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Resumen

Este trabajo detalla un método paso a paso para preparar extractos ricos en polifenoles de polvo de bayas liofilizadas. Además, proporciona una descripción completa de cómo usar estos extractos ricos en polifenoles en cultivo celular en presencia de la hormona peptídica angiotensina II (Ang II) usando células vasculares de músculo liso (VSMCs).

Resumen

Los estudios epidemiológicos indican que el aumento de la ingesta de flavonoides se correlaciona con la disminución de la mortalidad por enfermedades cardiovasculares (ECV) en los Estados Unidos y Europa. Las bayas son ampliamente consumidas en los EE.UU. y tienen un alto contenido polifenólico. Se ha demostrado que los polifenoles interactúan con muchos objetivos moleculares y ejercen numerosas funciones biológicas positivas, incluyendo efectos antioxidantes, antiinflamatorios y cardioprotectores. Los polifenoles aislados de mora (BL), frambuesa (RB) y frambuesa negra (BRB) reducen el estrés oxidativo y la senescencia celular en respuesta a angiotensina II (Ang II). Este trabajo proporciona una descripción detallada del protocolo utilizado para preparar los extractos de polifenoles de las bayas liofilizadas. Las extracciones de polifenoles de polvo de bayas liofilizadas se realizaron utilizando etanol acuoso al 80% y un método de extracción asistido por ultrasonidos. El extracto bruto se purificó adicionalmente y se fraccionó usando cloroformo y acetato de etilo,respectivamente. Los efectos de los extractos crudos y purificados se ensayaron en células musculares lisas vasculares (VSMC) en cultivo.

Introducción

Los polifenoles son compuestos que contienen al menos un anillo fenólico en su estructura y están abundantemente presentes en el reino vegetal 1 . Los seres humanos han estado consumiendo plantas durante milenios con fines medicinales sin ser conscientes de la existencia de tales compuestos 2 . Muchas frutas y verduras tienen algunos compuestos polifenólicos compartidos, aunque con diferentes cantidades, incluyendo flavonoides, estilbenos y ácidos fenólicos 3 . Aunque los polifenoles a menudo se asocian con frutas y verduras de colores, esto no es estrictamente cierto. Por ejemplo, la zeaxantina y la xantina están presentes en vegetales que no son muy coloridos, como la cebolla y el ajo, que provienen de la familia de los cebolletas y que están asociados con numerosos beneficios para la salud 4 . Aparte de estar asociado con varios beneficios para la salud [ 5] , polifenoles también sirven a las plantas mediante la protección de los insectos yD radiación ultravioleta 2 . Los polifenoles se encuentran comúnmente en la dieta humana y se consideran poderosos antioxidantes, ya que pueden eliminar especies reactivas de oxígeno (ROS) 6 , 7 , 8 . También tienen propiedades antiinflamatorias 9 , antimicrobianas 10 , antihipertensivas 11 y anti-carcinógenas 12 , 13 .

Los estudios epidemiológicos demuestran una asociación inversa entre el consumo de flavonoides y la incidencia de enfermedades cardiovasculares (ECV) 16 , 17 y mortalidad 14 , 15 . Las bayas son ampliamente consumidas en los EE.UU. y tienen altas cantidades de polifenoles, incluyendo flavonoides. Por ejemplo, el consumo de jugo de zarzamora (BL) (300 Ml / d) durante ocho semanas disminuyó significativamente la presión arterial sistólica en pacientes dislipidémicos 18 . Jeong et al. 19 informaron que los hombres y mujeres pre-hipertensos que consumían 2,5 g de extracto de frambuesa negra (BRB) por día tenían una presión sanguínea más baja de 24 h y de noche que los que consumían un placebo. Las frambuesas (RB) disminuyeron la presión arterial mientras aumentaban la expresión de superóxido dismutasa (SOD) en ratas espontáneamente hipertensas 20 . Recientemente se ha demostrado que BL, RB y BRB reducen los niveles de ROS y senescencia inducida por la angiotensina II (Ang II) en las células musculares lisas vasculares (VSMCs) [ 21] . Además, la fracción de antocianina del extracto BL redujo la expresión de la sintasa de óxido nítrico inducible (iNOS) e inhibió la actividad de Factor Nuclear kappa B (NF-κB) y de la quinasa regulada por señal extracelular (ERK) en estimulaciones de lipopolisacárido (LPS) Células J774Ass = "xref"> 22. Los extractos de BRB disminuyeron la expresión de la activación de NF-κB y la ciclooxigenasa 2 (COX-2) in vitro 23 , mejoraron el perfil lipídico y evitaron la formación de lesiones de aterosclerosis en ratones alimentados con una dieta rica en grasas 24 . Las antocianinas, que se consideran los flavonoides más abundantes en las bayas, modulan la respuesta inflamatoria en los macrófagos RAW 264.7 estimulados con LPS, disminuyendo la producción de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) 25 y disminuyendo la proliferación y migración de los VSMC 26 .

Dado que ha habido un creciente interés en la comprensión del papel de los polifenoles en la salud humana y la enfermedad, es importante optimizar el método de extracción. La extracción con disolvente es ampliamente utilizada para este propósito, ya que es rentable y fácilmente reproducible. En este estudio, se utilizó una extracción con disolvente con etanol, junto con una extracción asistida por ultrasonidoN, que fue adaptado de Kim y Lee [ 27] . La purificación y fraccionamiento de extractos brutos (CE) con cloroformo y acetato de etilo se realizaron para obtener la fracción de extracto purificado (PE) que fue adaptada de Queires et al . Además, se comparó la eficacia de los extractos de polifenoles crudos versus purificados de BL en la reducción de la fosforilación basal de ERK1 / 2, y se proporcionaron ejemplos representativos del efecto inhibidor del extracto de polifenol BL purificado en las reducciones de señalización inducidas por Ang II en VSMC.

Protocolo

1. Preparación de reactivos

  1. Preparar 80% de etanol (100 ml) mezclando 80 ml de etanol absoluto (grado de biología molecular) y 20 ml de agua estéril de grado de cultivo celular.
  2. Para preparar el extracto de polifenol (10 mg / ml), pese 10 mg de CE o PE. Añadir 1 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco simple (DMEM) bajo una campana de cultivo celular. Vórtice la solución. Alícuota en porciones de 200 μl y guarde a -20 ° C.
  3. Preparar buffer de lisis.
    1. Se añaden 5 ml de solución madre de HEPES 1 M (pH 7,4, final 50 mM), 1 ml de solución madre de NaCl 5 M (final 50 mM), 1 ml de solución madre EDTA 0,5 M (final 5 mM), 2 ml de solución madre 0,5 Solución madre NaF (final 10 mM), 286 μl de solución madre Na3VO4 700 mM (final 2 mM), 5 ml de solución madre Na 4 P 2 O 7 200 mM (final 10 mM) y 5 ml de solución madre Solución madre Triton-X-100 al 20% preparada en agua (1% final). Añadir agua para alcanzar un volumen de 100 ml. Mantener a 4 ° C.
    2. Agregar 10 μl / ml de cóctel inhibidor de proteasa. Añadir fresco cuando las células están listas para la lisis.
  4. Preparar el tampón de muestra Laemmli (4x).
    1. Se a~naden 31,25 ml de solución madre de Tris 2 M (pH 6,8), 100 ml de glicerol, 50 ml de una solución de sulfato sódico al 20% (SDS) preparada en agua y 50 ml de β-mercaptoetanol. Añada agua hasta 250 ml. Mantener a 4 ° C.
  5. Para preparar un tampón de solución salina tamponada con Tris (TBS), se pesan 3 g de Tris (25 mM final), 0,18 g de KCl (final 2,5 mM) y 8,76 g de NaCl (150 mM final). Ajustar el pH a 7,4 y agregar agua hasta 1 L. Mantener a temperatura ambiente.
  6. Para preparar TBS-T, añadir 997,5 ml de TBS y 2,5 ml de una solución de Triton-X-100 al 20% preparada en agua. Mantenga a temperatura ambiente.

2. Preparación de extractos de Blackerry

  1. Preparación de extracto bruto de polvo de bayas liofilizadas.
    1. Pesar 10 g de polvo de zarzamora liofilizado (o 5 g de polvo fresco). Si se usa fruta congelada, corteEn piezas muy pequeñas antes de comenzar la extracción.
    2. Mezclar el polvo de fruta con 100 ml de etanol acuoso al 80% en un matraz Erlenmeyer de fondo redondo de 1 L.
    3. Sonicar la mezcla durante 20 minutos a 42 kHz, 135 W usando un baño ultrasónico a 25 ° C, sin ningún intervalo de tiempo intermedio. Realizar la sonicación con purga continua de nitrógeno en luz tenue. Para frutas congeladas, aumente el tiempo de incubación a 4 h.
    4. Filtrar la mezcla a través de un papel de filtro # 2 usando un embudo de Buchner enfriado con succión al vacío.
      NOTA: Al final de este paso, los residuos de la muestra aparecen en el papel de filtro; Esto se llama pastel de filtro.
    5. Enjuague la torta del filtro con 50 ml de etanol al 100%. Se conserva el filtrado y se añade la torta de filtración a un matraz de fondo redondo de 1 L que contiene 100 ml de etanol acuoso al 80%.
    6. Repita el proceso de extracción del residuo (pasos 2.1.2 - 2.1.4).
    7. Se combinan los dos filtrados en un matraz de fondo redondo con 50 ml adicionalesDe etanol acuoso al 80%.
      NOTA: El volumen final debe ser de aproximadamente 300 mL.
    8. Utilizar un evaporador rotatorio a 62 ° C y 50 rpm para evaporar el disolvente. Continúe este proceso hasta que el etanol no se evapore más.
      NOTA: Este proceso dura aproximadamente 45 min.
    9. Transferir la muestra a un tubo cónico de 50 ml. Evaporar el etanol inyectando gas nitrógeno en la parte superior del tubo durante 10 min.
      NOTA: Este paso es necesario para asegurar la completa evaporación del etanol. El volumen de la muestra en este paso es de aproximadamente 20 ml.
    10. Congelar la muestra a -80 ° C durante al menos 24 h.
      NOTA: Este paso es necesario para permitir un proceso de liofilización más eficiente.
    11. Se liofiliza la muestra a -50 ° C durante aproximadamente 8 h. Almacenar las muestras a -20 ° C.
      NOTA: El secador por congelación crea un vacío potente a -50 ° C dentro de la cámara para secar las muestras pero conserva la mayoría de los compuestos, tales como polipheNols.
  2. Preparación de extractos purificados de polifenoles a partir de extractos crudos.
    1. Pesar las muestras extraídas liofilizadas.
      NOTA: El volumen del extracto en este paso es de aproximadamente 10 ml.
    2. Añadir dos volúmenes (~ 20 ml) de cloroformo al extracto bruto y agitar la solución durante 5 min en una placa de agitación.
    3. Vierta la mezcla en un embudo de separación. Dejar decantar el extracto en bruto durante 1 h a RT para obtener la fracción purificada.
      NOTA: En este paso, se formará una mezcla de dos fases.
    4. Deseche la capa inferior (fase de cloroformo) del embudo de separación y recoja la capa acuosa en un vaso de precipitados limpio.
    5. Añadir dos volúmenes de acetato de etilo a la fracción acuosa y utilizar una barra de agitación magnética para agitar la mezcla durante 5 minutos a TA.
    6. Filtrar la mezcla a través de papel de filtro # 2 usando un embudo Buchner enfriado con succión al vacío.
    7. Recoger la muestra filtrada y transferirla a un matraz de fondo redondo para ser nosotrosCon el evaporador rotatorio.
    8. Ajustar el evaporador rotatorio a 62 ° C y 50 rpm y evaporar el acetato de etilo durante aproximadamente 30 min.
    9. Se liofiliza la muestra a -50 ° C durante aproximadamente 8 h. Transferir la muestra a un tubo cónico de 50 ml y almacenarla a -20 ° C.

3. Tratamiento de VSMC con extractos de Berry

  1. Cultura de VSMCs.
    1. Aislar VSMCs de las aortas torácicas de ratas Sprague-Dawley mediante la realización de una digestión enzimática, como se describe anteriormente [ 29] . Cultivo de los VSMCs como se describe 29 .
    2. Preparar el medio completo para el cultivo de VSMC utilizando DMEM que contenga 1 g / l de glucosa y suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina. Almacene el medio completo a 4 ° C.
  2. Incubación de VSMC con extractos de polifenoles.
    1. Para dividir el VSMCs, descarte el cultuRe medio y lavar las células dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir 4 ml de PBS y 2 ml de tripsina EDTA 0,25%. Incubar las células durante 5 min a 37 ° C en una incubadora de CO 2 .
      1. Recoger las células, mezclarlas con 2 ml de medio completo en un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar a 1.100 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular con 1 mL de PBS. Cuente las células usando un hemocitómetro.
      2. Sembrar 50.000 VSMC por pocillo en placas de cultivo de 6 pocillos y cultivarlas en medio completo que contenga FBS al 10% hasta que alcancen una confluencia del 90% (aproximadamente 3 días). Mantener los VSMCs a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% humidificada.
    2. Preparar el medio para el tratamiento utilizando medio DMEM que contenga 1 g / l de glucosa, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina y 0,5% de FBS. Almacene el medio de tratamiento a 4 ° C.
      NOTA: Los extractos de polifenoles y Ang II se añaden directamente a las células usando este meDium
    3. Preparar una solución madre de 10 mg / ml de Extracto Crudo (CE) o Extracto Purificado (PE) de polifenoles disolviendo 10 mg de extracto en 1 ml de medio DMEM simple. Conservar el stock en alícuotas de 200 μL a -20 ° C.
    4. Incubar los VSMCs con 2 mL de medio de tratamiento que contiene 0,5% de FBS y agregar extractos de CE o PE para lograr una concentración de 50-500 μg / mL. Cambiar el medio cada 24 h añadiendo extractos frescos de polifenoles. Tratar las células durante 3 d.
    5. Para el tratamiento con Ang II u otras hormonas y factores de crecimiento, mueren de hambre las células durante al menos 24 h incubando las células con medio de tratamiento que contiene 0,5% de FBS antes de la adición de Ang II (100 nM).
      NOTA: Incubación con y sin CE y PE en medio de tratamiento con FBS al 0,5% antes de que se recomiende la adición de Ang II.
      1. Después de 24 h de inanición, añadir 100 nM Ang II. Reemplace el medio de tratamiento con CE, PE, o Ang II fresco cada 24 h durante 3 d.
  3. Preparación de muestras de células.
    1. Lavar las células tratadas dos veces en PBS frío y lisarlas con 200 μl de tampón de lisis sobre hielo.
    2. Recoger lisados ​​celulares utilizando raspadores de células y transferir los lisados ​​a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar los lisados ​​celulares totales durante 20 min en hielo y vórtice cada 5 min.
    3. Sonicar los extractos celulares con tres ráfagas a 125 W durante 10 s cada uno, con una pausa de 2 s entre. Mantenga las muestras en hielo durante la sonicación.
    4. Mida la concentración de proteína usando un reactivo de ensayo de proteína a 595 nm.
    5. Almacenar las muestras a -20 ° C para su análisis por Western blot.
  4. Western blot.
    1. Se mezclan cantidades iguales de proteína (aproximadamente 50 μg) de las muestras tratadas no tratadas y tratadas con polifenoles o Ang II con tampón de lisis para obtener un volumen total máximo de 50 μl. Añadir 16 μl de un tampón de muestra Laemmli 4x. Calentar las muestras durante 5 min a 75 ° C.
    2. Separar la muestraEn geles de SDS-PAGE al 10% y transferirlos a membranas de PDVF a 10 V durante 75 min en un sistema de transferencia semi-seco para análisis Western blot con anticuerpos específicos.
    3. Bloquear la membrana con 2% de leche en TBS 0,05% de tampón Triton-X100 (TBS-T) durante 20 min.
    4. Eliminar la leche lavando la membrana al menos tres veces con TBS (5 min cada uno) e incubar con anticuerpos primarios durante 1 h a RT o O / N a 4 ° C.
    5. Lavar la membrana tres veces, 10 min cada una, con TBS-T e incubar con un anticuerpo secundario ligado a HRP durante 45 min.
    6. Lavar la membrana tres veces, 10 min cada una, con TBS-T y desarrollar mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL).

Resultados

Se ha demostrado previamente que los extractos de polifenoles aislados de BL, RB y BRB reducían la senescencia de VSMCs en respuesta a Ang II 21 . Se ha demostrado que estos extractos de polifenoles purificados modulan la señalización de Ang II mediante la reducción de la fosforilación de Akt, p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK), y ERK1 / 2. BL previene la senescencia al reducir la expresión de la NADPH oxidasa (Nox) 1, una enzima que produce aniones...

Discusión

Los polifenoles aislados de bayas contienen composiciones distintas. El protocolo de extracción a base de etanol descrito aquí permitió la identificación de diferentes niveles de ácidos fenólicos y flavonoides presentes en los extractos de polifenoles crudos y purificados de BL ( Tabla 1 ). CE se enriqueció en ácido gálico, ácido ferúlico, ácido 4-O-cafeoilquínico y ácido 5-O-cafeoilquínico. El proceso de purificación no alteró significativamente los niveles de ácido gálico y ácido p...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Asociación Americana del Corazón (14GRNT20180028) y el Consejo de Investigación y Creatividad de la Universidad Estatal de Florida (COFRS).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Angiotensin IISigma-Aldrich, Inc.A9525-10MGTreatment of VSMCs
β-actinSigma-Aldrich, Inc.A2228Primary antibody (1:5000)
Blackberry fruitMercer FoodsFreeze-dried blackberry powder
Catalase Calbiochem219010Primary antibody (1:1000)
ChloroformBiotech Grd, Inc.97064-678Preparation of purified polyphenol extracts
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM )Mediatech, Inc.10-014-CVCulture of VSMCs
Ethanol (absolute molecular biology grade)Sigma-Aldrich, Inc.E7023-500MLPreparation of polyphenol extracts 
EthylacetateSigma-Aldrich, Inc.439169Preparation of purified polyphenol extracts
ERK1/2Cell Signaling Technology, Inc.9102SPrimary antibody (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0Teknova, Inc.E0306Lysis buffer
Freeze-DryerLabconcoVirTis Benchtop KPreparation of polyphenol extracts
Fetal Bovine Serum (FBS)Seradigm1400-500Cell culture
HEPESSigma-Aldrich, Inc.H3375Lysis buffer 
NaClEMD Millipore, Inc.7760Lysis buffer
NaFJ.T.Baker, Inc.3688-01 Lysis buffer
Na3VO4Sigma-Aldrich, Inc.450243Lysis buffer
Na4P2O7 , decahydrateSigma-Aldrich, Inc.S-9515Lysis buffer
phospho ERK1/2 Cell Signaling Technology, Inc.9101SPrimary antibody (1:1000)
Protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich, Inc.P8340-5mlLysis buffer
Protein assay dye reagentBio-Rad Laboratories, Inc.500-0006Protein concentration Measurement
PVDF transfer membraneThermo Scientific, Inc.88518Western blots
Rotatory EvaporatorBuchi LabortechnikRotavapor
R3000		Preparation of polyphenol extracts
Sterile waterMediatech, Inc.25-055-CVPreparation of polyphenol extracts
SonicatorQSonica, LLCQ125Preparation of cell extracts
SOD2Enzo Life Sciences, Inc.ADI-SOD-110-FPrimary antibody (1:1000)
Triton-X-100Sigma-Aldrich, Inc.X100Western blots
Whatman #2 filter paperGE Healthcare, Inc.28317-241Preparation of polyphenol extracts

Referencias

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