نقل الغدة الثديية تشكيل القدرة بين الخلايا الظهارية الثديية القاعدية والخلايا اللمعية الثديية عن طريق الحويصلات خارج الخلية / إكسوسوميس

Summary

يصف هذا البروتوكول طرق لتنقية، كوانتيتاتينغ، وتوصيف الحويصلات خارج الخلية (إيفس) / إكسوسوميس من غير ملتصقة / الوسيطة الخلايا الظهارية الثديية واستخدامها لنقل الثديية تشكيل الغدة القدرة على الخلايا الطلائية الثديية اللمعية. إيف / إكسوسوميس المستمدة من الخلايا الظهارية الثديية الجذعية يمكن نقل هذه الخاصية الخلية إلى الخلايا التي تستوعب إيفس / إكسوسوميس.

Abstract

يمكن للخلايا التواصل عبر إكسوسوميس، ~ 100 نانومتر الحويصلات خارج الخلية (إيفس) التي تحتوي على البروتينات والدهون، والأحماض النووية. غير ملتصقة / ميسينشيمال الخلايا الظهارية الثديية (ناميك) الحويصلات خارج الخلية -edived يمكن عزلها من وسط ناميك عن طريق التفريغ التفاضلي التفاضلي. استنادا إلى كثافتها، يمكن تنقية المركبات الكهربائية عن طريق التنبيذ الفائق في 110،000 x ز. يمكن فصل إعداد إيف من التنبيذ الفائق باستخدام التدرج الكثافة المستمر لمنع التلوث مع البروتينات القابلة للذوبان. ويمكن بعد ذلك تقييمها مرة أخرى إيفس تنقية باستخدام تحليل الجسيمات متناهية الصغر تتبع، والذي يقيس حجم وعدد من الحويصلات في إعداد. الحويصلات خارج الخلية مع حجم يتراوح بين 50 إلى 150 نانومتر هي إكسوسوميس. يمكن تناولها إيفس المستمدة / إكسوسوميس الخلايا الظهارية الثديية، والتي يمكن قياسها عن طريق التدفق الخلوي والمجهر متحد البؤر. بعض خصائص الخلايا الجذعية الثديية (على سبيل المثال، القدرة على تشكيل الغدة الثديية) يمكنيتم نقلها من ناميس مثل الجذعية للخلايا الظهارية الثديية عن طريق إيفس المستمدة من إيفس / إكسوسوميس. عزل إبكام ^مرحبا / CD49f ^لو الخلايا الطلائية الثديية اللمعية لا يمكن أن تشكل الغدد الثديية بعد زرعها في منصات الدهون الماوس، في حين إبكام ^لو / CD49f ^مرحبا الخلايا القاعدية الثديية القاعدية تشكل الغدد الثديية بعد زرع. امتصاص نامس المستمدة من ناميك / إكسوسوميس من قبل إبكام ^مرحبا / CD49f ^لو الخلايا الظهارية الثديية اللمعية يسمح لهم لتوليد الغدد الثديية بعد زرعها في منصات الدهون. و إيفس / إكسوسوميس المستمدة من الجذعية مثل الخلايا الظهارية الثديية نقل الثديية تشكيل الغدة القدرة على إبكام ^مرحبا / CD49f ^لو الخلايا اللمعية الظهارية الثديية.

Introduction

إكسوسوميس يمكن أن توسط الاتصالات الخلوية عن طريق نقل الغشاء والبروتينات عصاري خلوي، والدهون، و رناز بين الخلايا ¹ . وقد أثبتت الاتصالات بوساطة إكسوسوم أن تشارك في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية ( أي عرض المستضد، وتطوير التسامح ² ، وتطور الورم ³ ). إكسوسوميس غالبا ما يكون محتويات مماثلة لتلك التي من الخلايا المصدر الإفراج عنهم. وهكذا، يمكن لل إكسوسوميس تحمل خصائص خلية محددة من الخلايا المصدر ونقل هذه الخصائص إلى الخلايا التي تطعمها ⁴ .

إكسوسوميس هي حويصلات غشاء طبقة مزدوجة من 50 إلى 150 نانومتر وتقدم علامات محددة (على سبيل المثال، CD9، CD81، CD63، HSP70، أليكس، و TSG101). وبالتالي، يجب أن تتميز إكسوسوميس بطرق مختلفة لجوانب مختلفة. يمكن استخدام المجهر الإلكتروني للإرسال لتصور الحويصلات الغشاءمثل إكسوسوميس ^{4 ، 5} . ويستخدم تحليل تتبع الجسيمات النانوية (نتا) وتحليل ديناميكي نثر الضوء (دلس) لقياس حجم وعدد من إكسوسوميس المنقى ⁴ . ويمكن التحقق من محتوى غشاء الدهون من إكسوسوميس من قبل التدرج الكثافة. علامات إكسوسومال، مثل CD9، CD81، CD63، HSP70، أليكس، و TSG101 ^{6 ، 7} ، يمكن قياسها بواسطة النشاف الغربية.

الخلايا القاعدية الثديية لديها القدرة على توليد الغدد الثديية عند زرعها في منصات الدهون، في حين أن الخلايا اللمعية لا يمكن ^{8 ، 9 ، 10} . وبالتالي، الخلايا القاعدية الثديية يشار إليها أيضا وحدات إعادة الثديية. باستخدام نموذج الخلايا القاعدية والخلايا اللمعية، يمكن فحص قدرة إيف / إكسوسوميس لنقل خصائص الخلية بين السكان خلية مختلفة. هذا العمليوضح طريقة نقل القدرة تشكيل الغدة من الخلايا الظهارية القاعدية الثديية إلى الخلايا الظهارية اللمعية الثديية باستخدام إيف / إكسوسوميس المستمدة من الخلايا الظهارية القاعدية الثديية. اكتسبت الخلايا الظهارية الثديية اللمعية خصائص الخلايا القاعدية بعد ابتلاع إيفس / إكسوسوميس يفرز من الخلايا القاعدية ويمكن بعد ذلك تشكيل الغدد الثديية ⁴ .

Protocol

جميع البحوث التي تنطوي على الحيوانات تمتثل للبروتوكولات التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية للرعاية الحيوانية.

1. خارج الخلية حويصلة / إكسوسوم العزلة والتحقق من الصحة

1. ثقافة الثديية الخلايا القاعدية الظهارية، نامكس ⁴ ، مع الطازجة، المتوسطة خالية من مصل مصنوعة من 500 مل من مدب 170، ودرجة الحموضة 7.4 + 500 مل من دمم / F12 مع بيكربونات الصوديوم (0.2438٪). إغف (5 نانوغرام / مل)؛ هدروكوريتيسون (0.5 ميكروغرام / مل)؛ الأنسولين (5 ميكروغرام / مل)؛ خلاصة النخامية البقرية (بب؛ 35 ميكروغرام / مل)؛ و GW627368X (1 ميكروغرام / مل) في 15 سم الأطباق.
2. بعد عد الخلايا مع عدادة الكريات، البذور 1.2 × 10 ⁶ خلايا في 12 مل من المتوسطة لكل طبق 15 سم في اليوم 0 لمدة 4 أيام ⁴ .
3. بعد 4 أيام في الثقافة، أجهزة الطرد المركزي في وسط الثقافة في 300 x ج لمدة 5 دقائق باستخدام الطرد المركزي الجدول الأعلى. نقل طاف إلى أنبوب مخروطي الشكل ( الشكل 1 ).
4. الطرد المركزي طاففي 2000 x ج لمدة 20 دقيقة في الطرد المركزي الجدول الأعلى. نقل طاف إلى أنبوب نابذة فائقة السرعة وترك الخلايا الميتة والحطام الخلية ( الشكل 1 ).
5. الطرد المركزي طاف في 10،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل طاف إلى أنبوب نابذة فائقة السرعة ( الشكل 1 ).
6. الطرد المركزي طاف في 110،000 x ج لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و ريسوسبيند بيليه إيف / إكسوسوم في برنامج تلفزيوني ( الشكل 1 ).
7. الطرد المركزي طاف في 110،000 x ج لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف. ريسوسبيند إيف / إكسوسوم بيليه في برنامج تلفزيوني ( الشكل 1 ). ريسوسبيند بيليه معزولة من 240-480 مل من ناميك مكيفة مكيفة في 100 ميكرولتر.
8. قياس تركيز البروتين من تعليق إيف مع فحص البروتين بكا. تأكد من أن تركيز حوالي 20-40 ميكروغرام / 100 ميكرولتر. مخزن في -20 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
9. قياس تركيز وحجم إيفس / إكسوسوميس عن طريق تحليل تتبع الجسيمات متناهية الصغر (نتا)، كما وصفها سابقا غاردينر وآخرون. ^{11 -} تمييع إيفس / إكسوسوميس (20 ميكروغرام / 100 ميكرولتر) مع برنامج تلفزيوني إلى 10،000 أضعاف لتحليل نتا.
   ملاحظة: نتيجة تحليل نتا يعكس عدد وحجم الحويصلات تحليلها.
10. صورة إيفس / إكسوسوميس مع المجهر ترانزميسيونلكترون (تيم)، كما هو موضح سابقا من قبل لين وآخرون ⁴ .

2. إكسوسوم تنقية باستخدام التدرج الكثافة

1. ريسوسبيند ال 110،000 بيليه من الخطوة 1.7 في 40٪ (ث / ت) يوديكسانول في برنامج تلفزيوني (2 مل). تراكب الخليط في تسلسل مع أليكوتس من 30٪، 20٪، 10٪، و 5٪ (ث / ت) يوديكسانول في برنامج تلفزيوني (2 مل لكل منهما) لتشكيل التدرج الكثافة في أنبوب نابذة فائقة السرعة.
2. الطرد المركزي الخليط في 200،000 x ج لمدة 8 ساعات في 4 درجات مئوية.
3. جمع كل جزء التدرج (10 فراكتسيالإضافات. 1 مل / جزء) مع ماصة من الجزء العلوي من الأنبوب.
4. تحليل وجود علامات إكسوسوم (على سبيل المثال، CD81، CD9، CD63، و Tsg101) في كل جزء من سدز-بادج ¹² وصمة عار الغربية. تحميل 50 ميكرولتر تعليق من كل جزء على هلام 10٪ تحتوي على 0.1٪ (ث / ت) سدز وفصل البروتينات في الكسور مع الكهربائي هلام.
5. نقل البروتينات من هلام إلى غشاء بفدف واحتضان الغشاء مع الأجسام المضادة ضد علامات إكسوسوم (على سبيل المثال، CD81، CD9، CD63، و Tsg101) والبروتين التدبير المنزلي غابد بين عشية وضحاها ( جدول المواد ) في 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: تحدد النتيجة الكسر الذي يحتوي على إكسوسوميس.

3. خارج الخلية حويصلة / إكسوسوم وسم

1. تعليق إيفس / إكسوسوميس، التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.7، في 10 ميكرومتر كاربوكسيفلورسين سوتسينيميديل استر دياسيتات (كفس) في 20 ميكروغرام من البروتين إكسوسومال / 100 ميكرولتر. إعداد عينة موازية المشتركفقط كفس و بس، معالجتها بنفس الطريقة، كما سيطرة سلبية ل إيف / إكسوسوم المقايسات امتصاص في وقت لاحق. ترك الخلائط عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
2. تعليق إيفس / إكسوسوميس في حجم 50X من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي تعليق في 110،000 x ج لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و ريسوسبيند بيليه إيف / إكسوسوم في برنامج تلفزيوني. كرر الخطوة 3.2 مرة واحدة.
3. تعليق إيفس / إكسوسوميس في برنامج تلفزيوني بتركيز 20 ميكروغرام من البروتين إكسوسومال / 100 ميكرولتر ومن ثم تصفية إيفس / إكسوسوميس من خلال الأغشية 0.22 ميكرون قبل إضافة إيفس / إكسوسوميس إلى الخلايا.

4. خارج الخلية حويصلة / إكسوسوم امتصاص الفحص

1. لجعل وسط الثقافة، مزيج 500 مل من مدب 170، ودرجة الحموضة 7.4 + 500 مل من دمم / F12 مع بيكربونات الصوديوم (0.2438٪)؛ إغف (5 نانوغرام / مل)؛ هدروكوريتيسون (0.5 ميكروغرام / مل)؛ الأنسولين (5 ميكروغرام / مل)؛ و بب (35 ميكروغرام / مل) ⁴ . لوحة الخلايا الثديية هملان الظهارية الإنسان في 6 أطباق جيدا (1 × 10 ^{6 <}/ سوب> الخلايا / جيدا) قبل يوم واحد إيف / إكسوسوم العلاج. إضافة 2 ميكروغرام / مل كفس مضان المسمى إيفس / إكسوسوم، التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.3، إلى الوسط الثقافي للخلايا همل لمدة 2-6 ح. علاج خلايا همل من مجموعة السيطرة السلبية مع إعداد مواز، وصفها في الخطوة 3.1.
2. بعد الحضانة 2-6 ح، وغسل الخلايا مرتين مع 4 مل من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة.
3. فصل الخلايا مع التربسين 0.25٪ لمدة 10 دقيقة وإعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ فبس. قياس إيف / إكسوسوم امتصاص من كثافة مضان في الخلايا باستخدام محلل خلية مضان ⁴ . صورة الخلايا تعامل مع إيفس / إكسوسوميس أو السيطرة السلبية باستخدام المجهر متحد البؤر.
   ملاحظة: ويتسبب مضان الأخضر في الخلايا من قبل إيف / إكسوسوم امتصاص. انظر أسطورة الشكل 6 لإعدادات المجهر.

5. عزل ماوس الابتدائي خلايا الظهارية الثديية

إعداد الأطباق المغلفة الجيلاتين بإضافة 12 مل من محلول الجيلاتين 0.1٪ إلى 10 سم الأطباق. وضع لوحات في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إزالة الحل الجيلاتين وترك الأغطية قبالة الأطباق في غطاء تدفق الصفحي لمدة 4 ساعات حتى تجفيف طلاء الجيلاتين.
1. تشريح عدد 2، 3، 4، و 5 الغدد الثديية ( الشكل 2 ) من 12 أسبوعا العذراء الإناث C57BL / 6 الفئران باستخدام مقص وقطع الغدد إلى قطع صغيرة (2 مم ² ) باستخدام الحلاقة.
2. وعلاوة على ذلك تنفصل الطين الغدد الثديية (من 10 الفئران) لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 120 دورة في الدقيقة التحريض مع 50 مل من دمم / F12 تحتوي على 0.2٪ كولاجيناز نوع الرابع، 0.2٪ التربسين، 5٪ فبس، 5 ميكروغرام / مل الجنتامايسين ، و 1x القلم-بكتيريا.
3. بيليه أسفل أورغانويدس الظهارية من الخليط بواسطة الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 10 دقيقة.
4. تعليق أورغانويدس الظهارية في 4 مل من دمم / F12 مع 0.1 ملغ / مل دناز أنا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة 6 مل من دمم / F12 إلى نهائيحجم 10 مل.
5. الطرد المركزي تعليق في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف.
6. ريسوسبيند بيليه في 10 مل من دمم / F12. الطرد المركزي التعليق ولكن ضرب الفرامل عندما تصل السرعة 400 x ز. تجاهل طاف.
   ملاحظة: عن طريق ضرب الفرامل، أورغانويدس الظهارية يتم تكويرها بسرعة أسفل، في حين الخلايا الليفية، وخلايا واحدة، لا تزال البقاء في طاف.
7. كرر الخطوة 5.6 و 5.7 5-7 مرات. إضافة قطرة من تعليق إلى عدادة الكريات ومن ثم التحقق من إزالة الخلايا الليفية من خليط عضوي تحت المجهري بعد كل جولة من الطرد المركزي ( الشكل 3 ).
8. لوحة في أورغانويدس في طبق المغلفة الجيلاتين، التي تم الحصول عليها في الخطوة 5.1، لمدة 48 ساعة مع دمم / F12 تحتوي على 1X إيتس، 5٪ فبس، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، 10 نانوغرام / مل إغف، و 1X القلم بكتيريا.
9. بعد 48 ساعة، وإزالة الخلايا العائمة في الثقافة عن طريق استبدال المتوسطة مع وسط الاستزراع الطازج دون فبس (دمم / F12 تحتوي على 1X إيتس، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، 10 نانوغرام / مل إغف، و 1 X القلم بكتيريا).
10. تأكد من أن أحادي الطبقة من الخلايا الظهارية الثديية يهاجر وينمو من أورغانويدس الظهارية المرفقة في 3 أيام.

6. فصل الابتدائي الماوس القاعدية / الخلايا الظهارية الثديية اللمعية

1. بعد الثقافة لمدة 3 أيام، وفصل الخلايا الثديية الأولية الماوس مع خليط انزيم طبيعي مع نشاط انزيم بروتين و كولاجينوليتيك لمدة 20 دقيقة. تحييد نشاط الانزيم مع فبس 5٪ في برنامج تلفزيوني.
2. أجهزة الطرد المركزي تعليق في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف. ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 ملغ / مل ديسباس لمدة 20 دقيقة. تحييد نشاط الانزيم مع فبس 5٪ في برنامج تلفزيوني.
3. أجهزة الطرد المركزي تعليق في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف.
4. إعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر بس مع 0.2٪ فبس في تركيز 10 ⁷ خلية / مل مع المخففومكافحة CD49f والأجسام المضادة لمكافحة إبكام على الجليد لمدة 1 ساعة في الظلام.
5. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ومن ثم احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية فلورفور مترافق على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام.
6. غسل وإعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني مع 0.2٪ فبس.
7. فرز إبكام ^مرحبا / CD49f ^لو الخلايا الظهارية الثديية اللمعية على فارز الخلية ⁴ .

7. خارج الخلية حويصلة / إكسوسوم العلاج

1. البذور فرزها إبكام ^مرحبا / CD49f ^لو الخلايا الظهارية الثديية اللمعية من الخطوة 6.7 على أطباق الجيلاتين المغلفة 6 جيدا (2 × 10 ⁵ خلية / جيدا) ومن ثم علاجها مع برنامج تلفزيوني أو 2 ميكروغرام / مل ناميك المستمدة إيفس / إكسوسوميس التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.7.
2. لضمان فعالية بيولوجية من إيفس / إكسوسوميس في علاج الثقافة على المدى الطويل، واستبدال وسط زراعة الخلايا مع المتوسطة الطازجة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني أو 2 ميكروغرام / مل ناميك المستمدة إيفس / إكسوسوميس كل يومين. لا تقسم الماوس الأوليري الخلايا اللمعية خلال العلاج لمدة 10 يوما.

8. الدهون وسادة حقن الخلايا الظهارية الثديية

1. تخدير الإناث البالغ من العمر 3 أسابيع C57BL / 6 الفئران مع إيسوفلوران 2-3٪ استنشاق.
2. ضع الماوس تخدير على ظهره. إزالة الفراء على منتصف البطن مع الحلاقة / كريم الشعر وتنظيف موقع الجراحة مع ثلاث دورات بالتناوب من الكحول 70٪ والبوفيدون اليود.
3. جعل شق العمودية 1.5 سم من خلال الجلد على طول المنطقة البطنية الصدري-الإربية مع مقص ثم تعريض بالتناوب الحق واليسار 4 منصات الثدي الثديية.
4. مسح كل لوحة الدهون عن طريق إزالة حمة الغدة مع مقص. تحديد العقدة الليمفاوية في لوحة الدهون ثم إزالة حمة الغدة كلها تحت العقدة الليمفاوية.
   ملاحظة: يجب أن تبقى ثلثي لوحة الدهون في مكانها.
5. فصل الخلايا التي تم الحصول عليها من الخطوة 7.2 مع خليط انزيم طبيعي (انظر جدول المواد ) مع بروتيننشاط الكولاجينولتيك انزيم لمدة 10 دقيقة. تحييد نشاط الانزيم مع فبس 5٪ في برنامج تلفزيوني.
6. أجهزة الطرد المركزي تعليق في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف. عد الخلايا مع عدادة الكريات وتعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني في تركيز مثل أن 15 ميكرولتر يحتوي على جرعة الخلية المطلوبة (10 ⁴ -10 ² خلية / وسادة).
7. حقن 15 ميكرولتر من تعليق الخلايا الظهارية الثديية في لوحة الدهون باستخدام 100 حقنة الزجاج ميكرولتر تعلق على إبرة 27G.
8. كرر الخطوات 8،4-8،7 لوحة الدهون على الجانب الآخر.
9. إغلاق الجلد مع مقاطع الجرح.

9. الثديية الغدة جبل كامل

1. الموت ببطء الماوس مع كو ₂ زائد خلع عنق الرحم في 8 أسابيع بعد حقن الخلية (الخطوة 8.7).
2. إجراء شق عمودي من خلال طبقة الجلد من المنطقة الصدرية إلى المنطقة الأربية باستخدام مقص ثم كشف كل من اليمين واليسار 4 ممنصات الدهون الأمري. إزالة الغدد الثديية ^ال 4 ( الشكل 2 ).
3. انتشار منصات الدهون على الشرائح المجهر الزجاجي وإصلاح منصات الدهون مع مثبت كاهل (4٪ الفورمالديهايد، 30٪ إتوه، و 2٪ حمض الخليك الجليدي) في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
   تنبيه: مثبت كاهل هو مهيج. تنفيذ هذه الخطوة في غطاء محرك السيارة الكيميائية.
4. غسل منصات الدهون في 250 مل من 70٪ إتوه لمدة 15 دقيقة ثم في 250 مل من د ₂ O لمدة 5 دقائق. وصمة عار منصات الدهون مع الشبك القرم (1 غرام من الكارمين و 2.5 غرام من كبريتات البوتاسيوم الألومنيوم في 500 مل من د ₂ O) في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
5. غسل منصات الدهون مع 250 مل من إتوه 70٪ لمدة 15 دقيقة، 250 مل من 95٪ إتوه لمدة 15 دقيقة، و 250 مل من إتوه 100٪ لمدة 15 دقيقة.
6. تنظيف منصات الدهون في الزيلين لعدة أيام ووقف الحضانة زيلين عندما تصبح منصات الدهون شفافة.
   الحذر: الزيلين هو مهيج. تنفيذ هذه الخطوة في غطاء محرك السيارة الكيميائية.
7. جبل الشرائح وايتصاعد وسط والتقاط الصور (2،400 نقطة في البوصة) من منصات الدهون باستخدام الماسح الضوئي الشريحة الرقمية.

النتائج

منذ أن تبين أن منع ي ₂ / إب ₄ تشوير يطلق إيف / إكسوسوم الافراج عن الثديية مثل الخلايا الجذعية القاعدية ⁴ ، وهذا العمل يقدم وسيلة لعزل إيفس / إكسوسوميس الناجم عن الثديية الظهارية الخلايا القاعدية (ناميك) الثقافة. منذ نامس مثقف في ?...

Discussion

إكسوسوميس غالبا ما تحمل خصائص الخلايا التي أفرجت عنها، وكمية من إكسوسوميس الافراج عنهم يمكن أن يسببها المحفزات ⁴ . يمكن جمع وسط الثقافة من الخلايا وتعرض لتنبيذ فائق التفاضلية لجمع إيف / إكسوسوم ( الشكل 1 ). لا يوجد حاليا اتفاق عام على طريقة ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCDB 170	USBiological	M2162
DMEM/F12	Thermo	1250062
Optima L-100K ultracentrifuge	Beckman	393253
SW28 Ti Rotor	Beckman	342204
SW41 Rotor	Beckman	331306
NANOSIGHT LM10	Malvern	NANOSIGHT LM10	for nanoparticle tracking analysis (NTA)
Optiprep	Sigma-Aldrich	D1556	60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile).
CD81 antibody	GeneTex	GTX101766	1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
CD9 antibody	GeneTex	GTX100912	1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
CD63 antibody	Abcam	Ab59479	1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
TSG101 antibody	GeneTex	GTX118736	1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
GAPDH	GeneTex	GTX100118	1:6000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester)	Thermo	V12883
FACSCalibur	BD Biosciences		fluorescence cell analyzer
collagenase Type IV	Thermo	17104019
trypsin	Thermo	27250018
ITS	Sigma-Aldrich	I3146	a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite
accutase	ebioscience	00-4555-56	a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity
dispase	STEMCELL	7913	5 mg/ml = 5 U/ml
anti-CD49f antibody	Biolegend	313611	1:50
anti-EpCAM antibody	Biolegend	118213	1:200
FACSAria	BD Biosciences		cell sorter
carmine alum	Sigma-Aldrich	C1022
human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs)			gifts from Dr. Robert Weinberg
permount	Thermo Fisher Scientific	SP15-500
sodium bicarbonate	Zymeset	BSB101
EGF	Peprotech	AF-100-015
Hydrocoritisone	Sigma-Aldrich	SI-H0888
Insulin	Sigma-Aldrich	SI-I9278
BPE (bovine pituitary extract)	Hammod Cell Tech	1078-NZ
GW627368X	Cayman	10009162
15-cm culture dish	Falcon	353025
table-top centrifuge	Eppendrof	Centrifuge 3415R
ultracentrifuge tube	Beckman	344058
PBS (Phosphate-buffered saline)	Corning	46-013-CM
BCA Protein Assay	Thermo Fisher Scientific	23228
Transmission Electron Microscopy	Hitachi	HT7700
gelatin	STEMCELL	7903
10-cm culture dish	Falcon	353003
6-well culture dish	Corning	3516
female C57BL/6 mice	NLAC (National Laboratory Animal Center
FBS (Fetal Bovine Serum)	BioWest	S01520
gentamycin	Thermo Fisher Scientific	15710072
Pen/Strep	Corning	30-002-Cl
DNase I	5PRIMER	2500120
isofluorane	Halocarbon	NPC12164-002-25
formaldehyde	MACRON	H121-08
EtOH (Ethanol)	J.T. Baker	800605
glacial acetic acid	Panreac	131008.1611
aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	12625
Xylene	Leica	3803665
0.22 μm membranes	Merck Millipore	Millex-GP
AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm	BD Biosciences	427631
AUTOCLIP Wound Clip Applier	BD Biosciences	427630
CellMask™ Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C10046	plasma membrane stain