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Resumo

Este trabalho detalha um método passo a passo para preparar extratos ricos em polifenóis de pó de baga liofilizado. Além disso, fornece uma descrição completa de como usar esses extratos ricos em polifenóis em cultura celular na presença do hormônio peptídico angiotensina II (Ang II) usando células musculares lisas vasculares (VSMCs).

Resumo

Estudos epidemiológicos indicam que o aumento da ingestão de flavonóides correlaciona-se com a diminuição da mortalidade por doenças cardiovasculares (DCV) nos Estados Unidos (EUA) e na Europa. As bagas são amplamente consumidas nos EUA e têm um alto conteúdo polifenólico. Os polifenóis demonstraram interagir com muitos alvos moleculares e exercer numerosas funções biológicas positivas, incluindo efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios e cardioprotetores. Os polifenóis isolados do blackberry (BL), da framboesa (RB) e da framboesa preta (BRB) reduzem o estresse oxidativo e a senescência celular em resposta à angiotensina II (Ang II). Este trabalho fornece uma descrição detalhada do protocolo usado para preparar os extratos de polifenóis de bagas liofilizadas. As extracções de polifenóis a partir de pó de baga liofilizado foram realizadas utilizando 80% de etanol aquoso e um método de extração assistida por ultra-som. O extracto em bruto foi ainda purificado e fraccionado utilizando clorofórmio e acetato de etilo,respectivamente. Os efeitos de extratos brutos e purificados foram testados em células musculares lisas vasculares (VSMCs) em cultura.

Introdução

Os polifenóis são compostos contendo pelo menos um anel fenólico em sua estrutura e estão abundantemente presentes no reino vegetal 1 . Os seres humanos têm consumido plantas por milênios para fins medicinais sem estar ciente da existência de tais compostos 2 . Muitas frutas e vegetais têm alguns compostos polifenólicos compartilhados, embora com diferentes quantidades, incluindo flavonóides, stilbenos e ácidos fenólicos 3 . Embora os polifenóis sejam freqüentemente associados a frutas e vegetais coloridos, isso não é estritamente verdadeiro. Por exemplo, a zeaxantina e a xantina estão presentes em vegetais que não são altamente coloridos, como cebolas e alho, que são da família de cebolas e estão associados a numerosos benefícios para a saúde 4 . Além de estar associado a vários benefícios para a saúde 5 , os polifenóis também servem as plantas, protegendo-os de insetos eD radiação ultravioleta 2 . Os polifenóis são comumente encontrados na dieta humana e são considerados poderosos antioxidantes, pois eles podem evitar as espécies reativas de oxigênio (ROS) 6 , 7 , 8 . Eles também têm propriedades antiinflamatórias 9 , antimicrobianas 10 , anti-hipertensivas 11 e antitranscinogênicas 12 , 13 .

Estudos epidemiológicos demonstram uma associação inversa entre o consumo de flavonóides e incidência de doença cardiovascular (DCV) 16 , 17 e mortalidade 14 , 15 . As bagas são amplamente consumidas nos EUA e possuem grandes quantidades de polifenóis, incluindo flavonóides. Por exemplo, o consumo de suco de amora (BL) (300 ML / d) durante oito semanas diminuiu significativamente a pressão arterial sistólica em pacientes dislipidêmicos 18 . Jeong et al. 19 relataram que homens e mulheres pré-hipertensos que consumiam 2,5 g de extrato de framboesa preta (BRB) por dia tiveram uma pressão arterial baixa de 24 horas e noite em comparação com aqueles que consumiam um placebo. As framboesas (RB) diminuíram a pressão sanguínea ao aumentar a expressão de superóxido dismutase (SOD) em ratos espontaneamente hipertensos 20 . Foi recentemente demonstrado que BL, RB e BRB reduzem os níveis de ROS e senescência induzidos pela angiotensina II (Ang II) em células musculares lisas vasculares (VSMCs) 21 . Além disso, a fração de antocianina do extracto de BL reduziu a expressão de óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e inibiu a atividade do Fator Nuclear kappa B (NF-kB) e cinase regulada por sinal extracelular (ERK) em lipopolisacarídeos (LPS) estimulada Células J774Ass = "xref"> 22. Os extratos de BRB diminuíram a ativação de NF-κB e a expressão de ciclooxigenase 2 (COX-2) in vitro 23 , melhoraram o perfil lipídico e impediram a formação da lesão aterosclerose em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura 24 . As antocianinas, que são consideradas os flavonóides mais abundantes nas bagas, modulam a resposta inflamatória em macrófagos RAW 264.7 estimulados pelo LPS ao diminuir a produção 25 do Fator de Necrose Tumoral (TNF-α) e diminuir a proliferação e migração de VSMCs 26 .

Uma vez que tem crescido o interesse em compreender o papel dos polifenóis na saúde humana e na doença, é importante otimizar o método de extração. A extração de solvente é amplamente utilizada para esse propósito, pois é econômica e facilmente reprodutível. Neste estudo, utilizou-se uma extração solvente com etanol, juntamente com uma extração extraída por ultra-somN método, que foi adaptado de Kim e Lee 27 . A purificação e o fraccionamento de extratos brutos (CE) utilizando clorofórmio e acetato de etilo foram realizados para obter a fração de extrato purificado (PE) que foi adaptada de Queires et al 28 . Além disso, foram comparadas a eficácia de extratos de polifenóis em bruto contra purificado de BL na redução da fosforilação basal de ERK1 / 2 e foram apresentados exemplos representativos do efeito inibitório do extrato de polifenol BL purificado em reduções de sinalização induzidas por Ang II em VSMCs.

Protocolo

1. Preparação de Reagentes

  1. Prepare 80% de etanol (100 mL) misturando 80 mL de etanol absoluto (grau de biologia molecular) e 20 mL de água estéril de grau de cultura celular.
  2. Para preparar extrato de polifenol (10 mg / mL), pesa 10 mg de CE ou PE. Adicione 1 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sob uma capa de cultura de células. Vortex a solução. Alíquota em porções de 200 μL e armazene a -20 ° C.
  3. Prepare o tampão de lise.
    1. Adicionar 5 mL de solução de reserva de HEPES 1 M (pH 7,4, final de 50 mM), 1 mL de solução de reserva de NaCl 5 M (50 mM de final), 1 mL de solução de reserva de EDTA 0,5 M (final 5 mM), 2 mL de 0,5 Solução madre de NaF de M (10 mM final), 286 μL de solução de reserva de Na3 VO4 700 mM (final de 2 mM), 5 mL de solução de reserva de Na4P2O7 200 mM (10 mM de final) e 5 mL de Solução de reserva de Triton-X-100 a 20% preparada em água (1% final). Adicione água para atingir um volume de 100 mL. Mantenha-se a 4 ° C.
    2. Adicione 10 μL / mL de coquetel inibidor de protease. Adicione o novo quando as células estiverem prontas para a lise.
  4. Prepare o tampão de amostra Laemmli (4x).
    1. Adicionar 31,25 ml de solução de reserva de Tris 2 M (pH 6,8), 100 mL de glicerol, 50 mL de uma solução a 20% de Dodecyl Sulfate de Sódio (SDS) preparada em água e 50 mL de β-mercaptoetanol. Adicione água até 250 mL. Mantenha-se a 4 ° C.
  5. Para preparar o tampão salino tamponado com Tris (TBS), pesa 3 g de Tris (25 mM final), 0,18 g de KCl (2,5 mM final) e 8,76 g de NaCl (150 mM final). Ajuste o pH para 7,4 e adicione água até 1 L. Manter à temperatura ambiente.
  6. Para preparar TBS-T, adicione 997,5 mL de TBS e 2,5 mL de uma solução Triton-X-100 a 20% preparada em água. Mantenha-se à RT.

2. Preparação de extratos de Blackerry

  1. Preparação de extracto bruto de pó de baga liofilizado.
    1. Pesar 10 g de pó de amora liofilizada (ou 5 g de pó fresco). Se for usada fruta congelada, corte-aNto peças muito pequenas antes de iniciar a extração.
    2. Misture o pó de fruta com 100 mL de etanol aquoso a 80% num balão Erlenmeyer de 1 L de fundo redondo.
    3. Sonicate a mistura por 20 min a 42 kHz, 135 W usando um banho ultra-sônico a 25 ° C, sem intervalo de tempo entre eles. Execute a sonicação com purga contínua de nitrogênio em luz moderada. Para frutas congeladas, aumentar o tempo de incubação para 4 h.
    4. Filtre a mistura através de um papel de filtro # 2 usando um funil refrigerado Buchner com aspiração a vácuo.
      NOTA: No final desta etapa, os resíduos da amostra aparecem no papel de filtro; Isso é chamado de bolo de filtro.
    5. Lavar o bolo de filtração com 50 mL de etanol a 100%. Salve o filtrado e adicione o bolo de filtração a um frasco de fundo redondo de 1 L contendo 100 mL de etanol aquoso a 80%.
    6. Repita o processo de extração para o resíduo (etapas 2.1.2 - 2.1.4).
    7. Combine os dois filtrados num balão de fundo redondo com 50 ml adicionaisDe etanol aquoso a 80%.
      NOTA: O volume final deve ser de aproximadamente 300 mL.
    8. Use um evaporador rotativo a 62 ° C e 50 rpm para evaporar o solvente. Continue este processo até que o etanol não se evapore mais.
      NOTA: Este processo leva aproximadamente 45 min.
    9. Transfira a amostra para um tubo cônico de 50 mL. Evaporar o etanol por injetar gás nitrogênio na parte superior do tubo durante 10 min.
      NOTA: Esta etapa é necessária para assegurar a evaporação completa do etanol. O volume da amostra neste passo é de aproximadamente 20 mL.
    10. Congele a amostra a -80 ° C durante pelo menos 24 h.
      NOTA: Esta etapa é necessária para permitir um processo de liofilização mais eficiente.
    11. Congele a amostra a -50 ° C durante aproximadamente 8 h. Armazene as amostras a -20 ° C.
      NOTA: O secador de gelo cria um vácuo poderoso a -50 ° C dentro da câmara para secar as amostras, mas preserva a maioria dos compostos, como polipaNols.
  2. Preparação de extratos purificados de polifenóis a partir de extratos brutos.
    1. Pesar as amostras extraídas liofilizadas.
      NOTA: O volume do extrato neste passo é de aproximadamente 10 mL.
    2. Adicione dois volumes (~ 20 mL) de clorofórmio ao extrato bruto e agite a solução por 5 minutos em uma placa de agitação.
    3. Despeje a mistura em um funil de separação. Deixe o extracto bruto decantar durante 1 h à TA para obter a fração purificada.
      NOTA: Nesta etapa, formará uma mistura de duas fases.
    4. Descarte a camada inferior (fase de clorofórmio) do funil de separação e cole a camada aquosa em um copo limpo.
    5. Adicionar dois volumes de acetato de etilo à fração aquosa e usar uma barra de agitação magnética para agitar a mistura durante 5 min à TA.
    6. Filtre a mistura através do papel de filtro # 2 usando um funil Buchner refrigerado com aspiração a vácuo.
    7. Coletar a amostra filtrada e transferi-la para um balão de fundo redondo para ser nósCom o evaporador rotativo.
    8. Colocar o evaporador rotativo a 62 ° C e 50 rpm e evaporar o acetato de etilo durante cerca de 30 min.
    9. Congele a amostra a -50 ° C durante aproximadamente 8 h. Transfira a amostra para um tubo cônico de 50 mL e guarde-o a -20 ° C.

3. Tratamento de VSMCs com Extractos de Berry

  1. Cultura de VSMCs.
    1. Isolar VSMCs das aortas torácicas de ratos Sprague-Dawley realizando uma digestão enzimática, como descrito anteriormente 29 . Cultive os VSMCs como descrito 29 .
    2. Prepare o meio completo para a cultura de VSMCs usando DMEM contendo 1 g / L de glicose e suplementado com 10% de soro de bovino fetal (FBS), 100 U / mL de penicilina, 100 mg / mL de estreptomicina e 2 mM de L-glutamina. Armazene o meio completo a 4 ° C.
  2. Incubação de VSMCs com extratos de polifenóis.
    1. Para dividir os VSMCs, descarte o cultuRe médio e lave as células duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Adicionar 4 mL de PBS e 2 mL de tripsina EDTA 0,25%. Incubar as células durante 5 minutos a 37 ° C numa incubadora de CO 2 .
      1. Recolher as células, misturá-las com 2 mL de meio completo em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugar a 1.100 × g durante 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular com 1 mL de PBS. Contar as células usando um hemocitómetro.
      2. Semear 50,000 VSMCs por poço em placas de cultura de 6 poços e cultivá-las em meio completo contendo 10% de FBS até atingir 90% de confluência (cerca de 3 d). Manter os VSMCs a 37 ° C em uma incubadora humidificada a 5% CO 2 .
    2. Prepare o meio para o tratamento usando meio DMEM contendo 1 g / L de glicose, 100 U / mL de penicilina, 100 mg / mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina e 0,5% de FBS. Armazene o meio de tratamento a 4 ° C.
      NOTA: Os extratos de polifenóis e Ang II são adicionados diretamente às células usando este euDium.
    3. Prepare uma solução-mãe de 10 mg / mL de Extracto Bruto (CE) ou Extracto Purificado (PE) de polifenóis dissolvendo 10 mg de extrato em 1 mL de meio DMEM liso. Mantenha o estoque em alíquotas de 200 μL a -20 ° C.
    4. Incubar os VSMCs com 2 mL de meio de tratamento contendo 0,5% de FBS e adicionar extratos CE ou PE para atingir uma concentração de 50 a 500 μg / mL. Mude o meio a cada 24 h adicionando extratos de polifenóis frescos. Trate as células por 3 d.
    5. Para o tratamento com Ang II ou outros hormônios e fatores de crescimento, fome as células por pelo menos 24 h incubando as células com meio de tratamento contendo 0,5% de FBS antes da adição de Ang II (100 nM).
      NOTA: Incubação com e sem CE e PE em meio de tratamento com FBS a 0,5% antes da adição de Ang II.
      1. Após 24 h de fome, adicione 100 nM de Ang II. Substitua o meio de tratamento por CE, PE ou Ang II frescos a cada 24 h por 3 d.
  3. Preparação de amostras de células.
    1. Lavar as células tratadas duas vezes em PBS frio e lisá-las com 200 μL de tampão de lise em gelo.
    2. Coletar lisados ​​celulares usando raspadores de células e transferir os lisados ​​para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Incube os lisados ​​celulares totais durante 20 min no gelo e vortex a cada 5 min.
    3. Sonicate os extratos celulares com três rajadas em 125 W por 10 s cada, com uma pausa de 2 s no meio. Mantenha as amostras em gelo ao longo da sonicação.
    4. Medir a concentração de proteína usando um reagente de teste de proteína a 595 nm.
    5. Armazene as amostras a -20 ° C para análise por Western blot.
  4. Western blot.
    1. Misture quantidades iguais de proteína (cerca de 50 μg) a partir de amostras tratadas não tratadas e tratadas com polifenol ou Ang II com tampão de lise para obter um volume total máximo de 50 μL. Adicione 16 μL de um tampão de amostra 4x Laemmli. Aquecer as amostras por 5 minutos a 75 ° C.
    2. Separar a amostraEs em 10% de géis SDS-PAGE e transfira-os para membranas PDVF a 10 V durante 75 min em um sistema de transferência semi-seco para análise de Western blot com anticorpos específicos.
    3. Bloqueie a membrana com 2% de leite em TBS 0,05% de tampão Triton-X100 (TBS-T) durante 20 min.
    4. Retire o leite lavando a membrana pelo menos três vezes com TBS (5 min cada) e incuba com anticorpos primários durante 1 h à TA ou O / N a 4 ° C.
    5. Lave a membrana três vezes, 10 min cada, com TBS-T e incuba com um anticorpo secundário ligado a HRP durante 45 min.
    6. Lave a membrana três vezes, 10 min cada, com TBS-T e desenvolva-se por quimioluminiscência avançada (ECL).

Resultados

Foi demonstrado anteriormente que os extratos de polifenóis isolados de BL, RB e BRB reduziram a senescência de VSMCs em resposta a Ang II 21 . Verificou-se que estes extratos de polifenóis purificados modulam a sinalização de Ang II através da redução da fosforilação de Akt, p38 Mitrogen-activated Protein Kinase (MAPK) e ERK1 / 2. BL evita a senescência ao reduzir a expressão da NADPH oxidase (Nox) 1, uma enzima que produz aniões superóxido e está ...

Discussão

Os polifenóis isolados das bagas contêm composições distintas. O protocolo de extração baseado em etanol descrito aqui permitiu a identificação de diferentes níveis de ácidos fenólicos e flavonóides presentes em extratos de polifenóis brutos e purificados de BL ( Tabela 1 ). CE foi enriquecido em ácido gálico, ácido ferúlico, ácido 4-O-cafeoilquinico e ácido 5-O-cafeoilquinico. O processo de purificação não alterou significativamente os níveis de ácido gálico e ácido p-cumarico...

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Associação Americana do Coração (14GRNT20180028) e pelo Conselho da Universidade Estadual da Flórida sobre Pesquisa e Criatividade (COFRS).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Angiotensin IISigma-Aldrich, Inc.A9525-10MGTreatment of VSMCs
β-actinSigma-Aldrich, Inc.A2228Primary antibody (1:5000)
Blackberry fruitMercer FoodsFreeze-dried blackberry powder
Catalase Calbiochem219010Primary antibody (1:1000)
ChloroformBiotech Grd, Inc.97064-678Preparation of purified polyphenol extracts
DMEMMediatech, Inc.10-014-CVCulture of VSMCs
Ethanol (absolute molecular biology grade)Sigma-Aldrich, Inc.E7023-500MLPreparation of polyphenol extracts 
EthylacetateSigma-Aldrich, Inc.439169Preparation of purified polyphenol extracts
ERK1/2Cell Signaling Technology, Inc.9102SPrimary antibody (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0Teknova, Inc.E0306Lysis buffer
Freeze-DryerLabconcoVirTis Benchtop KPreparation of polyphenol extracts
FBSSeradigm1400-500Cell culture
HEPESSigma-Aldrich, Inc.H3375Lysis buffer 
NaClEMD Millipore, Inc.7760Lysis buffer
NaFJ.T.Baker, Inc.3688-01 Lysis buffer
Na3VO4Sigma-Aldrich, Inc.450243Lysis buffer
Na4P2O7 , decahydrateSigma-Aldrich, Inc.S-9515Lysis buffer
phospho ERK1/2 Cell Signaling Technology, Inc.9101SPrimary antibody (1:1000)
Protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich, Inc.P8340-5mlLysis buffer
Protein assay dye reagentBio-Rad Laboratories, Inc.500-0006Protein concentration Measurement
PVDF transfer membraneThermo Scientific, Inc.88518Western blots
Rotatory EvaporatorBuchi LabortechnikRotavapor
R3000		Preparation of polyphenol extracts
Sterile waterMediatech, Inc.25-055-CVPreparation of polyphenol extracts
SonicatorQSonica, LLCQ125Preparation of cell extracts
SOD2Enzo Life Sciences, Inc.ADI-SOD-110-FPrimary antibody (1:1000)
Triton-X-100Sigma-Aldrich, Inc.X100Western blots
Whatman #2 filter paperGE Healthcare, Inc.28317-241Preparation of polyphenol extracts

Referências

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