NL del morfolino per embrione come il Ptf1a morfolino richiede una concentrazione relativamente alta di lavoro di 12 ng per embrione come stabilito in precedenza ^7. Per la maggior parte morpholinos, 2-5 ng per embrione è efficace, in modo da diluire il brodo di 2-5 ng / NL e iniettare 1 NL in ogni embrione.
3. Preparazione fluorescente giornalista fusione istone costrutti per gli embrioni di etichettatura dei donatori
   NOTA: Per distinguere / visualizzare le cellule del donatore all'interno embrioni di accoglienza, ci sono diversi approcci per etichettare l'embrione donatore, tra cui la microiniezione di H2A-GFP (se si utilizza donatori transgeniche congiornalisti fluorescenti rossi) o H2B-RFP (se si utilizza donatori transgenici con i giornalisti fluorescenti verdi) mRNA nel tuorlo della singola cellula embrionale fase del donatore.
   1. Linearizzare almeno 1 ug plasmide contenente il DNA giornalista.
      NOTA: Qui pCS2 + plasmide (generata e gentilmente fornito dal Prof. David Turner presso l'Università del Michigan e il Prof. Ralph Rupp dal Biomedical centro di Monaco di Baviera) contenente H2A-GFP o H2B-RFP (generato dal Dr. Christopher Wilkinson, Royal Holloway, Università di Londra) è stato linearizzato con NotI enzima di restrizione digestione.
   2. Purificare DNA utilizzando kit disponibili in commercio secondo le istruzioni del produttore.
   3. Trascrivere mRNA utilizzando kit disponibili in commercio con polimerasi appropriato secondo le istruzioni del produttore. Per il plasmide pCS2 +, utilizzare un kit SP6 polimerasi.
   4. Purificare mRNA utilizzando kit commerciali o estrazione con fenolo-cloroformio seguita da isopropanolo precipitazioni come da istruzioni del produttoreS. Diluire il mRNA in acqua ultrapura (20 - 30 mL), misurare la concentrazione con uno spettrofotometro e conservare a -80 ° C.
   5. Il giorno dell'iniezione, preparare una soluzione di lavoro di mRNA in acqua sterile con una concentrazione finale di 100 ng / ml e tenere in ghiaccio. Rientro mRNA inutilizzato magazzino torna a -80 ° C.

3. la microiniezione di Morpholinos e / o di mRNA in Single-cell fase embrioni

NOTA: microiniezioni sono usati per contrassegnare tutte le cellule del donatore e per preparare i diversi ambienti host (controllo e silenziamento genico) e coinvolgono iniezioni di mRNA o morfolino oligonucleotidi antisenso ^{20, 21.}

1. Caricamento e calibrare l'ago per l'iniezione
   1. Ritardare l'ago per l'iniezione con 3 ml di morfolino e / o soluzione fusione mRNA istone-fluorescente con punte microloader pipette.
   2. Agitare il solutione verso la punta dell'ago iniezione fino a quando non vi siano bolle rimanenti. Utilizzare aghi per iniezione con un vetro interno inserire tale che questa soluzione sarà tratto principalmente alla punta per capillarità.
   3. Attaccare l'ago per l'iniezione di un supporto montato in un micromanipolatore (micromanipolatore manuale 3D) e di garantire una perfetta tenuta all'interno dell'alloggiamento del tubo.
   4. Accendere l'elettricità e gas alla pressione regolata microinjector.
   5. Immergere la punta dell'ago in una goccia di olio minerale in un piatto (se si utilizza un oculare reticolo) o librarsi la punta dell'ago direttamente su una slitta micrometrica per calibrare il volume goccia. Misurare il volume di iniezione premendo il pedale e regolare la pressione del gas e / o di durata fino a quando il volume di iniezione è equivalente a 1 nL (125 micron di diametro).
      NOTA: Il vantaggio della slitta micrometrica è che le misurazioni sono indipendenti dal ingrandimento utilizzato al microscopio, ma in base alle ins oculare reticolotead, la caduta di iniezione e la scala può essere a fuoco contemporaneamente.
2. embrione microiniezione
   1. Collocare un vetrino da microscopio in una piastra di Petri e utilizzare una pipetta di trasferimento per depositare embrioni fase unicellulari lungo il bordo diapositiva. Allineare in una singola colonna utilizzando una punta microloader pipetta con la metà della punta sottile tagliare. Rimuovere quanto più liquido possibile con una multa pipetta di trasferimento per impedire movimenti durante le iniezioni (Figura 1A).
   2. Abbassare l'ago verso l'embrione, e penetrare il corion e tuorlo in un colpo regolare (Figura 1B).
   3. Una volta che la punta dell'ago è centrato nel tuorlo, microinject premendo il pedale. Iniettare 1 NL di H2A-GFP o H2B-RFP mRNA nel tuorlo di un embrione donatore fase unicellulare (transgenici). Iniettare 2 NL standard MO o Ptf1a MO nel tuorlo di uno stadio unicellulare wild type embrione ospite premendo due volte il pedale. iniezioni di successo possono essere visualizzati dal Smal l deformazione spaziale nel tuorlo.
   4. Rimuovere l'ago per l'iniezione, spostare il piatto contenente gli embrioni per portare la prossima dell'embrione in posizione e continuare a iniettare fino a quando l'intera colonna di embrioni vengono iniettati (50 - 60 embrioni).
   5. Dopo l'iniezione tutti gli embrioni, sollevare il piatto fino a 30 - angolo di 45 ° e utilizzare una leggera corrente di E3 media (bottiglia squeeze) per trasferire gli embrioni iniettati in un nuovo piatto pulito Petri.
   6. Posizionare il piatto embrione in un incubatore (sia a 28,5 ° C o altra temperatura per garantire che gli embrioni donatori e ospitanti sono in età equivalenti).
   7. Ripetere i punti 3.2.1 - 3.2.6, se necessario, per ottenere ~ 100 embrioni donatori o ~ 200 - 250 embrioni di accoglienza.
   8. A 1 - 2 HPF, controllare gli embrioni sotto un microscopio da dissezione e rimuovere eventuali uova non fecondate che non hanno avanzato al 2 o 4 celle stadi con un trasferimento pipetta Pasteur.

4. Preparazione per Trapianti

ONTENUTO "> NOTA: Trapianti vengono utilizzati per generare embrioni chimerici tenendo conto degli effetti di differenti ambienti host genetica da valutare entro equivalenti WT progenitori donatori ^{9, 22, 23.}

1. la selezione degli embrioni donatori
   1. A 3 HPF, controllare gli embrioni donatori a 2 - ingrandimento 5X per il segnale di etichettatura sotto un microscopio a fluorescenza. Selezionare ben sviluppato (massa cellulare simmetrica con le cellule in modo uniforme imprese) embrioni con un forte segnale fluorescente utilizzando la GFP e filtro (460-500 nm di eccitazione, 510 nm emissione di passaggio lungo) o un filtro Texas Red (540-580 nm di eccitazione, 610 nm emissione di passaggio lungo) (Figura 1D). I giornalisti transgenici non sono ancora espressi.
2. piastra di iniezione agarosio e preparazione piastra di Petri
   1. Versare fuso 2% agarosio diluito in media E3 in un diametro di Petri 90 mm e lasciate raffreddare fino a quando il piatto è sicurotoccare. agarosio calda può altrimenti deformare lo stampo.
   2. Float uno stampo di plastica con sporgenze a forma di cuneo (6 x 25 / stampo) sul agarosio (Figura 2D, E). Evitare bolle d'aria collocando un lato dello stampo sul agarosio e lentamente più in basso l'altro lato. Assicurarsi che lo stampo è centrato nel piatto o verso il lato del punto più profondo delle sporgenze a forma di cuneo per consentire spazio libero sufficiente per l'ago trapianto.
   3. Lasciare che il agarosio solidificare completamente a temperatura ambiente.
   4. Porre la capsula agarosio a 4 ° C per 30 minuti e rimuovere gli stampi sollevando delicatamente da un angolo (ad esempio, con una pinza). Preparare piatti iniezione agarosio il giorno prima dell'esperimento e conservare a 4 ° C con un piccolo volume di E3 tenuta media e paraffina pellicola per evitare che si secchi.
   5. Prima del trapianto, riempire il piatto di iniezione agarosio a media E3 e posto in un incubatore a 28.5 ° per almeno 30 minuti.
   6. Dal momento che gli embrioni dechorionated aderisce alla plastica, sia piatti di vetro di uso o rivestire l'interno delle piastre Petri (90 mm di diametro) con un sottile strato di 2% agarosio in E3. Preparare un piatto per gli embrioni di accoglienza dechorionated, un piatto per gli embrioni donatori dechorionated e un piatto per ogni 40 embrioni trapiantati. Conservare come descritto per la piastra di iniezione (4.2.4).
3. preparazione di trasferimento pipetta
   1. Tagliare la punta di una lunga forma finemente tirato vetro punta pipetta Pasteur (2 volumi mL, 230 mm di lunghezza, 100 mm di lunghezza punta) ad una lunghezza che permette di manovra confortevole (opzionale) graffiando con una lama di diamante mentre ruotando fino cascate punta off (Figura 1F).
   2. Assicurarsi che il taglio è dritto. Fuoco polacco il trasferimento pipetta di vetro ruotando la superficie di taglio in un becco Bunsen per generare estremità lisce in modo da non danneggiare gli embrioni dechorionated (Figura 1F).
      NOTA: Mantenere la punta della pipetta nella fiamma per troppo tempo will risultato nella apertura essendo sigillato o diventare troppo piccolo per gli embrioni.
4. Dechorionating blastula donatori e di accoglienza embrioni stadio
   1. Embrioni Dechorionate sia manualmente con due pinza sottile per strappare aperto ogni chorion senza toccare l'embrione, o enzimaticamente utilizzando proteasi per consentire una rapida simultanea dechorionation di un gran numero di embrioni ^9.
      1. Preparare una soluzione madre 100X di 50 mg miscela proteasi / mL, fare aliquote di 100 microlitri e conservarli a -20 ° C.
      2. Aggiungere 100 ml di brodo proteasi a 10 ml di mezzo E3 (concentrazione finale di 0,5 mg / ml proteasi).
      3. Luogo ben sviluppati ospitanti e donatori di embrioni in due bicchieri di vetro piccolo Erlenmeyer separati (10 ml) e rimuovere quanto più liquido possibile.
      4. Aggiungere 5 ml di 0,5 mg / ml soluzione proteasi per ciascun bicchiere e miscelare delicatamente gli embrioni mentre guardando loro sotto un microscopio da dissezione. Guarda per eventuali segni di deformazione del corion.
      5. Mantenere vorticoso. Non appena il primo embrione è fuori corion (Figura 1D, asterischi), eseguire tre risciacqui veloci con medie E3 per rimuovere la soluzione di proteasi versando la maggior parte del liquido e riempire il matraccio versando delicatamente E3 lungo il lato. Non permettere embrioni dechorionated vengano a contatto con l'aria in uno dei passaggi successivi fino alla fine del trapianto (punto 5), saranno scoppiare. Lasciare adeguata soluzione nel pallone tra i risciacqui.
      6. Con il fuoco lucido pipetta di vetro, trasferire gli embrioni dal bicchiere Erlenmeyer in piastre di Petri di vetro o agarosio (2% in media E3) rivestite piatti di plastica. pipettare delicatamente durante il trasferimento di cancellare qualunque corion indebolita rimanente.
5. preparazione trapianto ago
   1. Utilizzare un estrattore ago per tirare due aghi da ogni tubo di vetro borosilicato a parete sottile (1,0 mm di diametro esterno/ 0,78 millimetri ID / 100 mm di lunghezza) con le stesse impostazioni dei pipette microiniezione.
      NOTA: Le impostazioni di esempio per l'estrattore ago usato qui sono forniti nella Lista dei materiali. aghi trapianti non hanno un inserto in vetro, in quanto questo danneggia le cellule risucchiati l'ago.
   2. Tirare aghi in anticipo, conservare in una capsula di Petri e fissare premendo in una striscia di stucco modellabile o nastro adesivo.
   3. Prima del trapianto portare la punta dell'ago a fuoco in un microscopio da dissezione e utilizzare pinze per rompere l'ago sulla punta. Utilizzare una pinza sottile per regolare la forma dell'ago di puntare ad un flauto-forma (Figura 2G), o utilizzare metodi alternativi descritti per generare la forma della punta ^23.

5. Chimera Generation via Blastula Trapianti

1. installazione di trapianto
   NOTA: Qui, un apparato trapianto autoassemblato stato utilizzato (Figura 2A ).
   1. Montare l'ago trapianto stesso supporto dell'ago utilizzato per microiniezione sopra (montato su micromanipolatore passo 3.1.3) (Figura 2A).
   2. Scollegare il tubo iniezione che collega l'estremità del supporto micropipetta alla pressione regolata microinjector utilizzato per microiniezioni. Collegare il tubo di iniezione che è collegato ad una siringa da 1 ml (Figura 2A, B), che rappresenta l'impianto di perforazione trapianto.
      1. Assicurarsi che tutti i collegamenti siano ben sigillati con pellicola paraffina o stucco modellabile. Evitare che gli embrioni di venire a contatto con l'aria, garantendo che vi sia sempre un po 'di media E3 l'ago trapianto stesso. Azionare la siringa per aspirare manualmente cellule / liquido dentro e fuori l'ago trapianto.
2. allineamento degli embrioni
   1. Trasferire gli embrioni donatori con la pipetta di vetro nella prima colonna dello stampo agarosio. Trasferire gli embrioni di accoglienza in colonne 26 dello stampo agarosio (Figura 2F). Posizionare gli embrioni con la pipetta in modo che il lato blastomere rivolto verso l'alto.
3. Trapianto
   1. Appoggiare delicatamente l'ago trapianto su una cella blastomero di un embrione donatore e lentamente aspirare circa 20-50 cellule nell'ago trapianto (Figura 2H). Evitare di succhiare il tuorlo.
   2. Sollevare l'ago trapianto da donatore l'embrione utilizzando il micromanipolatore. Spostare il piatto stampo agarosio a sinistra e inserire la punta trapianto ago attraverso il lato della massa cellulare nel polo animale del primo embrione host. Deposito 5 - 10 celle vicine alla superficie secondo mappatura destino mostrando che questo settore genera il campo proencefalo / occhio ²⁴ (figura 2I). Tenere la punta dell'ago immerso nel medio E3 durante l'intera procedura.
4. Cura degli embrioni trapiantati
   1. Rimuovere il donatore embrioni unaND lasciare gli embrioni di accoglienza nello stampo agarosio per 1 - 2 ore a 28,5 ° C. Riempire di vetro o plastica (rivestito con il 2% di agarosio) capsule di Petri con terreno E3 contenente 0,003% N-feniltiourea (PTU) per prevenire la formazione di pigmento come questo possa interferire con l'imaging. Trasferire gli embrioni host in questi piatti con il fuoco lucido pipetta di vetro e incubare a 28,5 ° CO / N.
      ATTENZIONE: Indossare guanti durante la manipolazione PTU.

6. Setup dal vivo Imaging

NOTA: Le piccole dimensioni e la trasparenza ottica del pesce zebra in combinazione con un rapido sviluppo hanno permesso di diventare un modello vertebrato chiave per l'imaging in vivo di diverse cellule e organi. Imaging può essere eseguita su una varietà di microscopi, che differiscono per la configurazione e parametri. Quanto segue descrive un adeguato configurazione confocale per l'imaging dello sviluppo della retina ^{5, 8.}

1. embrione chimericoselezione
   1. A 24 - 26 HPF, schermo gli embrioni trapiantate sotto un ambito dissezione fluorescente per selezionare gli embrioni sani ben sviluppate che mostrano le cellule trapiantate donatore (H2A-GFP o H2B-RFP etichettati) in via di sviluppo primordio occhio.
   2. Mettere da parte fino a 40 embrioni per il montaggio pipettando in un nuovo piatto e aggiungere 0,4 mg / ml tricaine methanesulfate (MS222) per anestetizzare gli embrioni.
      ATTENZIONE: Indossare guanti durante la manipolazione MS222.
2. embrioni di montaggio
   NOTA: Utilizzare il piatto di montaggio appropriata, a seconda se l'imaging sarà eseguita su un invertito ⁸ o verticale microscopio (descritto qui).
   1. Preparare una qualche 1,5 tubi di plastica ml contenente 1 ml di 1% agarosio a bassa fusione in 0,4 mg / ml in terreno MS222 E3 e mantenere fuso in un bagno di acqua a 40 ° C.
   2. Aspirare 5 embrioni in un trasferimento pipetta di plastica e lasciare che gli embrioni si accumulano nella punta per gravità. Toccare la pipetta di trasferimentosulla superficie di uno dei tubi di plastica preparati contenenti 1% agarosio a bassa fusione e 0,4 mg / mL MS222 permettendo gli embrioni di affondare nel tubo limitando la quantità di trasferimento E3.
   3. embrioni Montare in un diametro di Petri 90 mm per l'imaging in microscopio in posizione verticale e con fondo di vetro Petri (di qualsiasi dimensione) per l'imaging in microscopio invertito. Utilizzare un pennarello indelebile per dividere visivamente sia piatto in due metà ai donatori immagine agli host WT (su un lato) o host morphant (altro lato) nello stesso esperimento.
   4. Trasferire i cinque embrioni dal tubo di plastica agarosio a uno Petri piatto con 0,5-1 ml di agarosio. Rimuovere l'eccesso di agarosio con una pipetta di trasferimento in modo che solo una piccola goccia (~ 200 - 300 pl) rimane. Se l'imaging con la microscopia in posizione verticale, evitare di mettere gli embrioni a 1 cm della circonferenza piastra di Petri. La lente immersione immersione in acqua utilizzata per l'imaging potrebbe non essere in grado di essere centrato in quella zona a causa della parete piatto Petri (Figura 3A </ Strong>).
   5. Utilizzare una pipetta microloading (con la punta spezzata) per allineare gli embrioni lateralmente fino a quando il solidifica agarosio. Per entrambi i tipi di piatti, gli embrioni vengono correttamente inclinate lateralmente se i due occhi ai lati della testa sono completamente sovrapposti (allineato nelle dimensioni XY) (Figura 3B). Per l'uso microscopio invertito, l'occhio vicino al vetrino deve essere spinto più vicino possibile al vetrino il più possibile, per consentire immagini attraverso lo z-dimensione entro i limiti dei possibili livelli di messa a fuoco.
   6. Continuare montaggio cinque embrioni alla volta in singole gocce agarosio. Utilizzare più 1% agarosio a bassa fusione aderire al agarosio scende tra loro e il lato del piatto per evitare sloggiare e movimento laterale durante l'imaging (Figura 3A).
   7. Una volta completamente solidificato, coprire il piatto con mezzo di E3 (contenente 0,003% PTU, 0,4 mg / ml MS222) preriscaldata a 28,5 ° C.
   8. Utilizzando lo stesso approccio descritto ai punti 6.2.2- 6.2.8, montaggio ~ 20 embrioni transgenici allevati a 32 ° C (punto 1.2.5) in un piatto a parte.
3. parametri di imaging
   NOTA: Imaging per analizzare l'insorgenza di transgeni fluorescenti non richiede alta risoluzione intracellulare spaziale. Può essere effettuata con un obiettivo W Plan-Apochromat 20X / 1.0 DIC M27 da 70 mm a 1.5 zoom.
   1. Impostare il tempo di potenza del laser e l'esposizione in base all'intensità del transgene per le ~ 20 embrioni transgenici con sviluppo accelerato (cioè sollevate a 32 ° C; passo 6.2.8).
      NOTA: Per studi di insorgenza di espressione del transgene, gli embrioni sperimentali mostrano fluorescenza al momento del time-lapse è configurato e quindi, questi embrioni accelerati sono cruciali per la determinazione dei parametri di imaging.
   2. Per il piatto sperimentale, visualizzare ogni embrione e salvare la posizione e mettere a fuoco i livelli degli embrioni.
      1. Scegli gli embrioni che hanno l'angolo di montaggio corretto (cioè con la s lateraliide dell'occhio il più orizzontale possibile) e un battito cardiaco forte (un indicatore della salute). Scegli embrioni con un paio di cellule del donatore trapiantato (identificate da H2A-GFP o l'etichettatura H2B-RFP) principalmente nel quadrante anteriore ventrale della retina di sviluppo (dove l'onda di espressione genica inizia) (Figura 3C).
         NOTA: in embrioni di zebrafish, la frequenza cardiaca media è di 120 - 180 battiti / minuto ^25. Negli embrioni anestetizzati, un battito cardiaco sano può essere nell'intervallo di 60 - 120 battiti / minuto. Più lento battito cardiaco può essere indicativo di una ridotta vitalità e quegli embrioni devono essere esclusi dallo studio.
   3. Impostare z-pile di sezioni ottiche a 2 micron intervalli attraverso la retina di un massimo di 15 embrioni.
      NOTA: Il numero totale di embrioni che possono essere esposte in un dato esperimento dipenderà singoli parametri (tempo di esposizione e dimensioni z-stack). Il tempo necessario per l'immagine 1 time-point per tutti gli embrioni scelti deve essere shOrter che l'intervallo tra punti di tempo. Sacrificando un po 'di risoluzione di profondità, più embrioni possono essere esposte entro gli intervalli di tempo. I limiti del z-stack sono scelti come estremi laterale e mediale dell'occhio embrioni montato e 30 micron viene aggiunta al laterale nella configurazione microscopio in posizione verticale, come gli occhi di embrioni in via di sviluppo in questo spostamento configurazione nella direzione z come gli embrioni si sviluppano durante la notte. Ciò si traduce in pile 100-170 micron di spessore (50 - 85 immagini / occhio).
   4. Prendere immagini ogni 24 min a 32 ° C (equivalente a 0,5 HPF intervalli) utilizzando l'apposito laser / canale per il transgene.
      NOTA: Gli embrioni rimangono sul palco per tutto il time-lapse all'interno di una camera riscaldata comprende l'intero microscopio. L'esperimento può essere condotta a 28 ° C, temperature più calde sono utilizzati per accelerare lo sviluppo e garantire che i relativi punti temporali nell'esperimento vengono esposte nel 16 - periodo di time-lapse 24 h.
   5. Immaginecanali che rappresenta l'etichetta del donatore (H2A-GFP o H2B-RFP - opzionale) e transgene (Atoh7: RFP o Vsx1: GFP) utilizzando la scansione sequenziale. Per l'analisi, utilizzare l'etichetta donatore solo scegliere embrioni appropriate descritte (prendere uno z-stack all'inizio della formazione immagine) e quindi eseguire time-lapse solo sul canale per catturare l'espressione del transgene.
      NOTA: In alternativa, utilizzare l'etichetta donatore solo per selezionare gli embrioni appropriati (cioè quelli con le cellule confermati trapiantate in anteriore quadranti ventrale) e l'immagine solo il canale transgene, all'incirca dimezzando il tempo di imaging e quasi raddoppiando il numero di embrioni che possono essere esposte e analizzate per esperimento (Figura 4).

Risultati

Questo lavoro presenta un protocollo sperimentale per valutare i cambiamenti nel gene tempistica espressione quando wild type progenitori della retina si sviluppano all'interno di un embrione di accoglienza morphant. Gli embrioni di accoglienza sperimentali sono morphants PTF1A, cui mancano le interneuroni orizzontali e amacrine nati intermedi della retina ^{7, 26.} Questi sono stati confrontati per controllare embrioni host, ch...

Discussione

Capire la misura in cui le cellule vicine influenzano tempistica di espressione di fattori determinanti cruciali destino delle cellule è fondamentale quando si mira ad istruire efficacemente le cellule staminali multipotenti embrionali o indotte a differenziarsi in un tipo di cellula post-mitotico specifiche o addirittura tessuti a motivi geometrici. Inoltre, l'esame di questi eventi molecolari nelle cellule in via di sviluppo animale vivente fornisce inoltre dinamiche relative informazioni (temporale e spaziale) s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bioline	BIO-41025	Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4 °C
Agarose low melt	Sigma	A9414-100G	Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molten in a 40 °C water-bath. 1 mL aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).
borosillicate glass capillary tube w/o filament	SDR Scientfic	30-0035	alternatives with similar diameter can be used
borosillicate glass capillary tube with filament	SDR Scientfic	30-0038	alternatives with similar diameter can be used
glass petri dishes (60 mm diameter)	Science Supply	1070506	any glass alternative of any size
Injection tube (2 m)	Eppendorf	524616004	This connects the needle holder to the syringe during transplantation
Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)	Adaptive Science Tools	PT-1	alternatives with similar shape can be use
microneedle holder	Narishige	M-152	any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used
microinjector	Narishige or Eppendorf Femtojet		Pneumatic injector using gas pressure
micromanipulator	Coherent Scientific	M330IR	similar alternatives can be used
microloader tip	Eppendorf	5242956003
Mineral oil	Sigma	M5904-500ML
needle puller	Sutter Instruments	Model P-2000	Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension
Parafilm	Interpath	PM996	any paraffin film
Pasteur pipette plastic	Samco Scientific	202
Pasteur pipette glass	Hirschmann Laborgeraete	9260101
Pronase	Sigma	P5942-25MG	Protease Type XIV
N-phenyl thiourea	Sigma	P7629-25G	PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase/use.
Qiaquick gel extraction	Qiagen	28704	any alternatives to purify DNA can be used
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104	any alternatives to purify RNA can be used
SP6 mMessage kit	Qiagen	AM1340	any alternatives to transcribe DNA using SP6