استخراج وتنقية البوليفينول من تجميد المجفف بيري مسحوق لعلاج خلايا العضلات السلس الأوعية الدموية<em&gt; في المختبر</em

Summary

هذا العمل تفاصيل طريقة خطوة بخطوة لإعداد مقتطفات الغنية بالبوليفينول من مسحوق التوت المجففة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يوفر وصفا دقيقا لكيفية استخدام هذه المستخلصات الغنية بوليفينول في ثقافة الخلية في وجود هرمون الببتيد أنجيوتنسين الثاني (أنغ الثاني) باستخدام خلايا العضلات السلس الأوعية الدموية (فسمكس).

Abstract

وتشير الدراسات الوبائية إلى أن زيادة تناول الفلافونويد يرتبط بانخفاض معدل الوفيات بسبب أمراض القلب والأوعية الدموية في الولايات المتحدة (الولايات المتحدة) وأوروبا. وتستهلك التوت على نطاق واسع في الولايات المتحدة ولديها محتوى بوليفينوليكي عالي. وقد تبين أن البوليفينول تتفاعل مع العديد من الأهداف الجزيئية وممارسة العديد من الوظائف البيولوجية الإيجابية، بما في ذلك الآثار المضادة للأكسدة، المضادة للالتهابات، والقلبية. البوليفينول معزولة من بلاك بيري (بل)، التوت (رب)، التوت الأسود (برب) تقليل الإجهاد التأكسدي والشيخوخة الخلوية ردا على أنجيوتنسين الثاني (أنغ الثاني). يوفر هذا العمل وصفا تفصيليا للبروتوكول المستخدم لإعداد مقتطفات البوليفينول من التوت المجففة التجميد. وقد أجريت الاستخلاصات من البوليفينول من مسحوق التوت المجففة باستخدام 80٪ من الإيثانول المائي وطريقة الاستخلاص بمساعدة الموجات فوق الصوتية. كما تم تنقية المستخلص الخام وتجزئته باستخدام الكلوروفورم وأسيتات الإيثيل،على التوالي. تم اختبار آثار كل من المستخلصات الخام والمنقى على خلايا العضلات السلسية الوعائية (فسمكس) في الثقافة.

Introduction

البوليفينول هي مركبات تحتوي على حلقة الفينول واحدة على الأقل في هيكلها وهي موجودة بوفرة في المملكة النباتية ¹ . وقد استهلك البشر النباتات لآلاف السنين لأغراض طبية دون أن يكون على بينة من وجود مثل هذه المركبات ² . العديد من الفواكه والخضروات لديها بعض المركبات بوليفينوليك المشتركة، وإن كان بكميات مختلفة، بما في ذلك الفلافونويد، ستيلبينس، والأحماض الفينولية ³ . على الرغم من أن البوليفينول غالبا ما ترتبط مع الفواكه والخضروات الملونة، وهذا ليس صحيحا تماما. على سبيل المثال، زياكسانثين و زانثين موجودة في الخضروات التي ليست ملونة للغاية، مثل البصل والثوم، والتي هي من عائلة البصل الأخضر وترتبط مع العديد من الفوائد الصحية ⁴ . وبصرف النظر عن كونها مرتبطة مع العديد من الفوائد الصحية ⁵ ، البوليفينول أيضا خدمة النباتات من خلال حمايتهم من الحشرات أد الأشعة فوق البنفسجية ² . بوليفينول عادة ما توجد في النظام الغذائي البشري وتعتبر مضادات الأكسدة القوية، لأنها يمكن أن تكشف أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) ^{6 ، 7 ، 8} . لديهم أيضا المضادة للالتهابات ⁹ ، مضادات الميكروبات ¹⁰ ، ومكافحة ارتفاع ضغط الدم ¹¹ ، ومضادة للسرطان ^{12 ، 13} خصائص.

وتظهر الدراسات الوبائية وجود علاقة عكسية بين استهلاك الفلافونويد وأمراض القلب والأوعية الدموية (الأمراض القلبية الوعائية) حدوث ^{16 و 17} والوفيات ^{14 ، 15} . وتستهلك التوت على نطاق واسع في الولايات المتحدة ولديها كميات عالية من البوليفينول، بما في ذلك الفلافونويدات. على سبيل المثال، استهلاك بلاك بيري (بل) عصير (300 مل / د) لمدة ثمانية أسابيع انخفاض كبير في ضغط الدم الانقباضي في مرضى دسليبيدميك ¹⁸ . جيونغ وآخرون. ¹⁹ أن الرجال والنساء قبل ارتفاع ضغط الدم تستهلك 2.5 غرام من التوت الأسود (برب) استخراج يوميا كان أقل 24 ساعة وضغط الدم ليلا مقارنة مع أولئك الذين يتناولون الدواء الوهمي. التوت (رب) انخفاض ضغط الدم مع زيادة التعبير عن ديسموتاز الفائق (سود) في الفئران ارتفاع ضغط الدم بشكل عفوي ²⁰ . وقد تبين مؤخرا أن بل، رب، و برب تقلل من مستويات روس و الشيخوخة الناجمة عن أنجيوتنسين الثاني (أنغ الثاني) في خلايا العضلات السلس الأوعية الدموية (فسمكس) ²¹ . وبالإضافة إلى ذلك، فإن جزء الأنثوسيانين من مستخلص بل يقلل من التعبير عن محفز سينتاز أكسيد النيتريك (إينوس)، وحول دون نشاط العامل النووي كابا B (نف-κB) و كيناز الذي ينظم إشارة إشارة (إرك) في عديد السكاريد الشحمي (لس) J774 الخلاياأس = "كريف"> 22. استخراج برب انخفض تفعيل نف-κB والأكسدة الحلقية 2 (كوكس-2) التعبير في المختبر ²³ ، وتحسين الشخصية الدهون، ومنع تشكيل تصلب الشرايين في الفئران تغذية نظام غذائي عالي الدهون ²⁴ . الأنثوسيانين، التي تعتبر الفلافونويدات الأكثر وفرة في التوت، وتعديل الاستجابة الالتهابية في لس-راو 264.7 الضامة عن طريق خفض إنتاج الورم نخر عامل ألفا (تنف-α) ²⁵ والحد من انتشار وهجرة فسمكس ²⁶ .

وبما أن هناك اهتماما متزايدا بفهم دور البوليفينول في صحة الإنسان والمرض، فمن المهم لتحسين طريقة الاستخراج. ويستخدم على نطاق واسع استخراج المذيبات لهذا الغرض، لأنها فعالة من حيث التكلفة وسهولة استنساخه. في هذه الدراسة، تم استخدام استخراج المذيبات مع الإيثانول، جنبا إلى جنب مع الاستخراج بمساعدة الموجات فوق الصوتيةn، الذي تم تكييفه من كيم و لي ²⁷ . تم إجراء تنقية وتجزئة المستخلصات الخام باستخدام الكلوروفورم وأسيتات الإيثيل للحصول على جزء المستخلص المنقى (بي) الذي تم تعديله من كيويرز وآخرون ²⁸ . وعلاوة على ذلك، تمت مقارنة فعالية مستخلصات البوليفينول الخام مقابل المنقى من بل في الحد من الفسفرة القاعدية ل ERK1 / 2، وتم تقديم أمثلة تمثيلية للتأثير المثبط لمستخلص بوليفينول بل المنقى على أنغ-إنغوسد سيغنالينغ ديسكونتس في فسمكس.

Protocol

1. إعداد الكواشف

1. إعداد 80٪ من الإيثانول (100 مل) عن طريق خلط 80 مل من الإيثانول المطلق (الجزيئية البيولوجيا الصف) و 20 مل من الخلايا الصفية المياه الصف العقيمة.
2. لإعداد بوليفينول استخراج (10 ملغ / مل)، تزن 10 ملغ من سي أو بي. إضافة 1 مل من دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) تحت غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية. دوامة الحل. قسامة في أجزاء 200 ميكرولتر وتخزينها في -20 درجة مئوية.
3. إعداد تحلل العازلة.
   1. إضافة 5 مل من 1 M الحل هيبيس الأسهم (درجة الحموضة 7.4؛ 50 ملم النهائي)، 1 مل من 5 M محلول الأسهم كلوريد الصوديوم (50 ملم النهائي)، 1 مل من 0.5 M إدتا حل الأسهم (5 ملم النهائي)، 2 مل من 0.5 M حل محلول ناف (10 ملم النهائي)، 286 ميكرولتر من 700 ملي نا ₃ فو ₄ محلول المخزون (2 ملم النهائي)، 5 مل من 200 ملي نا ₄ P ₂ O ₇ حل المخزون (10 ملم النهائي)، و 5 مل من 20٪ تريتون-X-100 حل المخزون أعد في الماء (1٪ النهائي). إضافة الماء للوصول إلى حجم 100 مل. إبقاء في 4 درجات مئوية.
   إضافة 10 ميكرولتر / مل من البروتيني مثبط كوكتيل. إضافة جديدة عندما تكون الخلايا جاهزة للتحلل.
4. إعداد ليملي عينة العازلة (4X).
   1. إضافة 31.25 مل من 2 M تريس حل المخزون (الرقم الهيدروجيني 6.8)، 100 مل من الجلسرين، 50 مل من 20٪ محلول دوديسيل الصوديوم (سدز) المحضرة في الماء، و 50 مل من β ميركابتوثانول. يضاف الماء حتى 250 مل. إبقاء في 4 درجات مئوية.
5. لإعداد تريس مخزنة المالحة العازلة (تبس)، تزن 3 غرام من تريس (25 ملم النهائي)، 0.18 غرام من بوكل (2.5 ملم النهائي)، و 8.76 غرام من كلوريد الصوديوم (150 ملم النهائي). ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 وإضافة الماء يصل إلى 1 L. حافظ على رت.
6. لإعداد تبس-T، إضافة 997.5 مل من تبس و 2.5 مل من 20٪ تريتون-X-100 محلول أعد في الماء. إبقاء في رت.

2. إعداد بلاكري مقتطفات

1. إعداد مستخرج الخام من مسحوق التوت المجففة.
   1. تزن 10 غرام من مسحوق التوت المجفف التجميد (أو 5 غرام من مسحوق طازج). إذا تم استخدام الفاكهة المجمدة، وقطع عليه طنتو قطع صغيرة جدا قبل البدء في استخراج.
   2. مزيج مسحوق الفواكه مع 100 مل من 80٪ من الإيثانول المائي في 1 لتر جولة القاع إرلنماير قارورة.
   3. يصوتن الخليط لمدة 20 دقيقة في 42 كيلوهرتز، 135 W باستخدام حمام بالموجات فوق الصوتية في 25 درجة مئوية، دون أي فاصل زمني بينهما. أداء سونيكاتيون مع تطهير النيتروجين المستمر في ضوء مهزوما. للفاكهة المجمدة، وزيادة الوقت الحضانة إلى 4 ساعات.
   4. تصفية الخليط من خلال ورقة فلتر # 2 باستخدام قمع بوخنر المبردة مع شفط فراغ.
      ملاحظة: في نهاية هذه الخطوة، تظهر بقايا العينة على ورق الترشيح؛ وهذا ما يسمى كعكة التصفية.
   5. شطف كعكة مرشح مع 50 مل من الإيثانول بنسبة 100٪. حفظ الترشيح وإضافة كعكة مرشح إلى 1 L جولة القاع قارورة تحتوي على 100 مل من 80٪ من الإيثانول المائي.
   6. كرر عملية استخراج لبقايا (الخطوات 2.1.2 - 2.1.4).
   7. الجمع بين اثنين من الفلترات في قارورة جولة القاع مع 50 مل إضافيةمن 80٪ من الإيثانول المائي.
      ملاحظة: يجب أن يكون حجم النهائي حوالي 300 مل.
   8. استخدام المبخر الدوار في 62 درجة مئوية و 50 دورة في الدقيقة لتبخير المذيبات. مواصلة هذه العملية حتى الإيثانول لا تتبخر بعد الآن.
      ملاحظة: تستغرق هذه العملية حوالي 45 دقيقة.
   9. نقل العينة إلى أنبوب مخروطي 50 مل. تتبخر الإيثانول عن طريق حقن غاز النيتروجين في الجزء العلوي من أنبوب لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى هذه الخطوة لضمان التبخر الكامل للإيثانول. حجم العينة في هذه الخطوة حوالي 20 مل.
   10. تجميد العينة في -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل.
       ملاحظة: هناك حاجة إلى هذه الخطوة للسماح لعملية تجميد التجفيف أكثر كفاءة.
   11. تجميد الجافة العينة في -50 درجة مئوية لمدة 8 ساعات تقريبا. تخزين العينات في -20 درجة مئوية.
       ملاحظة: مجفف تجميد يخلق فراغ قوية في -50 درجة مئوية داخل الغرفة لتجفيف العينات ولكن يحافظ على معظم المركبات، مثل بوليفNOLS.
2. إعداد مقتطفات البوليفينول المنقى من المستخلصات الخام.
   1. وزن العينات المجففة تجميد المجففة.
      ملاحظة: حجم استخراج في هذه الخطوة حوالي 10 مل.
   2. إضافة مجلدين (~ 20 مل) من الكلوروفورم إلى استخراج الخام ويهز الحل لمدة 5 دقائق في لوحة ضجة.
   3. صب الخليط في قمع فصل. السماح استخراج الخام صب لمدة 1 ساعة في رت للحصول على جزء المنقى.
      ملاحظة: في هذه الخطوة، سوف تشكل خليط مرحلتين.
   4. تجاهل الطبقة السفلى (مرحلة الكلوروفورم) من قمع فصل وجمع الطبقة المائية في دورق نظيفة.
   5. إضافة مجلدين من خلات الإيثيل إلى جزء مائي واستخدام شريط ضجة مغناطيسي لتحريك الخليط لمدة 5 دقائق في رت.
   6. تصفية الخليط من خلال ورقة فلتر # 2 باستخدام قمع بوخنر المبردة مع شفط فراغ.
   7. جمع العينة التي تمت تصفيتها ونقلها إلى قارورة جولة القاع ليكون لناإد مع المبخر الدوار.
   8. تعيين المبخر الدوار إلى 62 درجة مئوية و 50 دورة في الدقيقة وتبخر خلات الإيثيل لمدة 30 دقيقة.
   9. تجميد الجافة العينة في -50 درجة مئوية لمدة 8 ساعات تقريبا. نقل العينة إلى أنبوب مخروطي 50 مل وتخزينه في -20 درجة مئوية.

3. علاج فسمكس مع مقتطفات التوت

1. ثقافة فسمكس.
   1. عزل فسمكس من أورتاس الصدري من الفئران سبراغ داولي من خلال أداء الهضم الأنزيمي، كما هو موضح سابقا ²⁹ . ثقافة فسمكس كما هو موضح ²⁹ .
   2. إعداد وسيطة كاملة لثقافة فسمكس باستخدام دمم تحتوي على 1 غرام / لتر الجلوكوز وتستكمل مع 10٪ مصل جنين البقري (فبس)، 100 / مل البنسلين، 100 ملغ / مل الستربتومايسين، و 2 ملي الجلوتامين. تخزين المتوسطة كاملة في 4 درجات مئوية.
2. حضانة فسمكس مع مقتطفات البوليفينول.
   1. لتقسيم فسمكس، تجاهل كولتوإعادة المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة (بس). إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني و 2 مل من التربسين إدتا 0.25٪. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة كو ₂ .
      1. جمع الخلايا، ومزجها مع 2 مل من المتوسطة كاملة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل، وأجهزة الطرد المركزي في 1،100 × ز لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف و ريسوسبيند بيليه الخلية مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
      2. البذور 50،000 فسمكس لكل بئر في لوحات ثقافة 6 جيدا وتنمو في وسط كامل يحتوي على 10٪ فبس حتى تصل إلى 90٪ كونفلنسي (حوالي 3 د). الحفاظ على فسمكس عند 37 درجة مئوية في مرطب 5٪ كو ₂ حاضنة.
   2. إعداد وسيلة للعلاج باستخدام دمم المتوسطة التي تحتوي على 1 غ / L الجلوكوز، 100 / مل البنسلين، 100 ملغ / مل الستربتومايسين، 2 ملي L- الجلوتامين، و 0.5٪ فبس. تخزين وسط العلاج في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يتم إضافة مقتطفات البوليفينول و أنغ الثاني مباشرة إلى الخلايا باستخدام هذا ليdium.
   3. إعداد محلول المخزون من 10 ملغ / مل استخراج الخام (سي) أو مستخلص منقح (بي) من البوليفينول عن طريق إذابة 10 ملغ من استخراج في 1 مل من وسط دمم المتوسطة. الحفاظ على المخزون في 200 قسامة ميكرولتر في -20 درجة مئوية.
   4. احتضان فسمكس مع 2 مل من العلاج المتوسطة تحتوي على 0.5٪ فبس وإضافة إما سي أو بي مقتطفات لتحقيق تركيز 50 - 500 ميكروغرام / مل. تغيير المتوسطة كل 24 ساعة عن طريق إضافة مقتطفات بوليفينول جديدة. علاج الخلايا لمدة 3 د.
   5. للعلاج مع أنغ الثاني أو غيرها من الهرمونات وعوامل النمو، تجويع الخلايا لمدة لا تقل عن 24 ساعة عن طريق احتضان الخلايا مع العلاج المتوسطة التي تحتوي على 0.5٪ فبس قبل إضافة أنغ الثاني (100 نانومتر).
      ملاحظة: الحضانة مع وبدون سي و بي في 0.5٪ فبس المتوسطة العلاج قبل إضافة أنغ الثاني يوصى.
      1. بعد 24 ساعة من المجاعة، إضافة 100 نانومتر أنغ الثاني. استبدال وسط العلاج مع الطازجة سي، بي، أو أنغ الثاني كل 24 ساعة لمدة 3 د.
3. إعداد عينات الخلايا.
   1. غسل الخلايا المعالجة مرتين في برنامج تلفزيوني الباردة ويز لهم مع 200 ميكرولتر من العازلة تحلل على الجليد.
   2. جمع ليسيتس الخلية باستخدام كاشطات الخلايا ونقل ليزيتس إلى 1.5 مل أنابيب ميكروسنتريفوج. احتضان ليسيتس خلية الكلي لمدة 20 دقيقة على الجليد والدوامة كل 5 دقائق.
   3. يصوتن مقتطفات الخلية مع ثلاث رشقات نارية في 125 W لمدة 10 ثانية لكل منهما، مع 2 ثانية وقفة بينهما. إبقاء العينات على الجليد في جميع أنحاء سونيكاتيون.
   4. قياس تركيز البروتين باستخدام كاشف فحص البروتين في 595 نانومتر.
   5. تخزين العينات في -20 درجة مئوية لتحليل من قبل لطخة غربية.
4. لطخة غربية.
   1. مزيج كميات متساوية من البروتين (حوالي 50 ميكروغرام) من السيطرة غير المعالجة والبوليفينول المعالجة أو أنغ العينات المعالجة الثاني مع العازلة تحلل للحصول على الحد الأقصى لحجم الكلي من 50 ميكرولتر. إضافة 16 ميكرولتر من العازلة عينة ليملي 4x. تسخين العينات لمدة 5 دقائق في 75 درجة مئوية.
   2. افصل العينةإس في 10٪ المواد الهلامية سدز-بادج ونقلها إلى أغشية بدفف في 10 V لمدة 75 دقيقة في نظام نقل شبه الجافة لتحليل وصمة عار الغربية مع الأجسام المضادة المحددة.
   3. منع الغشاء مع الحليب 2٪ في تبس 0.05٪ تريتون-X100 العازلة (تبس-T) لمدة 20 دقيقة.
   4. إزالة الحليب عن طريق غسل الغشاء ثلاث مرات على الأقل مع تبس (5 دقائق لكل منهما) واحتضان مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 1 ساعة في رت أو O / N عند 4 درجات مئوية.
   5. غسل الغشاء ثلاث مرات، 10 دقيقة لكل منهما، مع تبس-T واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة هرب لمدة 45 دقيقة.
   6. غسل الغشاء ثلاث مرات، 10 دقيقة لكل منهما، مع تبس-T وتطوير من خلال التوهج المعزز (إكل).

النتائج

وقد ثبت سابقا أن مقتطفات البوليفينول معزولة من بل، رب، و برب خفضت شيخوخة فسمكس ردا على أنغ الثاني ²¹ . وقد تبين أن هذه المستخلصات البوليفينول المنقى تعديل أنغ الثاني يشير عن طريق الحد من الفسفرة من أكت، P38 ميتوجين المنشط كيناس البروتين (م?...

Discussion

يحتوي البوليفينول المعزول من التوت على تركيبات متميزة. بروتوكول الاستخلاص القائم على الإيثانول وصف هنا يسمح لتحديد مستويات مختلفة من الأحماض الفينولية والفلافونويد الموجودة في مستخلصات البوليفينول الخام وتنقيته من بل ( الجدول 1 ). تم إثراء سي في حمض الغالي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiotensin II	Sigma-Aldrich, Inc.	A9525-10MG	Treatment of VSMCs
β-actin	Sigma-Aldrich, Inc.	A2228	Primary antibody (1:5000)
Blackberry fruit	Mercer Foods		Freeze-dried blackberry powder
Catalase	Calbiochem	219010	Primary antibody (1:1000)
Chloroform	Biotech Grd, Inc.	97064-678	Preparation of purified polyphenol extracts
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM )	Mediatech, Inc.	10-014-CV	Culture of VSMCs
Ethanol (absolute molecular biology grade)	Sigma-Aldrich, Inc.	E7023-500ML	Preparation of polyphenol extracts
Ethylacetate	Sigma-Aldrich, Inc.	439169	Preparation of purified polyphenol extracts
ERK1/2	Cell Signaling Technology, Inc.	9102S	Primary antibody (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0	Teknova, Inc.	E0306	Lysis buffer
Freeze-Dryer	Labconco	VirTis Benchtop K	Preparation of polyphenol extracts
Fetal Bovine Serum (FBS)	Seradigm	1400-500	Cell culture
HEPES	Sigma-Aldrich, Inc.	H3375	Lysis buffer
NaCl	EMD Millipore, Inc.	7760	Lysis buffer
NaF	J.T.Baker, Inc.	3688-01	Lysis buffer
Na3VO4	Sigma-Aldrich, Inc.	450243	Lysis buffer
Na4P2O7 , decahydrate	Sigma-Aldrich, Inc.	S-9515	Lysis buffer
phospho ERK1/2	Cell Signaling Technology, Inc.	9101S	Primary antibody (1:1000)
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich, Inc.	P8340-5ml	Lysis buffer
Protein assay dye reagent	Bio-Rad Laboratories, Inc.	500-0006	Protein concentration Measurement
PVDF transfer membrane	Thermo Scientific, Inc.	88518	Western blots
Rotatory Evaporator	Buchi Labortechnik	Rotavapor R3000	Preparation of polyphenol extracts
Sterile water	Mediatech, Inc.	25-055-CV	Preparation of polyphenol extracts
Sonicator	QSonica, LLC	Q125	Preparation of cell extracts
SOD2	Enzo Life Sciences, Inc.	ADI-SOD-110-F	Primary antibody (1:1000)
Triton-X-100	Sigma-Aldrich, Inc.	X100	Western blots
Whatman #2 filter paper	GE Healthcare, Inc.	28317-241	Preparation of polyphenol extracts