АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе описаны способы очистки, количественного определения и характеризации внеклеточных везикул (EV) / экзосомы из неадгезивных / мезенхимальных эпителиальных клеток молочной железы и для их использования для передачи способности формирования молочной железы к эпителиальным клеткам просвета молочной железы. EVs / экзосомы, полученные из стволовых эпителиальных клеток молочной железы, могут передавать это свойство клеток клеткам, которые поглощают EV / экзосомы.

Аннотация

Клетки могут взаимодействовать через экзосомы, внеклеточные везикулы (ЭП) ~ 100 нм, содержащие белки, липиды и нуклеиновые кислоты. Внеклеточные везикулы из неадгезивных / мезенхимальных эпителиальных клеток молочной железы (NAMEC) могут быть выделены из среды NAMEC с помощью дифференциального ультрацентрифугирования. Основываясь на их плотности, EVs можно очистить ультрацентрифугированием при 110 000 x g. Препарат EV из ультрацентрифугирования может быть дополнительно отделен с использованием непрерывного градиента плотности для предотвращения загрязнения растворимыми белками. Затем очищенные EV могут быть дополнительно оценены с использованием анализа отслеживания наночастиц, который измеряет размер и количество везикул в препарате. Внеклеточные везикулы размером от 50 до 150 нм являются экзосомами. Выведенные NAMEC EVs / экзосомы могут проникать в эпителиальные клетки молочной железы, которые могут быть измерены с помощью проточной цитометрии и конфокальной микроскопии. Некоторые свойства стволовых клеток молочной железы ( например, способность к образованию молочной железы) могутПереносится из стеблеподобных NAMEC в клетки эпителия молочной железы через EVs / экзосомы, полученные из NAMEC. Отдельные первичные эпикатеральные эпителиальные клетки эритроцитарного эпителия EpCAM hi / CD49f не могут образовывать молочные железы после трансплантации в жировые подушки мыши, тогда как EpcAM lo / CD49f hi базальные эпителиальные клетки молочной железы образуют молочные железы после трансплантации. Приобретение EVM / экзосомы, полученных из NAMEC, EpcAM hi / CD49f lo, эпителиальные клетки просвета молочной железы позволяют им генерировать молочные железы после трансплантации в жировые подушки. EVs / экзосомы, полученные из стволовых эпителиальных клеток молочной железы, переносят способность образования молочной железы к EpCAM hi / CD49f ломовым эпителиальным клеткам молочной железы.

Введение

Экзосомы могут опосредовать клеточную связь путем переноса мембранных и цитозольных белков, липидов и РНК между клетками 1 . Было показано, что опосредованная экзосомами связь связана со многими физиологическими и патологическими процессами ( т. Е. С представлением антигена, развитием толерантности 2 и прогрессированием опухоли 3 ). Экзосомы часто имеют содержание, сходное с содержимым исходных клеток, высвобождающих их. Таким образом, экзосомы могут переносить определенные клеточные свойства из исходных клеток и переносить эти свойства на клетки, поглощающие их 4 .

Экзосомы представляют собой двухслойные мембранные везикулы от 50 до 150 нм и представляют собой специфические маркеры ( например, CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix и TSG101). Таким образом, экзосомы должны характеризоваться различными методами для разных аспектов. Прозрачная электронная микроскопия может быть использована для визуализации мембранных везикулТаких как экзосомы 4 , 5 . Анализ Nanoparticle tracking (NTA) и динамический анализ рассеяния света (DLS) используются для измерения размера и количества очищенных экзосом 4 . Содержание липидной мембраны в экзосомах может быть проверено градиентом плотности. Экзосомальные маркеры, такие как CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix и TSG101 6 , 7 , могут быть измерены с помощью Вестерн-блоттинга.

Базальные клетки молочной железы обладают способностью генерировать молочные железы при имплантации в жировые подушечки, тогда как просветные клетки не могут 8 , 9 , 10 . Таким образом, базальные клетки молочной железы также упоминаются как единицы репопуляции молочной железы. Используя модель базальных и просветных клеток молочной железы, можно исследовать способность EVs / экзосомы передавать характеристики клеток между различными популяциями клеток. Эта работаДемонстрирует способ передачи железистообразующей способности из базальных эпителиальных клеток молочной железы в просветные эпителиальные клетки молочной железы с использованием EVs / экзосом, полученных из базальных эпителиальных клеток молочной железы. Лицевые эпителиальные клетки молочной железы приобретали свойства базальных клеток после приема ЭВ / экзосомы, секретируемых из базальных клеток, и затем могут образовывать молочные железы 4 .

протокол

Все исследования, связанные с животными, соответствовали протоколам, утвержденным Институциональным комитетом по уходу за животными.

1. Внеклеточное везикул / экзосомальная изоляция и валидация

  1. Культуральные эпителиальные базальные клетки молочной железы, NAMECs 4 , со свежей, бессывороточной средой, состоящей из 500 мл MCDB 170, pH 7,4 + 500 мл DMEM / F12 с бикарбонатом натрия (0,2438%); EGF (5 нг / мл); Гидрокортизон (0,5 мкг / мл); Инсулин (5 мкг / мл); Экстракт крупного рогатого скота (BPE, 35 мкг / мл); И GW627368X (1 мкг / мл) в чашках по 15 см.
  2. После подсчета клеток с гемоцитометром высевают 1,2 × 10 6 клеток в 12 мл среды на 15-сантиметровую чашку в день 0 в течение 4 дней 4 .
  3. Через 4 дня в культуре центрифугируют культуральную среду при 300 × g в течение 5 мин, используя настольную центрифугу. Перенесите супернатант в коническую трубку ( рис. 1 ).
  4. Центрифугируют супернатантПри 2000 мкг в течение 20 мин в настольной центрифуге. Перенесите супернатант в ультрацентрифужную пробирку и оставите мертвые клетки и клеточный мусор ( рис. 1 ).
  5. Центрифугируют супернатант при 10000 мкг в течение 30 мин при 4 ° С. Перенесите супернатант в новую ультрацентрифужную пробирку ( рис. 1 ).
  6. Центрифугируют супернатант при 110 000 мкг в течение 60 мин при 4 ° С. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу EV / экзосомы в PBS ( рисунок 1 ).
  7. Центрифугируют супернатант при 110 000 мкг в течение 60 мин при 4 ° С. Удалите супернатант. Ресуспендируют гранулу EV / экзосомы в PBS ( рисунок 1 ). Ресуспендируют гранулу, выделенную из 240-480 мл среды, кондиционированной NAMEC, в 100 мкл.
  8. Измерьте концентрацию белка в суспензии EV с помощью анализа белка BCA. Убедитесь, что концентрация составляет около 20-40 мкг / 100 мкл. Хранить при -20 ° C длядальнейший анализ.
  9. Измерьте концентрацию и размер EVs / экзосомы с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA), как описано ранее Gardiner et al. 11 . Разбавьте EVs / экзосомы (20 мкг / 100 мкл) с PBS до 10000 раз для анализа NTA.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Результат анализа NTA отражает количество и размер анализируемых везикул.
  10. Изобразите EVs / экзосомы с помощью электронной микроскопии (TEM), как описано ранее Lin et al . 4 .

2. Очистка экзосомы с использованием градиента плотности

  1. Ресуспендируют таблетку 110 000 г с этапа 1,7 в 40% (мас. / Об.) Йодиксаноле в PBS (2 мл). Оверлейьте смесь последовательно аликвотами 30%, 20%, 10% и 5% (мас. / Об.) Йодиксанола в PBS (по 2 мл каждый) с образованием градиента плотности в ультрацентрифужной пробирке.
  2. Центрифугируют смесь при 200000 × g в течение 8 ч при 4 ° С.
  3. Соберите каждую градиентную фракцию (10 фракцийдополнения; 1 мл / фракция) пипеткой с верхней части трубки.
  4. Проанализируйте присутствие маркеров экзосомы ( например, CD81, CD9, CD63 и Tsg101) в каждой фракции с помощью SDS-PAGE 12 и Вестерн-блоттинга. Загрузите 50 мкл суспензий каждой фракции на 10% гель, содержащий 0,1% (мас. / Об.) SDS, и выделите белки в фракциях с помощью гель-электрофореза.
  5. Перенесите белки из геля в PVDF-мембрану и инкубируйте мембрану с антителами против маркеров экзосомы ( например, CD81, CD9, CD63 и Tsg101) и белком GAPDH для домашнего хозяйства в течение ночи ( таблица материалов ) при 4 ° C.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Результат идентифицирует фракцию, содержащую экзосомы.

3. Внеклеточное везикул / маркировка экзосомы

  1. Приостанавливают EV / экзосомы, полученные на стадии 1.7, в 10 мкМ карбоксифлуоресцеинового сукцинимидилдиацетатного эфира (CFSE) при 20 мкг экзосомального белка / 100 мкл. Подготовьте параллельный образец coПоддерживая только CFSE и PBS, обрабатываемые таким же образом, как отрицательный контроль для последующих анализов поглощения EV / экзосом. Оставьте смеси при 37 ° C в течение 30 минут.
  2. Приостановить EVs / экзосомы в 50x объемах PBS и центрифугировать суспензию при 110 000 xg в течение 60 минут при 4 ° C. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу EV / экзосомы в PBS. Повторите шаг 3.2 один раз.
  3. Приостановить EVs / экзосомы в PBS в концентрации 20 мкг экзосомального белка / 100 мкл, а затем фильтровать EVs / экзосомы через мембраны 0,22 мкм, прежде чем добавлять EVs / экзосомы в клетки.

4. Анализ внеклеточного пузырька / экзосом.

  1. Для приготовления культуральной среды смешать 500 мл MCDB 170, pH 7,4 + 500 мл DMEM / F12 с бикарбонатом натрия (0,2438%); EGF (5 нг / мл); Гидрокортизон (0,5 мкг / мл); Инсулин (5 мкг / мл); И BPE (35 мкг / мл) 4 . Пластируйте эпителиальные клетки HMLE молочной железы человека в 6-луночных чашках (1 x 10 6 </ Sup> cell / well) за один день до лечения EV / exosome. Добавить 2 мкг / мл CFSE флуоресценции меченых EVs / экзосом, полученных на стадии 3.3, в культуральную среду клеток HMLE в течение 2-6 часов. Обработать клетки HMLE отрицательной контрольной группы с помощью параллельного препарата, описанного на этапе 3.1.
  2. После инкубации от 2 до 6 часов промывайте клетки дважды 4 мл PBS при комнатной температуре.
  3. Отсоедините клетки с 0,25% трипсином в течение 10 мин и повторно суспендируйте клетки в PBS, содержащие 0,2% FBS. Измерьте поглощение EV / exosome от интенсивности флуоресценции в клетках с помощью анализатора флуоресцентных клеток 4 . Изобразите клетки, обработанные EVs / экзосомами, или отрицательный контроль, используя конфокальную микроскопию.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Зеленая флуоресценция в клетках вызвана поглощением EV / exosome. См. Легенду на рисунке 6 для настроек микроскопа.

5. Выделение первичных мышечных эпителиальных клеток молочной железы

  1. Приготовьте таблетки, покрытые желатином, добавив 12 мл 0,1% раствора желатина в 10 см. Поместите пластины в инкубатор с температурой 37 ° C в течение 30 мин. Удалите раствор желатина и оставьте крышки с посуды в ламинарном вытяжном шкафу в течение 4 часов, пока не высохнет желатиновая оболочка.
  2. Вырезать 2, 3, 4 и 5 молочных желез ( рис. 2 ) из 12-недельных девственных самцов C57BL / 6 с использованием ножниц и разрезать железы на мелкие кусочки (2 мм 2 ) с помощью бритвы.
  3. Далее диссоциация суспензии молочных желез (от 10 мышей) в течение 60 мин при 37 ° С, перемешивание 120 об / мин с 50 мл DMEM / F12, содержащего 0,2% коллагеназы типа IV, 0,2% трипсина, 5% FBS, 5 мкг / мл гентамицина , И 1x pen-strep.
  4. Гранулируйте эпителиальные органоиды из смеси центрифугированием при 350 × g в течение 10 мин.
  5. Приостановить эпителиальные органоиды в 4 мл DMEM / F12 0,1 мг / мл ДНКазы I в течение 5 мин при комнатной температуре. Добавить 6 мл DMEM / F12 в конечныйОбъем 10 мл.
  6. Центрифугируют суспензию при 400 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре и отбрасывают супернатант.
  7. Ресуспендируют таблетку в 10 мл DMEM / F12. Центрифугируйте подвеску, но нажмите на тормоз, когда скорость достигает 400 x g. Отбросьте супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ. При попадании на тормоз эпителиальные органоиды быстро оседают, а фибробласты, как отдельные клетки, все еще остаются в супернатанте.
  8. Повторите шаг 5.6 и 5.7 5-7 раз. Добавьте каплю суспензии в гемоцитометр, а затем проверьте зазор фибробластов из органоидной смеси под микроскопом после каждого раунда центрифугирования ( рисунок 3 ).
  9. Пластину органоидов в покрытой желатином чашке, полученной на этапе 5.1, в течение 48 часов с DMEM / F12, содержащей 1x ITS, 5% FBS, 50 мкг / мл гентамицина, 10 нг / мл EGF и 1x перо-стрептококка.
  10. Через 48 часов удалите плавающие клетки в культуре, заменив среду свежей культуральной средой без FBS (DMEM / F12, содержащий 1x ITS, 50 мкг / мл гентамицина, 10 нг / мл EGF и 1x pen-strep).
  11. Убедитесь, что монослой клеток эпителия молочной железы мигрирует и вырастает из прикрепленных эпителиальных органоидов через 3 дня.

6. Отделение первичных мышей базальных / люминальных эпителиальных клеток молочной железы

  1. После 3-дневной культуры отделяйте первичные клетки молочной железы мыши с природной ферментной смесью с протеолитической и коллагенолитической ферментативной активностью в течение 20 мин. Нейтрализуйте активность фермента с 5% FBS в PBS.
  2. Центрифугируют суспензию при 450 × g в течение 10 мин при комнатной температуре и отбрасывают супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в дозе 5 мг / мл в течение 20 мин. Нейтрализуйте активность фермента с 5% FBS в PBS.
  3. Центрифугируют суспензию при 450 × g в течение 10 мин при комнатной температуре и отбрасывают супернатант.
  4. Повторно суспендировали клетки в 100 мкл PBS с 0,2% FBS в концентрации 10 7 клеток / мл с разбавленнымАнти-CD49f и анти-EpCAM антитела на льду в течение 1 часа в темноте.
  5. Промывают клетки с PBS и затем инкубируют клетки с конъюгированным с флуорофором вторичным антителом на льду в течение 30 мин в темноте.
  6. Мойте и повторно суспендируйте клетки в PBS с 0,2% FBS.
  7. Сортируйте эпителиальные клетки млекопитающих EpCAM hi / CD49f lo на сортировщике клеток 4 .

7. Внеклеточное везикул / экзосомальное лечение

  1. Выселили отсортированные эпителиальные клетки эпикальтера эпителия EpCAM hi / CD49f lo на стадии 6,7 на 6-луночных планшетах с желатиновым покрытием (2 × 10 5 клеток / лунку), а затем обработали их PBS или 2 мкг / мл NAMEC-полученных EVs / экзосомами Полученного на этапе 1.7.
  2. Чтобы обеспечить биологическую эффективность EVs / экзосом в долгосрочной культуральной обработке, замените среду для культивирования клеток свежей средой, содержащей PBS или 2 мкг / мл EVM / экзосомы, полученные NAMEC каждые два дня. Не разделяйте мышь primaВо время 10-дневного лечения.

8. Инъекция жировых клеток в эпителиальных клетках молочной железы

  1. Анестезируйте 3-недельную самку C57BL / 6 мышей с изофлуораном, 2-3% -ным ингалятором.
  2. Поместите анестезированную мышь на спину. Удалите мех на середине живота с помощью бритвы / крема для волос и очистите участок операции тремя чередующимися циклами 70% спирта и повидон-йода.
  3. Сделайте вертикальный разрез 1,5 см через кожу вдоль брюшной грудно-паховой области с помощью ножниц, а затем поочередно выставляйте правые и левые 4 -я молочные жировые подушки.
  4. Очистите каждую жировую прокладку, удалив паренхиму железы с помощью ножниц. Найдите лимфатический узел в жировой подушечке, а затем удалите паренхиму всей железы ниже лимфатического узла.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Две трети жировой прокладки должны оставаться на месте.
  5. Отсоедините клетки, полученные на стадии 7.2, с помощью природной смеси ферментов (см. Таблицу материалов ) с протеолитическим аЙ активности коллагенолитического фермента в течение 10 мин. Нейтрализуйте активность фермента с 5% FBS в PBS.
  6. Центрифугируют суспензию при 450 × g в течение 10 мин при комнатной температуре и отбрасывают супернатант. Подсчитайте клетки гемоцитометром и суспендируйте клетки в PBS с такой концентрацией, чтобы 15 мкл содержал желаемую дозу клетки (10 4 -10 2 клетки / пэд).
  7. Вложить 15 мкл суспензии клеток эпителия молочной железы в жировую подушку, используя 100 мкл стеклянного шприца, прикрепленного к иглам 27G.
  8. Повторите шаги 8.4-8.7 для жировой прокладки с другой стороны.
  9. Закройте кожу раневыми зажимами.

9. Целая гора молочной железы

  1. Эвтаназия мыши с СО 2 плюс дислокация шейки матки через 8 недель после инъекции клеток (этап 8.7).
  2. Сделайте вертикальный разрез через слой кожи от грудной области до паховой области с помощью ножниц, а затем выведите как правый, так и левый 4 -й мАммиачные жировые подушки. Удалите 4 грудные железы ( рис. 2 ).
  3. Распределите жировые подушечки на стеклянных подлокотках микроскопа и закрепите жировые накладки фиксатором Kahle (4% формальдегида, 30% EtOH и 2% ледяной уксусной кислоты) при комнатной температуре в течение ночи.
    Осторожно: фиксатор Kahle является раздражителем. Выполните этот шаг в химическом колпаке.
  4. Промыть жировые прокладки в 250 мл 70% EtOH в течение 15 мин, а затем в 250 мл dH 2 O в течение 5 мин. Вытрите жирные прокладки из карминового квасца (1 г кармина и 2,5 г сульфата алюминия в 500 мл dH 2 O) при комнатной температуре в течение ночи.
  5. Промойте жировые прокладки 250 мл 70% EtOH в течение 15 мин, 250 мл 95% EtOH в течение 15 мин и 250 мл 100% EtOH в течение 15 мин.
  6. Очищайте жировые прокладки в ксилоле в течение нескольких дней и прекратите инкубацию ксилола, когда жировые прокладки станут прозрачными.
    Осторожно: Ксилол является раздражающим. Выполните этот шаг в химическом колпаке.
  7. Смонтируйте слайды wiГо монтажа и снимать изображения (2,400 dpi) жировых прокладок с помощью цифрового слайдового сканера.

Результаты

Поскольку было показано, что блокирование передачи сигналов PGE 2 / EP 4 инициирует высвобождение EV / экзосомы из базальноподобных стволовых клеток 4 молочной железы, эта работа представляет собой метод выделения индуцированных EVs / экзосом из кул?...

Обсуждение

Экзосомы часто несут характеристики клеток, которые их высвобождают, а количество высвобожденных экзосом может индуцироваться стимулами 4 . Культуральную среду клеток можно собирать и подвергать дифференциальному ультрацентрифугированию для сбора EV / экзосомы (

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национальных научно-исследовательских институтов здравоохранения (05A1-CSPP16-014, HJL) и Министерства науки и технологий (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
MCDB 170 USBiologicalM2162
DMEM/F12Thermo1250062
Optima L-100K ultracentrifugeBeckman393253
SW28 Ti RotorBeckman342204
SW41 RotorBeckman331306
NANOSIGHT LM10MalvernNANOSIGHT LM10for nanoparticle tracking analysis (NTA)
Optiprep Sigma-AldrichD155660% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile).
CD81 antibodyGeneTexGTX1017661:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight 
CD9 antibodyGeneTexGTX1009121:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight 
CD63 antibodyAbcamAb594791:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight 
TSG101 antibodyGeneTexGTX1187361:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight 
GAPDHGeneTexGTX1001181:6000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight 
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester)ThermoV12883
FACSCaliburBD Biosciencesfluorescence cell analyzer
collagenase Type IV Thermo17104019
trypsinThermo27250018
 ITSSigma-AldrichI3146a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite
accutaseebioscience00-4555-56a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity
dispase STEMCELL79135 mg/ml = 5 U/ml
anti-CD49f antibodyBiolegend3136111:50
anti-EpCAM antibodyBiolegend1182131:200
FACSAriaBD Biosciencescell sorter
carmine alumSigma-AldrichC1022
human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs)gifts from Dr. Robert Weinberg
permountThermo Fisher Scientific SP15-500
sodium bicarbonateZymeset BSB101
EGFPeprotechAF-100-015
HydrocoritisoneSigma-AldrichSI-H0888
Insulin Sigma-AldrichSI-I9278
BPE (bovine pituitary extract)Hammod Cell Tech 1078-NZ
GW627368X Cayman10009162
15-cm culture dishFalcon 353025
table-top centrifugeEppendrof Centrifuge 3415R
ultracentrifuge tubeBeckman344058
PBS (Phosphate-buffered saline) Corning46-013-CM
BCA Protein AssayThermo Fisher Scientific 23228
Transmission Electron MicroscopyHitachiHT7700
gelatin STEMCELL7903
10-cm culture dishFalcon 353003
6-well culture dishCorning3516
female C57BL/6 miceNLAC (National Laboratory Animal Center
FBS (Fetal Bovine Serum)BioWest S01520
gentamycinThermo Fisher Scientific 15710072
Pen/StrepCorning30-002-Cl
DNase I5PRIMER2500120
isofluorane HalocarbonNPC12164-002-25
formaldehydeMACRONH121-08
EtOH (Ethanol)J.T. Baker800605
glacial acetic acidPanreac131008.1611
aluminum potassium sulfateSigma-Aldrich12625
Xylene Leica3803665
0.22 μm membranesMerck MilliporeMillex-GP
AUTOCLIP Wound Clips, 9 mmBD Biosciences427631
AUTOCLIP Wound Clip ApplierBD Biosciences427630
CellMask™ Deep RedThermo Fisher Scientific C10046plasma membrane stain

Ссылки

  1. Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
  2. Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
  3. Boelens, M., et al. Exosome Transfer from Stromal to Breast Cancer Cells Regulates Therapy Resistance Pathways. Cell. 159 (3), 499-507 (2014).
  4. Lin, M. C., et al. PGE2 /EP4 Signaling Controls the Transfer of the Mammary Stem Cell State by Lipid Rafts in Extracellular Vesicles. Stem Cells. , (2016).
  5. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
  6. György, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  7. Olver, C., Vidal, M. Proteomic analysis of secreted exosomes. Subcell Biochem. 43, 99-131 (2007).
  8. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  9. Prater, M. D., et al. Mammary stem cells have myoepithelial cell properties. Nat Cell Biol. 16 (10), 942-950 (2014).
  10. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  11. Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  12. Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
  13. Riches, A., Campbell, E., Borger, E., Powis, S. Regulation of exosome release from mammary epithelial and breast cancer cells - a new regulatory pathway. Eur J Cancer. 50 (5), 1025-1034 (2014).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  15. van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  16. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), E968-E977 (2016).
  17. Li, D., et al. ADVANCED IMAGING. Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics. Science. 349 (6251), (2015).
  18. Outzen, H. C., Custer, R. P. Growth of human normal and neoplastic mammary tissues in the cleared mammary fat pad of the nude mouse. J Natl Cancer Inst. 55 (6), 1461-1466 (1975).
  19. Sheffield, L. G., Welsch, C. W. Transplantation of human breast epithelia to mammary-gland-free fat-pads of athymic nude mice: influence of mammotrophic hormones on growth of breast epithelia. Int J Cancer. 41 (5), 713-719 (1988).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

124

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены