血管平滑筋細胞の処理のための凍結乾燥ベリー粉末からのポリフェノールの抽出および精製<em&gt;インビトロ</em

要約

この作品は、凍結乾燥したベリーパウダーからポリフェノールが豊富な抽出物を調製するための段階的な方法を詳述しています。さらに、血管平滑筋細胞（VSMCs）を用いたペプチドホルモンアンギオテンシンII（Ang II）の存在下で、これらのポリフェノールに富む抽出物を細胞培養においてどのように使用するかについての完全な記述を提供する。

要約

疫学研究によると、フラボノイドの摂取量の増加は、米国および欧州における心血管疾患（CVD）による死亡率の減少と相関しています。ベリーは米国で広く消費されており、ポリフェノール含有量が高い。ポリフェノールは、多くの分子標的と相互作用し、抗酸化剤、抗炎症剤、および心臓保護作用を含む多くの陽性の生物学的機能を発揮することが示されている。ブラックベリー（BL）、ラズベリー（RB）およびブラックラズベリー（BRB）から単離されたポリフェノールは、アンジオテンシンII（Ang II）に応答する酸化ストレスおよび細胞老化を減少させる。この研究は、凍結乾燥果実からポリフェノール抽出物を調製するために使用されるプロトコルの詳細な説明を提供する。凍結乾燥したベリー粉末からのポリフェノール抽出は、80％水性エタノールおよび超音波補助抽出法を用いて行った。粗抽出物をさらに精製し、クロロホルムおよび酢酸エチルを用いて分画し、それぞれ、粗抽出物および精製抽出物の両方の効果を培養物中の血管平滑筋細胞（VSMC）で試験した。

概要

ポリフェノールは、その構造中に少なくとも1つのフェノール環を含む化合物であり、植物界^1に多量に存在する。人間は、そのような化合物の存在を意識することなく、何千年もの薬用植物を摂取してきた² 。多くの果物と野菜には、フラボノイド、スチルベン、フェノール酸などの異なる量であるにもかかわらず、いくつかの共有ポリフェノール化合物があります。ポリフェノールはしばしばカラフルな果物や野菜と関連していますが、これは厳密には当てはまりません。例えば、ゼアキサンチンやキサンチンは、タマネギやニンニクなど、カリカリではない野菜に含まれています。これらは、スカリオンの家族に由来し、数多くの健康上の利点に関連しています⁴ 。ポリフェノールは、いくつかの健康上の利益に関連するほか、植物を昆虫から保護して、d紫外線² 。ポリフェノールは人間の食生活によく見られ、反応性酸素種（ROS）6,7,8を取り除くことができるため、強力な抗酸化物質と考えられています。また、抗炎症剤⁹ 、抗菌剤¹⁰ 、抗高血圧剤¹¹ 、および抗発癌性^12,13の特性を有する。

疫学研究は、フラボノイドの摂取と心血管疾患（CVD）の発生率^16,17および死亡率^14,15との間に逆相関があることを示している。ベリーは米国で広く消費されており、フラボノイドを含む多量のポリフェノールを含有している。例えば、ブラックベリー（BL）ジュース（300 mL / d）を8週間投与すると、異脂肪血症患者の収縮期血圧が有意に低下した¹⁸ 。 Jeong ら ¹⁹人は、1日に2.5gのブラックラズベリー（BRB）抽出物を消費する高血圧前の男性および女性が、プラセボを摂取する人々と比較して、24時間および夜間の血圧が低いことを報告した。ラズベリー（RB）は血圧を低下させ、一方、自然発症高血圧ラットではスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）の発現を増加させる²⁰ 。最近、BL、RB、およびBRBは、血管平滑筋細胞（VSMC） ²¹におけるアンジオテンシンII（Ang II）によって誘導されるROSおよび老化のレベルを低下させることが示されている²¹ 。さらに、BL抽出物からのアントシアニン画分は、誘導性酸化窒素シンターゼ（iNOS）の発現を減少させ、リポ多糖（LPS）刺激における核因子κB（NF-κB）および細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）の活性を阻害したJ774細胞ass = "xref"> 22。 BRB抽出物は、高脂肪食餌を与えたマウスのNF-κB活性化およびシクロオキシゲナーゼ2（COX-2）発現をインビトロで低下させ、脂質プロファイルを改善し、アテローム性動脈硬化病変を形成しなかった²⁴ 。ベリーにおける最も豊富なフラボノイドと考えられているアントシアニンは、腫瘍壊死因子α（TNF-α）産生を低下させ、VSMCの増殖および遊走を減少させることにより、LPS刺激RAW 264.7マクロファージにおける炎症応答を調節する。

ヒトの健康と疾病におけるポリフェノールの役割を理解することへの関心が高まっているので、抽出方法を最適化することが重要である。溶媒抽出は、費用効果が高く容易に再現可能であるため、その目的で広く使用されている。この研究では、エタノールを用いて溶媒抽出を行い、超音波補助抽出物この方法は、KimとLeeの手法を応用したものである²⁷ 。クロロホルムおよび酢酸エチルを用いる粗抽出物（CE）の精製および分画を実施して、Queires ら ²⁸から適合された精製抽出物（PE）画分を得た。さらに、BL由来の精製されたポリフェノール抽出物とERK1 / 2の基礎的なリン酸化を減少させるBLの精製されたポリフェノール抽出物との効果を比較し、精製されたBLポリフェノール抽出物のAng II誘発性VSMCsの抑制効果の代表例を提供した。

プロトコル

1.試薬の調製

1. 80mLの無水エタノール（分子生物学グレード）80mLと細胞培養グレードの滅菌水20mLを混合して80％エタノール（100mL）を調製する。
2. ポリフェノール抽出物（10mg / mL）を調製するには、CEまたはPEを10mg計量する。細胞培養フードの下にプレーンダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）1mLを加える。溶液をボルテックスする。 200μLずつ分注し、-20℃で保存します。
3. 溶解緩衝液を調製する。
   1. 1M HEPESストック溶液（pH 7.4;最終50mM）5mL、5M NaClストック溶液（50mM最終）、1mLの0.5M EDTAストック溶液（5mM最終）、2mLの0.5 M NaFストック溶液（最終10mM）、700mM Na ₃ VO ₄ストック溶液（2mM最終）286μL、200mM Na ₄ P ₂ O ₇ストック溶液（10mM最終）5mL、および5mLの水中で調製した20％Triton-X-100ストック溶液（最終濃度1％）。水を加えて100mLの容量にする。 4℃で保存してください。
4. Laemmliサンプルバッファー（4x）を調製する。
   1. 2Mトリスストック溶液（pH6.8）31.25mL、グリセロール100mL、水中で調製した20％硫酸ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）溶液50mLおよびβ-メルカプトエタノール50mLを添加する。 250 mLまでの水を加える。 4℃で保存してください。
5. トリス緩衝生理食塩水（TBS）緩衝液を調製するために、トリス（最終25mM）3g、KCl（最終2.5mM）0.18g、およびNaCl 8.76g（最終150mM）を秤量する。 pHを7.4に調整し、水を1Lまで加えます。室温に保ちます。
6. TBS-Tを調製するために、99.7.5mLのTBSおよび2.5mLの20％Triton-X-100溶液を水中で調製する。 RTを維持してください。

2.ブラックリー抽出物の調製

1. 凍結乾燥したベリー粉末からの粗抽出物の調製。
   1. 凍結乾燥したブラックベリー粉末（または5gの新鮮な粉末）10gを秤量する。冷凍果実を使用する場合は、それをカット抽出を開始する前に非常に小さな断片に。
   2. 1L丸底三角フラスコ中で100％の80％水性エタノールと果汁を混合する。
   3. 混合物を、42kHzで20分間、25℃で超音波浴を使用して135Wで、時間間隔なしで超音波処理する。抑圧された光で連続窒素パージを行って超音波処理を行います。凍結果実の場合、インキュベーション時間を4時間に増加させます。
   4. 冷却吸引したブフナー漏斗を用いて＃2濾紙を通して混合物を濾過し、真空吸引する。
      注：このステップの終わりに、サンプルの残留物がろ紙に現れます。これはフィルターケーキと呼ばれています。
   5. フィルターケーキを50mLの100％エタノールですすぐ。濾液を保存し、80％水性エタノール100mLを含む1L丸底フラスコにフィルターケーキを加える。
   6. 残留物の抽出プロセスを繰り返す（ステップ2.1.2〜2.1.4）。
   7. 2つの濾液を丸底フラスコに合わせ、追加の50mLの80％エタノール水溶液で洗浄した。
      注：最終容量は約300 mLにする必要があります。
   8. ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させます（62℃、50rpm）。エタノールがもはや蒸発しなくなるまで、このプロセスを続ける。
      注：このプロセスには約45分かかります。
   9. 試料を50 mLコニカルチューブに移す。窒素ガスをチューブの頂部に10分間注入することによってエタノールを蒸発させる。
      注：このステップはエタノールの完全な蒸発を確実にするために必要です。この段階での試料の容量は約20mLである。
   10. -80℃で少なくとも24時間凍結する。
       注：このステップは、より効率的な凍結乾燥プロセスを可能にするために必要です。
   11. -50℃で約8時間凍結乾燥します。試料を-20℃で保存する。
       注：凍結乾燥機は、試料を乾燥させるためにチャンバー内に-50℃で強力な真空を作りますが、ポリフェフのような化合物のほとんどを保存しますnols。
2. 粗抽出物からの精製ポリフェノール抽出物の調製。
   1. 凍結乾燥した抽出サンプルを秤量する。
      注：この段階での抽出物の容量は約10mLです。
   2. 2倍量（約20mL）のクロロホルムを粗抽出物に加え、撹拌プレート中で5分間溶液を振とうする。
   3. 混合物を分液漏斗に注いだ。粗抽出物をRTで1時間デカントし、精製画分を得る。
      注：この段階では、2相混合物が形成されます。
   4. 分液漏斗から底部層（クロロホルム相）を捨て、水層を清浄なビーカーに集める。
   5. 水性画分に2倍量の酢酸エチルを加え、マグネチックスターラーバーを用いて混合物を室温で5分間撹拌する。
   6. 冷却吸引したブフナー漏斗を用いて＃2濾紙を通して混合物を濾過し、真空吸引する。
   7. ろ過されたサンプルを集め、丸底フラスコに移して私達になるロータリーエバポレーターで処理した。
   8. 回転蒸発器を62℃および50rpmに設定し、酢酸エチルを約30分間蒸発させる。
   9. -50℃で約8時間凍結乾燥します。試料を50 mLコニカルチューブに移し、-20°Cで保存する。

3.ベリー抽出物によるVSMCの処理

1. VSMC培養物。
   1. 前述の^29のように、酵素消化を行うことにより、Sprague-Dawleyラットの胸部大動脈からVSMCを単離する。説明したようにVSMCを培養する²⁹ 。
   2. 10％ウシ胎仔血清（FBS）、100U / mLペニシリン、100mg / mLストレプトマイシンおよび2mM L-グルタミンを補充した1g / Lグルコースを含むDMEMを用いてVSMCの培養のための完全培地を調製する。完全培地を4℃で保存する。
2. VSMCsとポリフェノール抽出物のインキュベーション。
   1. VSMCを分割するには、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を2回洗浄する。 4mLのPBSおよび2mLのトリプシンEDTA 0.25％を添加する。 CO ₂インキュベーター内で37℃で5分間細胞をインキュベートする。
      1. 細胞を回収し、15mLの遠心分離管内で2mLの完全培地と混合し、1,100×gで5分間遠心分離する。上清を捨て、1mLのPBSで細胞ペレットを再懸濁する。血球計数器を用いて細胞を数える。
      2. 6ウェル培養プレート中に1ウェルあたり50,000個のVSMCを播種し、10％FBSを含む完全培地中でそれらが90％コンフルエンシー（約3日）に達するまで増殖させる。加湿5％CO ₂インキュベーター内で37℃でVSMCを維持する。
   2. 1g / Lのグルコース、100U / mLのペニシリン、100mg / mLのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、および0.5％のFBSを含むDMEM培地を用いた処理のための培地を調製する。処理培地は4℃​​で保存する。
      注：ポリフェノール抽出物とAng IIをこの細胞を用いて細胞に直接加えるジウム。
   3. 10mgの抽出物を1mLのプレーンDMEM培地に溶解することにより、10mg / mL粗抽出物（CE）またはポリフェノールの精製抽出物（PE）のストック溶液を調製する。 -20℃で200μLに分注してください。
   4. VSMCを0.5％FBSを含む処理培地2 mLとインキュベートし、CEまたはPE抽出物を加えて50〜500μg/ mLの濃度にする。新鮮なポリフェノール抽出物を添加して24時間ごとに培地を交換する。細胞を3日間処理する。
   5. Ang IIまたは他のホルモンおよび増殖因子での処置のために、Ang II（100nM）の添加前に0.5％FBSを含む処理培地で細胞をインキュベートすることにより、細胞を少なくとも24時間飢えさせる。
      注：Ang IIを添加する前に、0.5％FBS処理培地中でCEおよびPEを添加した場合と添加しない場合のインキュベーションを推奨します。
      1. 飢餓の24時間後、100nMのAng IIを加える。新鮮なCE、PE、またはAng IIで24時間ごとに3日間処置培地を交換する。
3. 細胞試料の調製。
   1. 冷PBSで処理した細胞を2回洗浄し、氷上で200μLの溶解緩衝液でそれらを溶解する。
   2. 細胞スクレイパーを使用して細胞溶解物を収集し、溶解物を1.5mLマイクロ遠心チューブに移す。全細胞溶解物を氷上で20分間インキュベートし、5分毎にボルテックスする。
   3. その間に2秒間休止させながら、細胞抽出物を125Wで3回バーストして10秒ずつ超音波処理する。超音波処理の間、サンプルを氷上に置いておきます。
   4. 595nmでタンパク質アッセイ試薬を用いてタンパク質濃度を測定する。
   5. ウエスタンブロットによる分析のためにサンプルを-20℃で保存する。
4. ウエスタンブロット。
   1. 対照未処理およびポリフェノール処理サンプルまたはAng II処理サンプルから等量のタンパク質（約50μg）を溶解緩衝液で混合して、最大総量50μLを得る。 16μLの4倍Laemmliサンプルバッファーを添加する。試料を75℃で5分間加熱する。
   2. サンプルを分離する10％SDS-PAGEゲル中でインキュベートし、そして特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析のために半乾式トランスファーシステムで10Vで75分間PDVFメンブレンに移す。
   3. TBS 0.05％Triton-X100緩衝液（TBS-T）中2％ミルクで膜を20分間ブロックする。
   4. 膜をTBS（各5分）で少なくとも3回洗浄することによってミルクを除去し、4℃で1時間、一次抗体と共に室温またはO / Nでインキュベートする。
   5. 膜をTBS-Tで3回、それぞれ10分間洗浄し、HRP結合二次抗体と共に45分間インキュベートする。
   6. 膜をTBS-Tで3回、各10分間洗浄し、増強化学発光（ECL）によって発色させる。

結果

BL、RBおよびBRBから単離されたポリフェノール抽出物は、Ang II ²¹に応答するVSMCの老化を減少させることが以前に示されている。これらの精製ポリフェノール抽出物は、Akt、p38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）、およびERK1 / 2のリン酸化を減少させることによってAng IIシグナル伝達を調節することが示されている。 BLは、スーパーオキシ?...

ディスカッション

ベリーから単離されたポリフェノールは、明確な組成物を含有する。本明細書に記載のエタノールベースの抽出プロトコールは、BLの粗製および精製ポリフェノール抽出物中に存在する種々のレベルのフェノール酸およびフラボノイドの同定を可能にした（ 表1 ）。 CEは没食子酸、フェルラ酸、4-O-カフェオイルキナ酸、5-O-カフェオイルキナ酸に富んだ。精製プロセスは、没食子?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiotensin II	Sigma-Aldrich, Inc.	A9525-10MG	Treatment of VSMCs
β-actin	Sigma-Aldrich, Inc.	A2228	Primary antibody (1:5000)
Blackberry fruit	Mercer Foods		Freeze-dried blackberry powder
Catalase	Calbiochem	219010	Primary antibody (1:1000)
Chloroform	Biotech Grd, Inc.	97064-678	Preparation of purified polyphenol extracts
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM )	Mediatech, Inc.	10-014-CV	Culture of VSMCs
Ethanol (absolute molecular biology grade)	Sigma-Aldrich, Inc.	E7023-500ML	Preparation of polyphenol extracts
Ethylacetate	Sigma-Aldrich, Inc.	439169	Preparation of purified polyphenol extracts
ERK1/2	Cell Signaling Technology, Inc.	9102S	Primary antibody (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0	Teknova, Inc.	E0306	Lysis buffer
Freeze-Dryer	Labconco	VirTis Benchtop K	Preparation of polyphenol extracts
Fetal Bovine Serum (FBS)	Seradigm	1400-500	Cell culture
HEPES	Sigma-Aldrich, Inc.	H3375	Lysis buffer
NaCl	EMD Millipore, Inc.	7760	Lysis buffer
NaF	J.T.Baker, Inc.	3688-01	Lysis buffer
Na3VO4	Sigma-Aldrich, Inc.	450243	Lysis buffer
Na4P2O7 , decahydrate	Sigma-Aldrich, Inc.	S-9515	Lysis buffer
phospho ERK1/2	Cell Signaling Technology, Inc.	9101S	Primary antibody (1:1000)
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich, Inc.	P8340-5ml	Lysis buffer
Protein assay dye reagent	Bio-Rad Laboratories, Inc.	500-0006	Protein concentration Measurement
PVDF transfer membrane	Thermo Scientific, Inc.	88518	Western blots
Rotatory Evaporator	Buchi Labortechnik	Rotavapor R3000	Preparation of polyphenol extracts
Sterile water	Mediatech, Inc.	25-055-CV	Preparation of polyphenol extracts
Sonicator	QSonica, LLC	Q125	Preparation of cell extracts
SOD2	Enzo Life Sciences, Inc.	ADI-SOD-110-F	Primary antibody (1:1000)
Triton-X-100	Sigma-Aldrich, Inc.	X100	Western blots
Whatman #2 filter paper	GE Healthcare, Inc.	28317-241	Preparation of polyphenol extracts