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  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce travail détaille une méthode étape par étape pour préparer des extraits riches en polyphénols à partir de poudres de baies lyophilisées. En outre, il fournit une description détaillée de la façon d'utiliser ces extraits riches en polyphénols dans la culture cellulaire en présence de l'hormone peptidique angiotensine II (Ang II) à l'aide de cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC).

Résumé

Des études épidémiologiques indiquent que l'augmentation de la consommation de flavonoïdes est en corrélation avec la diminution de la mortalité due aux maladies cardiovasculaires (ECV) aux États-Unis (États-Unis) et en Europe. Les baies sont largement consommés aux États-Unis et ont un contenu polyphénolique élevé. On a montré que les polyphénols interagissent avec de nombreuses cibles moléculaires et exercent de nombreuses fonctions biologiques positives, y compris les effets antioxydants, anti-inflammatoires et cardioprotecteurs. Les polyphénols isolés de la mûre (BL), de la framboise (RB) et de la framboise noire (BRB) réduisent le stress oxydatif et la sénescence cellulaire en réponse à l'angiotensine II (Ang II). Ce travail fournit une description détaillée du protocole utilisé pour préparer les extraits de polyphénols à partir de baies lyophilisées. Les extractions de polyphénols à partir de poudre de baies lyophilisées ont été réalisées en utilisant de l'éthanol aqueux à 80% et un procédé d'extraction assisté par ultrasons. L'extrait brut a été encore purifié et fractionné en utilisant du chloroforme et de l'acétate d'éthyle,respectivement. Les effets des extraits bruts et purifiés ont été testés sur des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) en culture.

Introduction

Les polyphénols sont des composés contenant au moins un anneau phénolique dans leur structure et sont abondamment présents dans le règne végétal 1 . Les humains ont consommé des plantes pendant des millénaires à des fins médicales sans connaître l'existence de tels composés 2 . Beaucoup de fruits et légumes ont des composés polyphénoliques partagés, bien qu'avec des quantités différentes, y compris les flavonoïdes, les stilbènes et les acides phénoliques 3 . Bien que les polyphénols soient souvent associés à des fruits et légumes colorés, cela n'est pas strictement vrai. Par exemple, la zéaxanthine et la xanthine sont présentes dans les légumes qui ne sont pas très colorés, comme les oignons et l'ail, qui proviennent de la famille des écrevisses et sont associés à de nombreux avantages pour la santé 4 . En plus d'être associé à plusieurs avantages pour la santé 5 , les polyphénols servent également les plantes en les protégeant des insectes etD rayonnement ultraviolet 2 . Les polyphénols sont couramment présents dans l'alimentation humaine et sont considérés comme des antioxydants puissants, car ils peuvent éliminer les espèces d'oxygène réactif (ROS) 6 , 7 , 8 . Ils ont également des propriétés anti-inflammatoires 9 , antimicrobiennes 10 , anti-hypertensives 11 et anti-cancérogènes 12 , 13 .

Les études épidémiologiques démontrent une association inverse entre la consommation de flavonoïdes et l'incidence des maladies cardiovasculaires (MCV) 16 , 17 et la mortalité 14 , 15 . Les baies sont largement consommés aux États-Unis et ont une grande quantité de polyphénols, y compris les flavonoïdes. Par exemple, la consommation de jus de mûre (BL) (300 ML / d) pendant huit semaines a diminué de manière significative la tension artérielle systolique chez les patients dyslipidémiques 18 . Jeong et al. 19 ont rapporté que les hommes et les femmes pré-hypertendus consommant 2,5 g d'extrait de framboise noire (BRB) par jour avaient une pression artérielle inférieure de 24 h et une nuit par rapport à ceux qui consommaient un placebo. Les framboises (RB) ont diminué la tension artérielle tout en augmentant l'expression de la superoxyde dismutase (SOD) chez les rats spontanément hypertendus 20 . Il a récemment été démontré que BL, RB et BRB réduisent les niveaux de ROS et de sénescence induite par l'angiotensine II (Ang II) dans les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) 21 . De plus, la fraction anthocyanique de l'extrait BL a réduit l'expression de l'oxyde nitrique synthase inducible (iNOS) et a inhibé l'activité du facteur nucléaire kappa B (NF-kB) et de la kinase extracellulaire régulée par le signal (ERK) dans le lipopolysaccharide (LPS) - stimulée Cellules J774Ass = "xref"> 22. Les extraits de BRB ont diminué l'activation NF-κB et l'expression de la cyclooxygénase 2 (COX-2) in vitro 23 , amélioré le profil lipidique et empêché la formation de la lésion de l'athérosclérose chez des souris nourries avec un régime riche en matières grasses 24 . Les anthocyanines, qui sont considérées comme les flavonoïdes les plus abondants dans les baies, modulent la réponse inflammatoire dans les macrophages RAW 264.7 stimulés par le LPS en diminuant la production de facteur 25 de nécrose tumorale (TNF-α) 25 et en diminuant la prolifération et la migration des VSMC 26 .

Étant donné qu'il y a eu un intérêt grandissant à comprendre le rôle des polyphénols dans la santé humaine et les maladies, il est important d'optimiser la méthode d'extraction. L'extraction par solvants est largement utilisée à cette fin, car elle est rentable et facilement reproductible. Dans cette étude, une extraction par solvant a été utilisée avec de l'éthanol, avec une extraction assistée par ultrasonsN méthode, qui a été adaptée de Kim et Lee 27 . La purification et le fractionnement des extraits bruts (CE) à l'aide de chloroforme et d'acétate d'éthyle ont été réalisés pour obtenir la fraction d'extrait purifié (PE) adaptée de Queires et al 28 . En outre, on a comparé l'efficacité des extraits de polyphénols bruts versus purifiés de BL pour réduire la phosphorylation basale de ERK1 / 2 et des exemples représentatifs de l'effet inhibiteur de l'extrait de polyphénol BL purifié sur les réductions de signalisation induites par Ang II dans les VSMC ont été fournis.

Protocole

1. Préparation des réactifs

  1. Préparez 80% d'éthanol (100 mL) en mélangeant 80 mL d'éthanol absolu (biologie moléculaire) et 20 mL d'eau stérile de culture cellulaire.
  2. Pour préparer l'extrait de polyphénol (10 mg / mL), pesez 10 mg de CE ou de PE. Ajouter 1 ml de milieu d'Eagle modifié Modifié Dulbecco (DMEM) sous un capot de culture cellulaire. Vortex la solution. Aliquote dans des portions de 200 μL et stockez à -20 ° C.
  3. Préparer le tampon de lyse.
    1. Ajouter 5 ml d'une solution mère HEPES 1 M (pH 7,4, finale 50 mM), 1 ml d'une solution mère NaCl 5 M (finale 50 mM), 1 ml d'une solution mère EDT 0,5 M (finale 5 mM), 2 ml de 0,5 M NaF stock solution (10 mM finale), 286 μL de solution mère de Na 3 VO 4 700 mM (2 mM de finale), 5 ml d'une solution mère de Na4P2O7 200 mM (10 mM de finale) et 5 ml de 20% de solution mère Triton-X-100 préparée dans l'eau (1% finale). Ajouter de l'eau pour atteindre un volume de 100 ml. Conserver à 4 ° C.
    2. Ajoutez 10 μL / mL de cocktail inhibiteur de protéase. Ajouter frais lorsque les cellules sont prêtes pour la lyse.
  4. Préparer le tampon d'échantillon de Laemmli (4x).
    1. Ajouter 31,25 ml de solution mère Tris 2 M (pH 6,8), 100 ml de glycerol, 50 ml d'une solution à 20% de sulfate de sodium et de sodium (SDS) préparée dans de l'eau et 50 ml de β-mercaptoéthanol. Ajouter de l'eau jusqu'à 250 ml. Conserver à 4 ° C.
  5. Pour préparer un tampon salin tamponné au Tris (TBS), pesez 3 g de Tris (25 mM final), 0,18 g de KCl (2,5 mM finale) et 8,76 g de NaCl (150 mM finale). Réglez le pH à 7,4 et ajoutez de l'eau jusqu'à 1 L. Conserver à la température ambiante.
  6. Pour préparer TBS-T, ajouter 997,5 ml de TBS et 2,5 ml d'une solution à 20% de Triton-X-100 préparée dans de l'eau. Garder à la RT.

2. Préparation des extraits de Blackerry

  1. Préparation de l'extrait brut de la poudre de baies lyophilisée.
    1. Peser 10 g de poudre de mûre lyophilisée (ou 5 g de poudre fraîche). Si des fruits surgelés sont utilisés, coupez-leÀ de très petits morceaux avant de commencer l'extraction.
    2. Mélangez la poudre de fruit avec 100 ml d'éthanol aqueux à 80% dans une fiole Erlenmeyer à fond rond de 1 L.
    3. Sonicate le mélange pendant 20 min à 42 kHz, 135 W en utilisant un bain à ultrasons à 25 ° C, sans intervalle de temps entre les deux. Effectuez la sonication avec une purge continue d'azote en lumière modérée. Pour les fruits surgelés, augmenter le temps d'incubation à 4 h.
    4. Filtrer le mélange à travers un papier filtrant n ° 2 à l'aide d'un entonnoir Buchner refroidi avec aspiration sous vide.
      REMARQUE: à la fin de cette étape, les résidus de l'échantillon apparaissent sur le papier filtre; C'est ce qu'on appelle le gâteau de filtre.
    5. Rincer le gâteau de filtration avec 50 ml d'éthanol à 100%. Enregistrer le filtrat et ajouter le gâteau de filtre dans un ballon à fond rond de 1 L contenant 100 ml d'éthanol aqueux à 80%.
    6. Répétez le processus d'extraction du résidu (étapes 2.1.2 - 2.1.4).
    7. Mélanger les deux filtrats dans un ballon à fond rond avec 50 ml supplémentairesD'éthanol aqueux à 80%.
      REMARQUE: Le volume final devrait être d'environ 300 mL.
    8. Utilisez un évaporateur rotatif à 62 ° C et 50 tr / min pour évaporer le solvant. Continuez ce processus jusqu'à ce que l'éthanol ne s'évapore plus.
      REMARQUE: ce processus dure environ 45 minutes.
    9. Transférer l'échantillon dans un tube conique de 50 ml. Evaporer l'éthanol en injectant de l'azote gazeux au sommet du tube pendant 10 min.
      REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour assurer l'évaporation complète de l'éthanol. Le volume de l'échantillon à cette étape est d'environ 20 ml.
    10. Geler l'échantillon à -80 ° C pendant au moins 24 h.
      REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour permettre un processus de lyophilisation plus efficace.
    11. Sécher l'échantillon à -50 ° C pendant environ 8 h. Stockez les échantillons à -20 ° C.
      REMARQUE: Le séchoir à glaçons crée un vide puissant à -50 ° C à l'intérieur de la chambre pour sécher les échantillons mais conserve la plupart des composés, tels que le polypheNols.
  2. Préparation d'extraits de polyphénols purifiés à partir d'extraits bruts.
    1. Peser les échantillons prélevés par lyophilisation.
      REMARQUE: Le volume de l'extrait à cette étape est d'environ 10 mL.
    2. Ajouter deux volumes (~ 20 mL) de chloroforme à l'extrait brut et agiter la solution pendant 5 minutes dans une plaque d'agitation.
    3. Verser le mélange dans un entonnoir de séparation. Laissez l'extrait brut décanter pendant 1 h à la température ambiante pour obtenir la fraction purifiée.
      REMARQUE: à cette étape, un mélange en deux phases se formera.
    4. Jeter la couche inférieure (phase chloroforme) de l'entonnoir de séparation et collecter la couche aqueuse dans un bécher propre.
    5. Ajouter deux volumes d'acétate d'éthyle à la fraction aqueuse et utiliser une barre d'agitation magnétique pour agiter le mélange pendant 5 min à la température ambiante.
    6. Filtrer le mélange à travers du papier filtre n ° 2 à l'aide d'un entonnoir Buchner refroidi avec aspiration sous vide.
    7. Recueillir l'échantillon filtré et le transférer dans un ballon à fond rond pour être nousAvec l'évaporateur rotatif.
    8. Mettre l'évaporateur rotatif à 62 ° C et à 50 tr / min et évaporer l'acétate d'éthyle pendant environ 30 minutes.
    9. Sécher l'échantillon à -50 ° C pendant environ 8 h. Transférer l'échantillon dans un tube conique de 50 ml et le conserver à -20 ° C.

3. Traitement des VSMC avec des extraits de baies

  1. La culture des VSMC.
    1. Isoler les VSMC des aortas thoraciques des rats Sprague-Dawley en effectuant une digestion enzymatique, comme décrit précédemment 29 . Culturez les VSMC comme décrit 29 .
    2. Préparer un milieu complet pour la culture de VSMC en utilisant du DMEM contenant 1 g / L de glucose et supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U / mL de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine. Conserver le milieu complet à 4 ° C.
  2. Incubation de VSMC avec des extraits de polyphénols.
    1. Pour diviser les VSMC, jeter le cultuRe medium et lave les cellules deux fois avec une solution salée tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 4 mL de PBS et 2 mL de trypsine EDTA 0,25%. Incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C dans un incubateur de CO 2 .
      1. Recueillir les cellules, les mélanger avec 2 ml de milieu complet dans un tube de centrifugation de 15 ml et centrifuger à 1 100 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire avec 1 ml de PBS. Comptez les cellules en utilisant un hémocytomètre.
      2. Graine 50 000 VSMC par puits dans des plaques de culture à 6 puits et développez-les en milieu complet contenant 10% de FBS jusqu'à atteindre 90% de confluence (environ 3 jours). Maintenir les VSMC à 37 ° C dans un incubateur humidifié à 5% de CO 2 .
    2. Préparer le milieu pour le traitement en utilisant un milieu DMEM contenant 1 g / L de glucose, 100 U / mL de pénicilline, 100 mg / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 0,5% de FBS. Conserver le milieu de traitement à 4 ° C.
      REMARQUE: Les extraits de polyphénols et Ang II sont ajoutés directement aux cellules en utilisant ce moiDium.
    3. Préparez une solution mère d'extrait brut (CE) de 10 mg / ml ou d'extrait purifié (PE) de polyphénols en dissolvant 10 mg d'extrait dans 1 mL de milieu DMEM ordinaire. Conserver le stock dans des aliquotes de 200 μL à -20 ° C.
    4. Incuber les VSMC avec 2 mL de milieu de traitement contenant 0,5% de FBS et ajouter des extraits CE ou PE pour obtenir une concentration de 50 à 500 μg / mL. Changer le milieu toutes les 24 h en ajoutant des extraits de polyphénols frais. Traiter les cellules pendant 3 jours.
    5. Pour le traitement avec Ang II ou d'autres hormones et facteurs de croissance, affamer les cellules pendant au moins 24 h en incubant les cellules avec un milieu de traitement contenant 0,5% de FBS avant l'addition d'Ang II (100 nM).
      NOTE: L'incubation avec et sans CE et PE dans un milieu de traitement FBS à 0,5% avant l'addition d'Ang II est recommandée.
      1. Après 24 h de famine, ajouter 100 nM Ang II. Remplacez le milieu de traitement par CE, PE ou Ang II frais toutes les 24 h pendant 3 jours.
  3. Préparation des échantillons de cellules.
    1. Lavez les cellules traitées deux fois dans du PBS froid et lysez-les avec 200 μL de tampon de lyse sur de la glace.
    2. Recueillir des lysats cellulaires à l'aide de grattoirs cellulaires et transférer les lysats dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL. Incuber les lysats cellulaires totaux pendant 20 min sur de la glace et du vortex toutes les 5 min.
    3. Sonicate les extraits de cellules avec trois rafales à 125 W pendant 10 s chacune, avec une pause de 2 s entre les deux. Gardez les échantillons sur de la glace tout au long de la sonication.
    4. Mesurer la concentration de protéines en utilisant un réactif de dosage de protéines à 595 nm.
    5. Conservez les échantillons à -20 ° C pour analyse par Western blot.
  4. Western blot.
    1. Mélanger des quantités égales de protéines (environ 50 μg) à partir d'échantillons traités non traités et traités avec des polyphénols ou Ang II avec un tampon de lyse pour obtenir un volume total maximal de 50 μL. Ajouter 16 μL d'un tampon d'échantillon 4x Laemmli. Chauffer les échantillons pendant 5 min à 75 ° C.
    2. Séparer l'échantillonnageEs dans 10% de gels SDS-PAGE et les transférer dans des membranes PDVF à 10 V pendant 75 minutes dans un système de transfert semi-sec pour une analyse Western Blot avec des anticorps spécifiques.
    3. Bloquer la membrane avec 2% de lait dans du tampon Triton-X100 à 0,05% de TBS (TBS-T) pendant 20 minutes.
    4. Retirer le lait en lavant la membrane au moins trois fois avec du TBS (5 min chacun) et incuber avec des anticorps primaires pendant 1 h à TA ou O / N à 4 ° C.
    5. Laver la membrane trois fois, 10 min chacune, avec TBS-T et incuber avec un anticorps secondaire lié à HRP pendant 45 minutes.
    6. Laver la membrane trois fois, 10 min chacune, avec TBS-T et se développer par une chimioluminescence améliorée (ECL).

Résultats

On a déjà démontré que les extraits de polyphénols isolés de BL, RB et BRB réduisaient la sénescence des VSMC en réponse à Ang II 21 . Il a été démontré que ces extraits de polyphénols purifiés modulent la signalisation Ang II en réduisant la phosphorylation d'Akt, de la protéine Kinase Activée par Mitogen (MAPK) et de l'ERK1 / 2. BL empêche la sénescence en réduisant l'expression de la NADPH oxydase (Nox) 1, une enzyme qui produi...

Discussion

Les polyphénols isolés des baies contiennent des compositions distinctes. Le protocole d'extraction à base d'éthanol décrit ici a permis d'identifier différents niveaux d'acides phénoliques et de flavonoïdes présents dans des extraits de polyphénols bruts et purifiés de BL ( Tableau 1 ). CE a été enrichi en acide gallic, en acide ferulique, en acide 4-O-caffeoylquinique et en acide 5-O-caffeoylquinique. Le processus de purification n'a pas modifié de manière significat...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Ce travail a été financé par l'American Heart Association (14GRNT20180028) et le Florida State University Council on Research and Creativity (COFRS).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Angiotensin IISigma-Aldrich, Inc.A9525-10MGTreatment of VSMCs
β-actinSigma-Aldrich, Inc.A2228Primary antibody (1:5000)
Blackberry fruitMercer FoodsFreeze-dried blackberry powder
Catalase Calbiochem219010Primary antibody (1:1000)
ChloroformBiotech Grd, Inc.97064-678Preparation of purified polyphenol extracts
DMEMMediatech, Inc.10-014-CVCulture of VSMCs
Ethanol (absolute molecular biology grade)Sigma-Aldrich, Inc.E7023-500MLPreparation of polyphenol extracts 
EthylacetateSigma-Aldrich, Inc.439169Preparation of purified polyphenol extracts
ERK1/2Cell Signaling Technology, Inc.9102SPrimary antibody (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0Teknova, Inc.E0306Lysis buffer
Freeze-DryerLabconcoVirTis Benchtop KPreparation of polyphenol extracts
FBSSeradigm1400-500Cell culture
HEPESSigma-Aldrich, Inc.H3375Lysis buffer 
NaClEMD Millipore, Inc.7760Lysis buffer
NaFJ.T.Baker, Inc.3688-01 Lysis buffer
Na3VO4Sigma-Aldrich, Inc.450243Lysis buffer
Na4P2O7 , decahydrateSigma-Aldrich, Inc.S-9515Lysis buffer
phospho ERK1/2 Cell Signaling Technology, Inc.9101SPrimary antibody (1:1000)
Protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich, Inc.P8340-5mlLysis buffer
Protein assay dye reagentBio-Rad Laboratories, Inc.500-0006Protein concentration Measurement
PVDF transfer membraneThermo Scientific, Inc.88518Western blots
Rotatory EvaporatorBuchi LabortechnikRotavapor
R3000		Preparation of polyphenol extracts
Sterile waterMediatech, Inc.25-055-CVPreparation of polyphenol extracts
SonicatorQSonica, LLCQ125Preparation of cell extracts
SOD2Enzo Life Sciences, Inc.ADI-SOD-110-FPrimary antibody (1:1000)
Triton-X-100Sigma-Aldrich, Inc.X100Western blots
Whatman #2 filter paperGE Healthcare, Inc.28317-241Preparation of polyphenol extracts

Références

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