혈관 평활근 세포 치료를위한 동결 건조 베리 파우더에서 폴리 페놀 추출 및 정제<em&gt; In Vitro</em

요약

이 작품은 동결 건조 베리 파우더에서 폴리 페놀이 풍부한 추출물을 준비하는 단계별 방법을 자세히 설명합니다. 또한 Vascular Smooth Muscle Cells (VSMCs)를 사용하여 펩타이드 호르몬 인 안지오텐신 II (Ang II)의 존재하에 세포 배양에서 이들 폴리 페놀이 풍부한 추출물을 사용하는 방법에 대한 철저한 설명을 제공합니다.

초록

역학 조사에 따르면 플라보노이드 섭취가 증가하면 미국과 유럽에서 심혈관 질환 (CVD)으로 인한 사망률이 감소하는 것으로 나타났습니다. 딸기는 미국에서 광범위하게 소비되며 폴리 페놀 함량이 높습니다. 폴리 페놀은 많은 분자 표적과 상호 작용하고 항산화, 항염증제 및 심장 보호 효과를 비롯한 수많은 긍정적 인 생물학적 기능을 발휘하는 것으로 나타났습니다. 블랙 베리 (BL), 라즈베리 (RB) 및 블랙 라즈베리 (BRB)에서 분리 된 폴리 페놀은 안지오텐신 II (Ang II)에 대한 산화 스트레스와 세포 노화를 감소시킵니다. 이 작품은 동결 건조 딸기에서 폴리 페놀 추출물을 준비하는 데 사용되는 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 동결 건조 베리 분말로부터 폴리 페놀 추출을 80 % 수성 에탄올 및 초음파 보조 추출법을 사용하여 수행 하였다. 조 추출물을 추가로 정제하고 클로로포름 및 에틸 아세테이트를 사용하여 분획하고,각기. 원유 및 정제 추출물의 효과는 배양 된 혈관 평활근 세포 (VSMCs)에서 시험 하였다.

서문

폴리 페놀은 그 구조 중에 적어도 하나의 페놀 릭 고리를 함유하고 식물 왕국에 풍부하게 존재하는 화합물이다. 인간은 그러한 화합물의 존재를 의식하지 않고 약용 목적으로 수천 년 동안 식물을 먹고있다. 많은 과일과 채소에는 플라보노이드, 스틸 벤 (stilbenes), 페놀 릭산 (phenols acids) ^3을 포함한 다양한 양의 폴리 페놀 화합물이 있습니다. 폴리 페놀은 다채로운 과일과 채소와 관련이 있지만 이는 사실이 아닙니다. 예를 들어, zeaxanthin과 xanthine은 양파와 마늘과 같이 매우 다채롭지 않은 채소에 존재하며, 이는 scallions 계열에서 비롯되며 수많은 건강상의 이점과 관련이 있습니다 ⁴ . 폴리 페놀은 여러 가지 건강상의 효능과는 별도로 식물을 곤충에서 보호하여d 자외선 ² . 폴리 페놀은 일반적으로 인간의 식단에서 발견되며 반응성 산소 종 (ROS) ^{6 , 7 , 8을} 제거 할 수 있기 때문에 강력한 항산화 물질로 간주됩니다. 그들은 또한 항염증제 ⁹ , 항균제 ¹⁰ , 항 고혈압제 ¹¹ 및 항암제 ^{12 , 13} 성질이 있습니다.

역학 연구는 플라보노이드와 심혈관 질환 (CVD) 발병률 ^{16 , 17} 및 사망률 ^{14 , 15} 사이의 역 상관 관계를 보여줍니다. 딸기는 미국에서 널리 섭취되고 있으며 플라보노이드를 포함한 많은 양의 폴리 페놀을 함유하고 있습니다. 예를 들어, 블랙 베리 (BL) 주스 (300 mL / d)에서 8 주 동안 이상 지질 혈증 환자에서 수축기 혈압을 유의하게 감소시켰다. Jeong et al. ¹⁹ 명은 하루에 2.5g의 블랙 라즈베리 (BRB) 추출물을 섭취 한 고혈압 남성과 여성이 위약을 복용 한 남성과 그렇지 않은 여성보다 하루 24 시간 낮고 혈압이 낮았다 고 전했다. 라스베리 (RB)는 혈압을 감소시키는 반면 자발적으로 고혈압 쥐에서 수퍼 옥사이드 디스 뮤타 아제 (SOD)의 발현을 증가시킨다. BL, RB 및 BRB가 혈관 평활근 세포 (VSMC)에서 안지오텐신 II (Ang II)에 의해 유도 된 ROS 및 노화의 수준을 감소 시킨다는 것이 최근에 밝혀졌습니다 ²¹ . 또한 BL 추출물의 안토시아닌 분획물은 유도 성 질소 산화물 합성 효소 (iNOS)의 발현을 감소 시켰으며, LPS (lipopolysaccharide) 자극 된 핵 인자 Kappa B (NF-κB) 및 세포 외 신호 조절 키나아제 (ERK)의 활성을 억제 하였다. J774 세포ass = "xref"> 22. BRB 추출물 은 시험 관내 에서 NF-κB 활성화 및 cyclooxygenase 2 (COX-2) 발현 을 감소 시켰고, 지질 프로필을 향상 시켰으며, 고지 방식을 먹인 쥐에서 죽상 경화증 병변 형성을 막았다. 열매에서 가장 풍부한 플라 보 노이드로 여겨지는 안토시아닌은 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) 생성을 감소시키고 VSMCs ²⁶ 의 증식과 이동을 감소시킴으로써 LPS- 자극 RAW 264.7 대식 세포에서 염증 반응을 조절한다.

인체 건강 및 질병에서 폴리 페놀의 역할을 이해하는 데 관심이 커지면서 추출 방법을 최적화하는 것이 중요합니다. 솔벤트 추출은 비용 효율적이고 쉽게 재현 할 수 있기 때문에 널리 사용됩니다. 이 연구에서는 에탄올과 함께 용매 추출물을 사용하였고, 초음파 보조 추출물n 방법으로, Kim과 Lee로부터 적응시켰다. 퀸 즈 (Queires) 등 ²⁸⁾ 이 채택한 정제 추출물 (PE) 분획을 얻기 위해 클로로포름 및 에틸 아세테이트를 사용하여 조 추출물 (CE)의 정제 및 분별을 실시 하였다. 또한, BL의 정제 된 폴리 페놀 추출물 대 ERK1 / 2의 기초 인산화를 감소시키는 효능을 비교하였고, 정제 된 BL 폴리 페놀 추출물이 Ang II- 유도 된 VSMCs 신호 감소 억제 효과의 대표적인 예가 제공되었다.

프로토콜

1. 시약의 준비

1. 절대 에탄올 (분자 생물학 등급) 80 mL와 세포 배양 등급의 멸균 수 20 mL를 혼합하여 80 % 에탄올 (100 mL)을 준비한다.
2. 폴리 페놀 추출물 (10mg / ml)을 준비하려면 CE 또는 PE 10mg을 취하십시오. 세포 배양 후드 아래에 일반 Dulbecco 수정 이글 매체 (DMEM) 1 ML을 추가합니다. 솔루션을 소용돌이 치게하십시오. 분주 량을 200 μL로 나누고 -20 ° C에서 보관하십시오.
3. 용해 완충액을 준비하십시오.
   1. 1 M HEPES 원액 (pH 7.4, 최종 50 mM) 5 mL, 5 M NaCl 원액 1 mL (최종 50 mM), 0.5 M EDTA 원액 1 mL (최종 5 mM), 0.5 mL 2 mL M NaF 저장 용액 (최종 10 mM), 700 mM Na ₃ VO _{4 저장} 용액 (최종 2 mM) 286 μL, 200 mM Na ₄ P ₂ O ₇ 스톡 용액 5 mL (최종 10 mM) 및 5 mL의 물 (최종 1 %)로 제조 된 20 % 트리톤 -X-100 스톡 용액. 물을 넣어 100 mL의 부피에 도달하십시오. 4 ° C에서 유지하십시오.
   2. 10 μL / mL의 protease inhibitor cocktail을 첨가한다. 세포가 용해 될 때 새로 추가하십시오.
4. Laemmli 샘플 버퍼를 준비하십시오 (4x).
   1. 2M Tris 저장 용액 (pH 6.8) 31.25 mL, 글리세롤 100 mL, 물로 만든 20 % SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 용액 50 mL 및 β- 머 캅토 에탄올 50 mL를 넣는다. 최대 250 mL의 물을 첨가하십시오. 4 ° C에서 유지하십시오.
5. Tris-Buffered Saline (TBS) 버퍼를 준비하기 위해 Tris (최종 25 mM) 3 g, KCl 0.18 g (최종 2.5 mM) 및 NaCl 8.76 g (최종 150 mM)을 잰다. pH를 7.4로 조절하고 물을 1 L까지 넣으십시오. RT에서 보관하십시오.
6. TBS-T를 준비하기 위해 99.7.5 mL의 TBS와 물에 준비된 20 % Triton-X-100 용액 2.5 mL를 넣는다. RT에 보관하십시오.

2. 블랙 베리 추출물의 제조

1. 동결 건조 베리 분말로부터 조 추출물 제조.
   1. 동결 건조 된 검은 딸기 분말 (또는 5g의 신선한 분말) 10g을 칭량하십시오. 냉동 과일을 사용하는 경우, 그것을 잘라nto 아주 작은 조각 추출을 시작하기 전에.
   2. 1 L 둥근 바닥 삼각 플라스크에 100 mL의 80 % 에탄올 수용액과 과일 파우더를 섞는다.
   3. 혼합물을 25 kHz에서 초음파 욕조를 사용하여 42 kHz, 135 W에서 20 분간 초음파를 사이에두고 시간 간격없이 초음파 처리하십시오. 부드러운 질소로 연속 질소 퍼지로 초음파 처리를 수행하십시오. 냉동 과일의 경우 배양 시간을 4 시간으로 늘립니다.
   4. 냉각 된 Buchner 깔때기를 사용하여 # 2 여과지를 통해 혼합물을 진공 흡입으로 여과한다.
      참고 :이 단계가 끝나면 시료의 잔류 물이 여과지에 나타납니다. 이것을 필터 케이크라고합니다.
   5. 필터 케이크를 100 % 에탄올 50 mL로 헹구십시오. 여액을 저장하고 80 % 수성 에탄올 100 mL가 들어있는 1 L 둥근 바닥 플라스크에 필터 케이크를 넣는다.
   6. 찌꺼기에 대한 추출 과정을 반복하십시오 (2.1.2 - 2.1.4 단계).
   7. 두 개의 여과 액을 둥근 바닥 플라스크에 넣고 50 mL의 80 % 수성 에탄올을 첨가 하였다.
      참고 : 최종 부피는 약 300 mL 여야합니다.
   8. 62 ° C와 50 rpm에서 회전 증발기를 사용하여 용매를 증발시킵니다. 에탄올이 더 이상 증발하지 않을 때까지이 과정을 계속하십시오.
      참고 :이 프로세스는 약 45 분이 소요됩니다.
   9. 샘플을 50 mL 원추형 튜브에 옮긴다. 튜브 상단에 질소 가스를 10 분간 주입하여 에탄올을 증발시킨다.
      참고 :이 단계는 에탄올의 완전한 증발을 보장하기 위해 필요합니다. 이 단계에서 시료의 부피는 약 20 mL입니다.
   10. 최소 24 시간 동안 -80 ° C에서 샘플을 고정 시키십시오.
       참고 :이 단계는보다 효율적인 동결 건조 프로세스를 허용하기 위해 필요합니다.
   11. -50 ° C에서 약 8 시간 동 안 건조시킵니다. -20 ° C에서 샘플을 보관하십시오.
       참고 : 동결 건조기는 시료를 건조시키기 위해 챔버 내부에 -50 ° C의 강력한 진공을 생성하지만 폴리 신소와 같은 대부분의 화합물을 보존합니다nols.
2. 조 추출물로부터 정제 된 폴리 페놀 추출물의 제조.
   1. 동결 건조 샘플을 칭량하십시오.
      참고 :이 단계에서 추출물의 부피는 약 10 mL입니다.
   2. 조 추출물에 두 부피 (~ 20 mL)의 클로로포름을 첨가하고 교반 판에서 5 분 동안 용액을 진탕하십시오.
   3. 혼합물을 분액 깔대기에 붓는다. 조 추출물을 실온에서 1 시간 동안 가만히 따르고 정제 된 분획을 수득한다.
      참고 :이 단계에서 2 단계 혼합물이 형성됩니다.
   4. 분액 깔때기에서 바닥 층 (클로로포름 상)을 버리고 수성 층을 깨끗한 비이커에 수집한다.
   5. 수성 분획에 에틸 아세테이트 2 부피를 첨가하고 자기 교반 막대를 사용하여 혼합물을 실온에서 5 분 동안 교반한다.
   6. 냉장 된 Buchner 깔때기를 사용하여 # 2 여과지를 통해 혼합물을 진공 흡입으로 여과하십시오.
   7. 여과 된 시료를 모은 다음 둥근 바닥 플라스크에 옮겨 담아주십시오.회전식 증발기로 에드.
   8. 로터리 증발기를 62 ° C와 50 rpm으로 설정하고 에틸 아세테이트를 약 30 분 동안 증발시킨다.
   9. -50 ° C에서 약 8 시간 동 안 건조시킵니다. 샘플을 50 mL 원추형 튜브에 옮기고 -20 ° C에 보관하십시오.

3. 베리 엑기스로 VSMCs 치료

1. VSMCs 문화.
   1. 이전에 ²⁹ 설명한대로, 효소 소화를 수행하여 Sprague-Dawley 쥐의 흉부 대동맥에서 VSMC를 분리합니다. ^29. 설명한대로 VSMCs를 배양하십시오.
   2. 1g / L 포도당을 함유하고 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 100U / mL 페니실린, 100㎎ / mL 스트렙토 마이신 및 2mM L- 글루타민으로 보충 된 DMEM을 사용하여 VSMC 배양을위한 완전한 배지를 준비한다. 4 ° C에서 완전한 배지를 보관하십시오.
2. VSMCs와 폴리 페놀 추출물의 배양.
   1. VSMC를 분리하려면 cultu를 버립니다.인산염 완충 식염수 (PBS)로 두 번 세포를 씻어. 4 mL의 PBS와 2 mL의 트립신 EDTA 0.25 %를 첨가한다. CO ₂ 배양기에서 37 ° C에서 5 분 동안 세포를 품어 라.
      1. 세포를 수집하고, 15 ML 원심 분리기 튜브에 완전한 매체 2 ML와 그들을 섞어 1,100 X에서 5 분 원심 분리기. 뜨는을 버리고 PBS 1 ML와 세포 펠렛을 resuspend. hemocytometer를 사용하여 세포를 계산합니다.
      2. 6 잘 배양 접시에 잘 50,000 VSMCs를 시드하고 그들이 90 % confluency (약 3 일)에 도달 할 때까지 10 % FBS를 포함하는 전체 매체에서 그들을 성장. 가습 된 5 % CO2 배양기에서 37 ° C로 VSMC를 유지하십시오.
   2. 1g / L 포도당, 100U / mL 페니실린, 100㎎ / mL 스트렙토 마이신, 2mM L- 글루타민 및 0.5 % FBS를 함유하는 DMEM 배지를 사용하여 처리를위한 배지를 준비한다. 4 ° C에서 처리 매체를 보관하십시오.
      참고 : 폴리 페놀 추출물과 Ang II는이 세포를 사용하여 세포에 직접 첨가됩니다.다이뮴.
   3. 일반 DMEM 배지 1 mL에 추출물 10 mg을 녹여 폴리 페놀 10 mg / ml 원액 추출물 (CE) 또는 정제 추출물 (PE)을 준비합니다. -20 ° C에서 200 μL 분량의 주식을 보관하십시오.
   4. 0.5 % FBS를 포함하는 치료 매체 2 ML와 VSMCs를 품어 50 또는 500 μg / ML의 농도를 달성하기 위해 CE 또는 체육 추출물을 추가합니다. 신선한 폴리 페놀 추출물을 첨가하여 매 24 시간마다 배지를 교환한다. 세포를 3 일 동안 취급하십시오.
   5. Ang II 또는 다른 호르몬 및 성장 인자로 처리하기 위해, Ang II (100nM) 첨가 전에 0.5 % FBS를 함유하는 처리 배지로 세포를 배양하여 적어도 24 시간 동안 세포를 굶어 서라.
      참고 : Ang II를 추가하기 전에 0.5 % FBS 처리 배지에서 CE 및 PE가 포함되거나 포함되지 않은 인큐베이션이 권장됩니다.
      1. 기아가 24 시간이 지난 후, 100 nM Ang II를 첨가한다. 3 일 동안 24 시간마다 새로운 CE, PE 또는 Ang II로 처리 매체를 교체하십시오.
3. 세포 샘플 준비.
   1. 차가운 PBS에서 두 번 처리 세포를 씻어 얼음에서 용해 버퍼의 200 μL로 그들을 해 줘.
   2. 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포 lysates를 수집하고 1.5 ML microcentrifuge 튜브에 lysates를 전송합니다. 얼음과 소용돌이에 5 분마다 20 분 동안 총 세포 lysates를 품어.
   3. 세포 추출물을 125W에서 10 초 동안 3 회 파열시키고 그 사이에 2 초간 일시 중지합니다. 초음파를 통해 샘플을 얼음에 보관하십시오.
   4. 595 nm에서 단백질 분석 시약을 사용하여 단백질 농도를 측정하십시오.
   5. Western blot으로 분석하기 위해 -20 ℃에서 보관한다.
4. 서양 얼룩.
   1. 대조군 비 처리 및 폴리 페놀 처리 또는 Ang II 처리 시료에서 같은 양의 단백질 (약 50 μg)을 용해 완충액과 혼합하여 최대 총 부피 50 μL을 얻습니다. 4x Laemmli 샘플 버퍼 16 μL를 첨가하십시오. 75 ° C에서 5 분 동안 시료를 가열합니다.
   2. 샘플 분리10 % SDS-PAGE 젤에 넣고 10- V에서 75 분 동안 PDVF 멤브레인으로 옮기고 특정 항체를 사용한 Western blot 분석을 위해 반 건식 전달 시스템으로 옮깁니다.
   3. 20 분 동안 TBS 0.05 % Triton - X100 버퍼 (TBS - T)에 2 % 우유 막을 차단.
   4. TBS (각각 5 분)로 적어도 세 번 멤브레인을 세척하여 우유를 제거하고 RT 또는 O / N 4 ° C에서 1 차 항체와 함께 품어.
   5. 멤브레인을 TBS-T로 10 분씩 세 번 씻고 45 분 동안 HRP가 결합 된 2 차 항체와 함께 배양합니다.
   6. 멤브레인을 TBS-T로 10 분씩 세 번 씻고 강화 된 화학 발광 (ECL)으로 현상하십시오.

결과

BL, RB 및 BRB로부터 분리 된 폴리 페놀 추출물이 Ang II ²¹ 에 반응하여 VSMCs의 노화를 감소시키는 것이 이전에 입증되었다. 이러한 정제 된 폴리 페놀 추출물은 Akt, p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) 및 ERK1 / 2의 인산화를 감소시킴으로써 Ang II 신호 전달을 조절한다는 것이 밝혀졌습니다. BL은 슈퍼 옥사이드 음이온을 생산하는 효소 인 NADPH 산화 효소 (Nox) 1의 ?...

토론

딸기에서 단리 된 폴리 페놀은 별개의 조성물을 함유하고있다. 여기에 기술 된 에탄올 기반의 추출 프로토콜은 BL의 조잡하고 정제 된 폴리 페놀 추출물에 존재하는 페놀 릭 산과 플라보노이드의 서로 다른 수준의 확인을 허용했다 ( 표 1 ). CE는 갈산, 훼 루릴 산, 4-O- 카페인 퀴 닉산 및 5-O- 카페인 퀴 닉산으로 농축되었다. 정제 공정은 갈산 및 p- 쿠마린 산의 수준을 크게 변화시키지 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiotensin II	Sigma-Aldrich, Inc.	A9525-10MG	Treatment of VSMCs
β-actin	Sigma-Aldrich, Inc.	A2228	Primary antibody (1:5000)
Blackberry fruit	Mercer Foods		Freeze-dried blackberry powder
Catalase	Calbiochem	219010	Primary antibody (1:1000)
Chloroform	Biotech Grd, Inc.	97064-678	Preparation of purified polyphenol extracts
DMEM	Mediatech, Inc.	10-014-CV	Culture of VSMCs
Ethanol (absolute molecular biology grade)	Sigma-Aldrich, Inc.	E7023-500ML	Preparation of polyphenol extracts
Ethylacetate	Sigma-Aldrich, Inc.	439169	Preparation of purified polyphenol extracts
ERK1/2	Cell Signaling Technology, Inc.	9102S	Primary antibody (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0	Teknova, Inc.	E0306	Lysis buffer
Freeze-Dryer	Labconco	VirTis Benchtop K	Preparation of polyphenol extracts
FBS	Seradigm	1400-500	Cell culture
HEPES	Sigma-Aldrich, Inc.	H3375	Lysis buffer
NaCl	EMD Millipore, Inc.	7760	Lysis buffer
NaF	J.T.Baker, Inc.	3688-01	Lysis buffer
Na3VO4	Sigma-Aldrich, Inc.	450243	Lysis buffer
Na4P2O7 , decahydrate	Sigma-Aldrich, Inc.	S-9515	Lysis buffer
phospho ERK1/2	Cell Signaling Technology, Inc.	9101S	Primary antibody (1:1000)
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich, Inc.	P8340-5ml	Lysis buffer
Protein assay dye reagent	Bio-Rad Laboratories, Inc.	500-0006	Protein concentration Measurement
PVDF transfer membrane	Thermo Scientific, Inc.	88518	Western blots
Rotatory Evaporator	Buchi Labortechnik	Rotavapor R3000	Preparation of polyphenol extracts
Sterile water	Mediatech, Inc.	25-055-CV	Preparation of polyphenol extracts
Sonicator	QSonica, LLC	Q125	Preparation of cell extracts
SOD2	Enzo Life Sciences, Inc.	ADI-SOD-110-F	Primary antibody (1:1000)
Triton-X-100	Sigma-Aldrich, Inc.	X100	Western blots
Whatman #2 filter paper	GE Healthcare, Inc.	28317-241	Preparation of polyphenol extracts