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要約

このプロトコルは、非接着性/間葉性乳房上皮細胞からの細胞外小胞（EVs）/エキソソームの精製、定量化および特徴づけ方法、ならびにこれらを用いて乳腺上皮細胞に乳腺形成能を転移させる方法を記載する。幹様乳腺上皮細胞に由来するEV /エキソソームは、この細胞特性をEV /エキソソームを摂取する細胞に移入することができる。

要約

細胞は、エキソソームを介して、タンパク質、脂質、および核酸を含む約100nmの細胞外小胞（EV）と通信することができる。非接着/間葉系乳房上皮細胞（NAMEC）由来の細胞外小胞は、示差的超遠心分離によってNAMEC培地から単離することができる。それらの密度に基づいて、EVは110,000×gでの超遠心分離によって精製することができる。超遠心分離からのEV調製物は、可溶性タンパク質の混入を防ぐために連続密度勾配を用いてさらに分離することができる。次いで精製されたEVを、調製物中の小胞のサイズおよび数を測定するナノ粒子追跡分析を用いてさらに評価することができる。 50〜150nmの範囲の細胞外小胞はエキソソームである。 NAMEC由来のEV /エキソソームは、乳腺上皮細胞によって摂取され得、これは、フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡によって測定され得る。いくつかの乳腺幹細胞の特性（ 例えば、乳腺形成能）は、NAMEC由来EVs /エキソソームを介して、幹様NAMECから乳房上皮細胞に移され得る。単離された一次EpCAM hi / CD49f lo管腔上乳腺細胞は、マウス脂肪パッドに移植された後、乳腺を形成することができず、EpCAM lo / CD49fは、移植後に乳腺を形成する。 EpCAM hi / CD49f lo管腔上乳腺上皮細胞によるNAMEC由来EVs /エキソソームの取り込みは、脂肪パッドに移植された後に乳腺を発生させる。幹様乳腺上皮細胞に由来するEV /エキソソームは、EpCAM hi / CD49f lo管腔上乳腺上皮細胞に乳腺形成能を伝達する。

概要

エキソソームは細胞間の膜とサイトゾルタンパク質、脂質、RNAを伝達することで細胞間の伝達を媒介することができます1 。エキソソーム媒介性の伝達は、多くの生理学的および病理学的プロセス（ すなわち、抗原提示、寛容2の発生および腫瘍進行3 ）に関与することが実証されている。エキソソームはしばしば、それらを放出するソース細胞のものと同様の内容を有する。したがって、エキソソームは、供給源細胞から特定の細胞特性を運び、それらを摂取する細胞にこれらの特性を伝達することができる4 。

エキソソームは、50〜150nmの二重層膜ベシクルであり、特異的マーカー（ 例えば、 CD9、CD81、CD63、HSP70、Alix、およびTSG101）を提示する。したがって、エキソソームは、異なる側面のための様々な方法によって特徴付けられなければならない。透過電子顕微鏡法を用いて膜小胞を可視化することができる例えば、エキソソーム4,5 。精製されたエキソソームのサイズおよび数を測定するために、ナノ粒子追跡分析（NTA）および動的光散乱分析（DLS）が使用される。エキソソームの脂質膜含量は、密度勾配によって確認することができる。 CD9、CD81、CD63、HSP70、Alix、およびTSG101,6,7などのエキソソームマーカーは、ウェスタンブロッティングによって測定することができる。

乳房基底細胞は、脂肪パッドに移植されたとき乳腺を生成する能力を有するが、内腔細胞は8,9,10 であり得ない。従って、乳房基底細胞は、乳房再増殖単位とも呼ばれる。乳房基底および管腔細胞のモデルを用いることにより、EVs /エキソソームが異なる細胞集団間で細胞特性を伝達する能力を調べることができる。この作品乳房基底上皮細胞由来のEV /エキソソームを用いて乳腺上皮細胞から乳房内腔上皮細胞への腺形成能を伝達する方法を実証する。ルーメン乳房上皮細胞は、基底細胞から分泌されたEV /エキソソームの摂取後に基底細胞特性を獲得し、次に乳腺4を形成することができる。

プロトコル

動物を含むすべての研究は、動物管理機関委員会によって承認されたプロトコールを遵守した。

1.細胞外小胞/エキソソームの単離および検証

  1. 培養乳房上皮基底細胞、NAMEC 4、500mLのMCDB170、pH7.4 + 500mLの重炭酸ナトリウム（0.2438％）を含むDMEM / F12からなる新鮮な無血清培地; EGF（5ng / mL）。ヒドロコルチゾン（0.5μg/ mL）;インスリン（5μg/ mL）。ウシ下垂体抽出物（BPE;35μg/ mL）;およびGW627368X（1μg/ mL）を15cmディッシュに入れた。
  2. 血球計数器で細胞を計数した後、0日目に15cmディッシュあたり12mLの培地に1.2x10 6個の細胞を4日間播種する4 。
  3. 培養4日後、卓上遠心分離機を用いて300 xgで5分間遠心します。上清をコニカルチューブに移す（ 図1 ）。
  4. 上清を遠心分離する。卓上遠心分離機で2,000 xg、20分間。上清を超遠心分離チューブに移し、死んだ細胞と細胞破片を残す（ 図1 ）。
  5. 上清を10,000 xgで30分間4℃で遠心分離します。上清を新しい超遠心チューブに移す（ 図1 ）。
  6. 上清を110,000 xgで60分間4℃で遠心分離する。上清を除去し、EV /エキソソームペレットをPBS（ 図1 ）に再懸濁する。
  7. 上清を110,000 xgで60分間4℃で遠心分離する。上清を除去する。 EV /エキソソームペレットをPBSに再懸濁する（ 図1 ）。 NAMEC条件培地240〜480mLから単離したペレットを100μLで再懸濁する。
  8. BC懸濁液のタンパク質濃度をBCAタンパク質アッセイで測定する。濃度が約20〜40μg/ 100μLであることを確認してください。 -20℃での保存さらなる分析。
  9. 先にGardiner らによって記載されているように、ナノ粒子追跡分析（NTA）によってEV /エキソソームの濃度およびサイズを測定する。 11 。 NTA分析のために、EV /エキソソーム（20μg/100μL）をPBSで10,000倍に希釈する。
    注：NTA分析の結果は、分析された小胞の数およびサイズを反映する。
  10. 以前にLin ら 4に記載されているように、透過電子顕微鏡（TEM）を用いてEV /エキソソームを画像化する。

2.密度勾配を用いたエキソソーム精製

  1. ステップ1.7の110,000gペレットをPBS（2mL）中の40％（w / v）イオジキサノールに再懸濁する。 PBS（それぞれ2mL）中の30％、20％、10％、および5％（w / v）のイオジキサノールのアリコートを順番に混合し、超遠心チューブに密度勾配を形成する。
  2. 混合物を200,000×gで4時間、8時間遠心分離する。
  3. 各グラジエントフラクションを収集する（10フラクションons; 1mL /画分）をピペットでチューブの上部から取り出します。
  4. SDS-PAGE 12およびウェスタンブロットによって、各画分のエキソソームマーカー（ 例えば、 CD81、CD9、CD63およびTsg101）の存在を分析する。各画分の50μL懸濁液を0.1％（w / v）SDSを含む10％ゲルにロードし、タンパク質をゲル電気泳動で画分に分離する。
  5. タンパク質をゲルからPVDFメンブレンに移し、4℃で一晩エキソソームマーカー（ 例えば CD81、CD9、CD63、およびTsg101）およびハウスキーピングタンパク質GAPDH（ Table of Materials ）に対する抗体と膜をインキュベートする。
    注：結果は、エキソソームを含有する画分を同定する。

3.細胞外小胞/エキソソーム標識

  1. ステップ1.7で得られたEV /エキソソームを20μgのエキソソームタンパク質/100μLで10μMカルボキシフルオレセインスクシンイミジルジアセテートエステル（CFSE）に懸濁する。並列サンプルを準備する後のEV /エキソソーム取り込みアッセイのネガティブコントロールとして、同じ方法で処理されたCFSEおよびPBSのみを含む。混合物を37℃で30分間放置する。
  2. 50倍量のPBSにEV /エキソソームを懸濁し、4℃で60分間110,000×gで懸濁液を遠心分離する。上清を除去し、EV /エキソソームペレットをPBSで再懸濁する。ステップ3.2を1回繰り返します。
  3. EVs /エキソソームを20μgのエキソソームタンパク質/100μLの濃度でPBS中に懸濁させ、次にEVs /エキソソームを0.22μmの膜を通して濾過し、細胞にEV /エキソソームを添加する。

4.細胞外小胞/エキソソーム取り込みアッセイ

  1. 培養培地を作るために、500mLのMCDB170、pH7.4 + 500mLのDMEM / F12を重炭酸ナトリウム（0.2438％）と混合する。 EGF（5ng / mL）。ヒドロコルチゾン（0.5μg/ mL）;インスリン（5μg/ mL）。およびBPE（35μg/ mL） 4 。ヒトの乳房上皮HMLE細胞を6ウェルディッシュ（1×10 6細胞//細胞> /ウェル）をEV /エキソソーム処理の1日前に投与する。ステップ3.3で得られた2μg/ mLのCFSE蛍光標識EV /エキソソームをHMLE細胞の培地に2〜6時間添加する。陰性対照群のHMLE細胞を、ステップ3.1で説明した平行調製物で処理する。
  2. 2〜6時間のインキュベーション後、室温で4mLのPBSで細胞を2回洗浄する。
  3. 0.25％トリプシンで10分間細胞を分離し、0.2％FBSを含むPBS中で細胞を再懸濁する。蛍光細胞分析装置4を使用して、細胞内の蛍光強度からのEV /エキソソーム取り込みを測定する。共焦点顕微鏡法を用いてEV /エキソソームまたはネガティブコントロールで処理した細胞を画像化する。
    注：細胞の緑色の蛍光は、EV /エキソソームの取り込みによって引き起こされます。顕微鏡の設定については、 図6の凡例を参照してください。

原発性マウス乳腺上皮細胞の単離

  1. 0.1cmのゼラチン溶液12mlを10cmの皿に加えてゼラチン被覆皿を調製する。プレートを37℃のインキュベーターに30分間置く。ゼラチン溶液を除去し、ゼラチンコーティングが乾燥するまで4時間層流フード中で蓋を皿から離しておく。
  2. はさみを使用して12週齢の処女雌C57BL / 6マウスから2番、3番、4番、5番の乳腺（ 図2 ）を解剖し、剃刀を用いて小塊（2mm 2 ）に切る。
  3. 0.2％コラゲナーゼIV型、0.2％トリプシン、5％FBS、5μg/ mLゲンタマイシンを含有する50mLのDMEM / F12を用いて、乳腺のスラリー（10匹のマウスから）を37℃で60分間、120rpmで攪拌しながらさらに解離させる。 、および1x pen-strep。
  4. 350×gで10分間遠心分離することにより、混合物から上皮オルガノイドをペレット状にペレット化する。
  5. 0.1mg / mL DNase Iを含む4mLのDMEM / F12に上皮オルガノイドを室温で5分間懸濁する。 6mLのDMEM / F12を最終10mLの容量。
  6. 懸濁液を室温で10分間400xgで遠心分離し、上清を捨てる。
  7. ペレットを10mLのDMEM / F12に再懸濁する。サスペンションを遠心分離機に乗せるが、速度が400 x gに達するとブレーキが掛かる。上清を捨てる。
    注：ブレーキを叩くことによって、上皮オルガノイドは速やかにペレット化されますが、線維芽細胞は単細胞として上清中に残ります。
  8. 手順5.6と5.7を5〜7回繰り返します。血球計にサスペンションの一滴を加え、遠心分離の各ラウンド後に顕微鏡下でオルガノイド混合物から線維芽細胞のクリアランスをチェックする（ 図3 ）。
  9. 1x ITS、5％FBS、50μg/ mLゲンタマイシン、10ng / mL EGFおよび1xペン - ストレプを含有するDMEM / F12で、ステップ5.1で得られたゼラチンコートディッシュ中のオルガノイドを48時間培養する。
  10. 48時間後、FBSを含まない新鮮な培養培地で培地を置換することにより、培養中の浮遊細胞を除去する（1×ITS、50μg/ mLゲンタマイシン、10ng / mL EGF、および1×ペン - ストレプトマイシンを含むDMEM / F12）で洗浄した。
  11. 乳房上皮細胞の単層が、付着した上皮オルガノイドから3日間で移動し、成長することを確認する。

原発性マウス基礎/管腔上乳腺上皮細胞の分離

  1. 3日間の培養後、20分間、タンパク質分解酵素およびコラーゲン分解酵素活性を有する天然酵素混合物でマウス初代乳腺細胞を分離する。 PBS中の5％FBSで酵素活性を中和する。
  2. 懸濁液を室温で10分間450xgで遠心分離し、上清を捨てる。細胞ペレットを5mg / mLディスパーゼに20分間再懸濁する。 PBS中の5％FBSで酵素活性を中和する。
  3. 懸濁液を室温で10分間450xgで遠心分離し、上清を捨てる。
  4. 希釈して10 7細胞/ mLの濃度で0.2％FBSを含む100μLのPBSに細胞を再懸濁した抗CD49fおよび抗EpCAM抗体を氷上で暗所で1時間インキュベートした。
  5. PBSで細胞を洗浄し、暗所で30分間氷上でフルオロフォア結合二次抗体で細胞をインキュベートする。
  6. 0.2％FBSを含むPBS中で細胞を洗浄し、再懸濁する。
  7. EpCAM hi / CD49f lo管腔上乳腺上皮細胞を細胞選別機4で選別する。

7.細胞外小胞/エキソソーム処理

  1. ゼラチンでコートした6ウェルディッシュ（2×10 5細胞/ウェル）上に、ステップ6.7からの選別したEpCAM hi / CD49f lo管腔上乳腺細胞を播種し、PBSまたは2μg/ mL NAMEC由来EV /エキソソームで処理するステップ1.7で得られた。
  2. 長期培養処理におけるEV /エキソソームの生物学的有効性を確実にするために、PBSまたは2μg/ mLのNAMEC由来のEV /エキソソームを含む新鮮な培地で2日ごとに細胞培養培地を交換する。マウスプリマを分割しないでください10日間の処置の間に細胞内の細胞を除去する。

乳腺上皮細胞の脂肪パッド注入

  1. イソフルラン2〜3％吸入剤を含む3週齢の雌性C57BL / 6マウスを麻酔する。
  2. 麻酔したマウスをその背中に置く。中腹部の毛皮をカミソリ/ヘアクリームで取り除き、70％アルコールとポビドンヨードの3回の交互サイクルで手術部位をきれいにする。
  3. はさみで腹側胸骨 - 鼠径部に沿って皮膚を通して1.5cmの垂直切開を行い、次に右と左の第4乳房脂肪パッドを交互に露出させる。
  4. はさみで腺実質を取り除くことによって各脂肪パッドをきれいにする。リンパ節を脂肪パッドに置き、リンパ節の下の腺実質全体を除去する。
    注記：脂肪パッドの3分の2はそのまま残してください。
  5. 工程7.2から得られた細胞を、天然の酵素混合物（ 表の表を参照 ）でタンパク質分解性aコラーゲン分解酵素活性を10分間測定した。 PBS中の5％FBSで酵素活性を中和する。
  6. 懸濁液を室温で10分間450xgで遠心分離し、上清を捨てる。血球計数器で細胞を計数し、15μLに所望の細胞用量（10 4 -10 2細胞/パッド）が含まれるような濃度のPBS中で細胞を懸濁させる。
  7. 乳腺上皮細胞浮遊液15μLを、27G針に取り付けられた100μLガラスシリンジを用いて脂肪パッドに注入する。
  8. もう片方の脂肪パッドについては、手順8.4-8.7を繰り返します。
  9. 創傷クリップで皮膚を閉じます。

9.乳腺完全マウント

  1. 細胞注入後8週間でCO 2 +頚部脱臼でマウスを安楽死させる（ステップ8.7）。
  2. はさみを使用して、胸骨領域から鼠径領域への皮膚層を垂直に切開し、次に右と左の両方を露出させる。大麻の脂肪パッド。第4乳腺を除去する（ 図2 ）。
  3. ガラス顕微鏡スライド上の脂肪パッドを広げ、室温で一晩、Kahle固定液（4％ホルムアルデヒド、30％EtOH、および2％氷酢酸）で脂肪パッドを固定する。
    注意：Kahleの固定剤は刺激剤です。ケミカルフードでこの手順を実行します。
  4. ファットパッドを250mLの70％EtOHで15分間、次いで250mLのdH 2 Oで5分間洗浄する。ファットパッドをカルミンミョウバン（1gのカルミンおよび2.5gの硫酸アルミニウムカリウムを500mLのdH 2 O中に）で室温で一晩染色する。
  5. 脂肪パッドを250mLの70％EtOHで15分間、250mLの95％EtOHで15分間、および250mLの100％EtOHで15分間洗浄する。
  6. ファットパッドが透明になったら、キシレンの脂肪パッドを数日間清掃し、キシレンインキュベーションを停止します。
    注意：キシレンは刺激剤です。ケミカルフードでこの手順を実行します。
  7. スライドをマウントするデジタルスライドスキャナを使用して脂肪パッドの画像（2,400dpi）を撮影する。

結果

PGE 2 / EP 4シグナル伝達を遮断することにより、乳房基底様幹細胞4からのEV /エキソソーム放出が誘発されることが示されているので、この研究は、誘発されたEV /エキソソームを乳房上皮基底細胞（NAMEC）培養から単離する方法を提示する。 NAMECは無血清培地で培養されるため、血清由来のEV /エキソソームは存在しない13...

ディスカッション

エキソソームは、それらを放出した細胞の特徴を有することが多く、放出されたエキソソームの量は、刺激によって誘発され得る4 。細胞の培養培地を回収し、EV /エキソソーム収集のための示差的超遠心分離に供することができる（ 図1 ）。現在のところ、EV /エキソソームを単離する理想的な方法に関する一般的な合意はない。ここで使用される最適...

開示事項

著者は何も開示することはない。

謝辞

この研究は、国立健康研究所（05A1-CSPP16-014、HJL）および科学技術省（MOST 103-2320-B-400-015-MY3、HJL）からの助成金によって支えられた。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
MCDB 170 USBiologicalM2162
DMEM/F12Thermo1250062
Optima L-100K ultracentrifugeBeckman393253
SW28 Ti RotorBeckman342204
SW41 RotorBeckman331306
NANOSIGHT LM10MalvernNANOSIGHT LM10for nanoparticle tracking analysis (NTA)
Optiprep Sigma-AldrichD155660% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile).
CD81 antibodyGeneTexGTX1017661:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight 
CD9 antibodyGeneTexGTX1009121:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight 
CD63 antibodyAbcamAb594791:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight 
TSG101 antibodyGeneTexGTX1187361:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight 
GAPDHGeneTexGTX1001181:6000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight 
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester)ThermoV12883
FACSCaliburBD Biosciencesfluorescence cell analyzer
collagenase Type IV Thermo17104019
trypsinThermo27250018
 ITSSigma-AldrichI3146a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite
accutaseebioscience00-4555-56a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity
dispase STEMCELL79135 mg/ml = 5 U/ml
anti-CD49f antibodyBiolegend3136111:50
anti-EpCAM antibodyBiolegend1182131:200
FACSAriaBD Biosciencescell sorter
carmine alumSigma-AldrichC1022
human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs)gifts from Dr. Robert Weinberg
permountThermo Fisher Scientific SP15-500
sodium bicarbonateZymeset BSB101
EGFPeprotechAF-100-015
HydrocoritisoneSigma-AldrichSI-H0888
Insulin Sigma-AldrichSI-I9278
BPE (bovine pituitary extract)Hammod Cell Tech 1078-NZ
GW627368X Cayman10009162
15-cm culture dishFalcon 353025
table-top centrifugeEppendrof Centrifuge 3415R
ultracentrifuge tubeBeckman344058
PBS (Phosphate-buffered saline) Corning46-013-CM
BCA Protein AssayThermo Fisher Scientific 23228
Transmission Electron MicroscopyHitachiHT7700
gelatin STEMCELL7903
10-cm culture dishFalcon 353003
6-well culture dishCorning3516
female C57BL/6 miceNLAC (National Laboratory Animal Center
FBS (Fetal Bovine Serum)BioWest S01520
gentamycinThermo Fisher Scientific 15710072
Pen/StrepCorning30-002-Cl
DNase I5PRIMER2500120
isofluorane HalocarbonNPC12164-002-25
formaldehydeMACRONH121-08
EtOH (Ethanol)J.T. Baker800605
glacial acetic acidPanreac131008.1611
aluminum potassium sulfateSigma-Aldrich12625
Xylene Leica3803665
0.22 μm membranesMerck MilliporeMillex-GP
AUTOCLIP Wound Clips, 9 mmBD Biosciences427631
AUTOCLIP Wound Clip ApplierBD Biosciences427630
CellMask™ Deep RedThermo Fisher Scientific C10046plasma membrane stain

参考文献

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