Transfert de la capacité de formation des glandes mammaires entre les cellules épithéliales basales mammaires et les cellules luminesnelles mammaires par des vésicules extracellulaires / des exosomes

Résumé

Ce protocole décrit des méthodes pour purifier, quantifier et caractériser les vésicules extracellulaires (EV) / les exosomes provenant de cellules épithéliales mammaires non adhérentes / mésenchymateuses et pour les utiliser pour transférer la capacité de formation de glandes mammaires aux cellules épithéliales mammaires luminescentes. Les EV / exosomes dérivés de cellules épithéliales mammaires de type tige peuvent transférer cette propriété cellulaire vers des cellules qui ingerent les EV / exosomes.

Résumé

Les cellules peuvent communiquer via des exosomes, des vésicules extracellulaires de 100 nm (EV) qui contiennent des protéines, des lipides et des acides nucléiques. Les vésicules extracellulaires dérivées des cellules épithéliales mammaires non adhérentes / mésenchymateuses (NAMEC) peuvent être isolées à partir du milieu NAMEC par ultracentrifugation différentielle. Sur la base de leur densité, les EV peuvent être purifiés par ultracentrifugation à 110 000 x g. La préparation EV de l'ultracentrifugation peut être séparée davantage en utilisant un gradient de densité continue pour éviter la contamination par des protéines solubles. Les EV purifiés peuvent ensuite être évalués à l'aide d'une analyse de suivi des nanoparticules, qui mesure la taille et le nombre de vésicules dans la préparation. Les vésicules extracellulaires d'une taille allant de 50 à 150 nm sont des exosomes. Les EV / exosomes dérivés de NAMEC peuvent être ingérés par des cellules épithéliales mammaires, qui peuvent être mesurées par cytométrie de flux et microscopie confocale. Certaines propriétés de cellules souches mammaires ( p. Ex., Capacité de formation de glandes mammaires) peuventÊtre transféré des NAMEC de type tige aux cellules épithéliales mammaires via les EV / exosomes dérivés de NAMEC. Les cellules épithéliales mammaires primaires primaires isolées EpCAM ^hi / CD49f ^lo luminal ne peuvent pas former de glandes mammaires après avoir été transplantées dans des tampons à graisse de souris, tandis que les cellules épithéliales mammaires basiques EpCAM ^lo / CD49f ^hi forment des glandes mammaires après une transplantation. L'absorption des EV / exosomes dérivés de NAMEC par les cellules epitheliales mammaires EpCAM ^hi / CD49f ^lo luminal leur permet de générer des glandes mammaires après avoir été transplanté dans des graisses. Les EV / exosomes dérivés de cellules épithéliales mammaires de type tige transfèrent la capacité de formation de glandes mammaires aux cellules epitheliales mammaires EpCAM ^hi / CD49f ^lo luminal.

Introduction

Les exosomes peuvent méditer la communication cellulaire en transférant des protéines membranaires et cytosoliques, des lipides et des ARN entre les cellules ¹ . La communication à médiation exosome a été démontrée comme impliquant de nombreux processus physiologiques et pathologiques ( ex: présentation de l'antigène, développement de la tolérance ² et progression de la tumeur ³ ). Les exosomes ont souvent des contenus similaires à ceux des cellules sources qui les libèrent. Ainsi, les exosomes peuvent transporter des propriétés cellulaires spécifiques des cellules sources et transférer ces propriétés aux cellules qui les ingestion ⁴ .

Les exosomes sont des vésicules membranaires à double couche de 50 à 150 nm et présentent des marqueurs spécifiques ( p. Ex., CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix et TSG101). Ainsi, les exosomes doivent être caractérisés par diverses méthodes pour différents aspects. La microscopie électronique à transmission peut être utilisée pour visualiser les vésicules membranairesTels que les exosomes ^{4 , 5} . L'analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et l'analyse dynamique de la diffusion de la lumière (DLS) sont utilisées pour mesurer la taille et le nombre d'exosomes purifiés ⁴ . La teneur en membrane lipidique des exosomes peut être vérifiée par gradient de densité. Les marqueurs exosomaux, tels que CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix et TSG101 ^{6 , 7} , peuvent être mesurés par Western Blot.

Les cellules basales mammaires ont la capacité de générer des glandes mammaires lorsqu'elles sont implantées dans des tampons à graisse, tandis que les cellules luminaires ne peuvent pas ^{8 , 9 , 10} . Ainsi, les cellules basales mammaires sont également appelées unités reproductrices mammaires. En utilisant le modèle de cellules mammaires basales et luminales, on peut examiner la capacité des EV / exosomes à transférer les caractéristiques cellulaires entre différentes populations cellulaires. Ce travailDémontre la méthode de transfert de la capacité de formation de glande des cellules épithéliales basales mammaires aux cellules épithéliales luminescales mammaires en utilisant EVs / exosomes dérivés de cellules épithéliales basales mammaires. Les cellules épithéliales mammaires luminal ont acquis des propriétés basales après l'ingestion d'EV / exosomes sécrétés à partir de cellules basales et peuvent alors former des glandes mammaires ⁴ .

Protocole

Toutes les recherches impliquant des animaux ont respecté les protocoles approuvés par le Comité institutionnel sur les soins des animaux.

1. Isolation et validation de la vésicule extracellulaire / exosome

1. Cellules basales épithéliales mammaires de culture, NAMEC ⁴ , avec un milieu frais exempt de sérum de 500 ml de MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml de DMEM / F12 avec du bicarbonate de sodium (0,2438%); EGF (5 ng / mL); Hydrocoritisone (0,5 μg / mL); Insuline (5 μg / mL); Extrait d'hypophyse bovine (BPE; 35 μg / mL); Et GW627368X (1 μg / mL) dans des plats de 15 cm.
2. Après avoir compté les cellules avec un hémocytomètre, semmez 1,2 x 10 ⁶ cellules dans 12 ml de milieu par plat de 15 cm le jour 0 pendant 4 jours ⁴ .
3. Après 4 jours de culture, centrifuger le milieu de culture à 300 xg pendant 5 minutes en utilisant une centrifugeuse à table. Transférer le surnageant dans un tube conique ( Figure 1 ).
4. Centrifuger le surnageantÀ 2 000 xg pendant 20 min dans une centrifugeuse à table. Transférer le surnageant dans un tube à ultracentrifugation et laisser les cellules mortes et les débris cellulaires ( Figure 1 ).
5. Centrifuger le surnageant à 10 000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube ultracentrifugeuse ( Figure 1 ).
6. Centrifuger le surnageant à 110 000 xg pendant 60 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre en suspension le granulat EV / exosome dans PBS ( Figure 1 ).
7. Centrifuger le surnageant à 110 000 xg pendant 60 min à 4 ° C. Retirer le surnageant. Remettre en suspension la granulés EV / exosome dans PBS ( Figure 1 ). Remettre en suspension la pastille isolée de 240-480 ml de milieu conditionné NAMEC dans 100 μL.
8. Mesurer la concentration en protéines de la suspension EV avec l'analyse des protéines BCA. Assurez-vous que la concentration est d'environ 20 à 40 μg / 100 μL. Conserver à -20 ° C pourAnalyse approfondie.
9. Mesurer la concentration et la taille des EV / exosomes par analyse de suivi des nanoparticules (NTA), comme décrit précédemment par Gardiner et al. ¹¹ . Diluer les EV / exosomes (20 μg / 100 μL) avec PBS à 10 000 fois pour l'analyse NTA.
   NOTE: Le résultat de l'analyse NTA reflète le nombre et la taille des vésicules analysées.
10. Image des EV / exosomes avec microscopie électronique de transmission (TEM), comme décrit précédemment par Lin et al ⁴ .

2. Purification d'exosome à l'aide d'un gradient de densité

1. Remettre en suspension la pastille de 110 000 g de l'étape 1.7 dans de l'iodixanol à 40% (p / v) dans du PBS (2 ml). Superposer le mélange en séquence avec des aliquotes d'iodixanol à 30%, 20%, 10% et 5% (p / v) dans du PBS (2 ml chacun) pour former un gradient de densité dans un tube à ultracentrifugation.
2. Centrifuger le mélange à 200 000 xg pendant 8 h à 4 ° C.
3. Recueillir chaque fraction de gradient (10 fractiOns; 1 ml / fraction) avec une pipette du haut du tube.
4. Analyser la présence de marqueurs d'exosome ( p. Ex., CD81, CD9, CD63 et Tsg101) dans chaque fraction par SDS-PAGE ¹² et Western blot. Charger 50 -LL de suspensions de chaque fraction sur un gel à 10% contenant 0,1% (p / v) de SDS et séparer les protéines en fractions par électrophorèse sur gel.
5. Transférer les protéines d'un gel à une membrane de PVDF et incuber la membrane avec des anticorps contre les marqueurs d'exosome ( p. Ex., CD81, CD9, CD63 et Tsg101) et la protéine GAPDH pendant la nuit ( Tableau des matériaux ) à 4 ° C.
   REMARQUE: le résultat identifie la fraction contenant des exosomes.

3. Étiquetage extracellulaire de la vésicule / exosome

1. Suspendre les EV / exosomes, obtenus à l'étape 1.7, dans 10 μM d'ester de diacétate de succinimidyle de carboxyfluorescéine (CFSE) à 20 μg de protéine exosomale / 100 μL. Préparer un échantillon parallèle coNe réduisant que le CFSE et le PBS, traités de la même manière, comme un témoin négatif pour les tests d'absorption EV / exosome ultérieurs. Laisser les mélanges à 37 ° C pendant 30 min.
2. Suspendre les EV / exosomes dans 50x volume de PBS et centrifuger la suspension à 110 000 xg pendant 60 minutes à 4 ° C. Retirer le surnageant et remettre à nouveau le culot EV / exosome dans du PBS. Répétez l'étape 3.2 une fois.
3. Suspendre les EV / exosomes dans le PBS à une concentration de 20 μg de protéine exosomale / 100 μL, puis filtrer les EV / exosomes à travers des membranes de 0,22 μm avant d'ajouter les EV / exosomes aux cellules.

4. Essai extracellulaire de la vésicule / exosome

1. Pour fabriquer un milieu de culture, mélanger 500 ml de MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml de DMEM / F12 avec du bicarbonate de sodium (0,2438%); EGF (5 ng / mL); Hydrocoritisone (0,5 μg / mL); Insuline (5 μg / mL); Et BPE (35 μg / mL) ⁴ . Placer les cellules HMLE épithéliales mammaires humaines dans des plats à 6 puits (1 x 10 ^{6 <}/ Sup> cellules / puits) un jour avant le traitement EV / exosome. Ajouter des EV / exosome marqués par fluorescence CFSE de 2 μg / mL, obtenus à l'étape 3.3, au milieu de culture des cellules HMLE pendant 2 à 6 h. Traiter les cellules HMLE du groupe de contrôle négatif avec la préparation parallèle, décrite à l'étape 3.1.
2. Après l'incubation de 2 à 6 heures, laver les cellules deux fois avec 4 ml de PBS à température ambiante.
3. Détachez les cellules avec 0,25% de trypsine pendant 10 min et ré-suspendez les cellules dans du PBS contenant 0,2% de FBS. Mesurer l'absorption EV / exosome de l'intensité de fluorescence dans les cellules en utilisant un analyseur de cellules de fluorescence ⁴ . Image des cellules traitées avec EVs / exosomes ou le contrôle négatif à l'aide de microscopie confocale.
   NOTE: La fluorescence verte dans les cellules est causée par l'absorption EV / exosome. Voir la légende de la figure 6 pour les paramètres du microscope.

5. Isolation des cellules épithéliales mammaires de la souris primaire

1. Préparez des plats enduits de gélatine en ajoutant 12 ml de solution de gélatine à 0,1% à des plats de 10 cm. Placer les plaques dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 min. Retirez la solution de gélatine et laissez les couvercles hors de la vaisselle dans un capot d'écoulement laminaire pendant 4 h jusqu'à ce que le revêtement de gélatine soit séché.
2. Dissectionnez les glandes mammaires numéro 2, 3, 4 et 5 ( Figure 2 ) à partir de souris C57BL / 6 vierges femelles de 12 semaines utilisant des ciseaux et coupez les glandes en petits morceaux (2 mm ² ) à l'aide d'un rasoir.
3. Dissociez encore davantage la suspension de glandes mammaires (à partir de 10 souris) pendant 60 minutes à 37 ° C, une agitation de 120 tr / min avec 50 ml de DMEM / F12 contenant 0,2% de collagénase de type IV, 0,2% de trypsine, 5% de FBS, 5 μg / ml de gentamycine , Et 1x streptocoque.
4. Pellet en descendant les organoïdes épithéliaux du mélange par centrifugation à 350 xg pendant 10 min.
5. Suspendre les organoïdes épithéliaux dans 4 mL de DMEM / F12 avec 0,1 mg / mL d'ADNase I pendant 5 minutes à température ambiante. Ajouter 6 mL de DMEM / F12 à une finaleVolume de 10 ml.
6. Centrifuger la suspension à 400 xg pendant 10 min à température ambiante et jeter le surnageant.
7. Remettre en suspension la pastille dans 10 mL de DMEM / F12. Centrifugez la suspension mais frappez le frein lorsque la vitesse atteint 400 x g. Jeter le surnageant.
   REMARQUE: En frappant le frein, les organoïdes épithéliaux sont rapidement massés en pellets, tandis que les fibroblastes, en tant que cellules individuelles, restent encore sur le surnageant.
8. Répétez l'étape 5.6 et 5.7 5-7 fois. Ajouter une goutte de suspension à un hémocytomètre, puis vérifier le dégagement des fibroblastes du mélange organoïde sous microscopie après chaque cycle de centrifugation ( Figure 3 ).
9. Placer les organoïdes dans le plat revêtu de gélatine, obtenu à l'étape 5.1, pendant 48 h avec DMEM / F12 contenant 1x ITS, 5% de FBS, 50 μg / ml de gentamycine, 10 ng / mL d'EGF et 1x stylo-streptococèses.
10. Après 48 h, retirer les cellules flottantes dans la culture en remplaçant le milieu par un milieu de culture frais sans FBS (DMEM / F12 contenant 1x ITS, 50 μg / ml de gentamycine, 10 ng / mL EGF et 1x stylo-streptococèses).
11. Confirmez qu'une monocouche de cellules épithéliales mammaires migre et se développe à partir des organoïdes épithéliaux attachés en 3 jours.

6. Séparation des cellules épithéliales mammaires basales / luminescales primaires

1. Après la culture de 3 jours, détachez les cellules mammaires primaires de souris avec un mélange enzymatique naturel avec une activité enzymatique protéolytique et collagénolytique pendant 20 min. Neutraliser l'activité enzymatique avec 5% de FBS dans du PBS.
2. Centrifuger la suspension à 450 xg pendant 10 min à température ambiante et jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot cellulaire dans une solution à 5 mg / ml pendant 20 min. Neutraliser l'activité enzymatique avec 5% de FBS dans du PBS.
3. Centrifuger la suspension à 450 xg pendant 10 min à température ambiante et jeter le surnageant.
4. Remis en suspension les cellules dans 100 ul de PBS avec 0,2% de FBS à une concentration de 10 ⁷ cellules / mL avec le diluantAnticorps anti-CD49f et anti-EpCAM sur de la glace pendant 1 h dans l'obscurité.
5. Lavez les cellules avec du PBS puis incupez les cellules avec un anticorps secondaire conjugué au fluorophore sur de la glace pendant 30 minutes dans l'obscurité.
6. Laver et ré-suspendre les cellules dans du PBS avec 0,2% de FBS.
7. Trier les cellules épithéliales mammaires EpCAM ^hi / CD49f ^lo luminal sur un trieur de cellules ⁴ .

7. Traitement extracellulaire de la vésicule / exosome

1. Graisser les cellules epitheliales mammaires EpCAM ^hi / CD49f ^lo luminal triées de l'étape 6.7 sur des boîtes à 6 puits revêtues de gélatine (2 x 10 ⁵ cellules / puits) puis les traiter avec du PBS ou des EV / exosomes dérivés de NAMEC de 2 μg / mL Obtenu à l'étape 1.7.
2. Pour assurer l'efficacité biologique des EV / exosomes dans le traitement de culture à long terme, remplacer le milieu de culture cellulaire par un milieu frais contenant du PBS ou des EV / exosomes dérivés de NAMEC à 2 μg / mL tous les deux jours. Ne divisez pas la souris primaPendant les 10 jours de traitement.

8. Injection par graisse des cellules épithéliales mammaires

1. Anesthésier une souris C57BL / 6 femelle de 3 semaines avec de l'isofluorane à 2-3% d'inhalation.
2. Placez la souris anesthésiée sur son dos. Retirez la fourrure sur le milieu de l'abdomen avec un rasoir / crème capillaire et nettoyez le site chirurgical avec trois cycles alternatifs de 70% d'alcool et de povidone-iode.
3. Faire une incision verticale de 1,5 cm à travers la peau le long de la région thoracique-inguinale ventrale avec des ciseaux et ensuite exposer alternativement les 4ème capsules de graisse mammaire droite et gauche.
4. Effacez chaque coussinet gras en éliminant le parenchyme des glandes avec des ciseaux. Localisez le ganglion lymphatique dans le tampon gras, puis retirez le parenchyme de la glande entière au-dessous du ganglion lymphatique.
   REMARQUE: les deux tiers de la graisse devraient rester en place.
5. Détachez les cellules obtenues à partir de l'étape 7.2 avec un mélange enzymatique naturel (voir le tableau des matériaux ) avec une protéolytique aNd activité enzymatique collagénolytique pendant 10 min. Neutraliser l'activité enzymatique avec 5% de FBS dans du PBS.
6. Centrifuger la suspension à 450 xg pendant 10 min à température ambiante et jeter le surnageant. Compter les cellules avec un hémocytomètre et suspendre les cellules dans du PBS à une concentration telle que 15 μL contient la dose cellulaire souhaitée (10 ⁴ -10 ² cell / pad).
7. Injecter 15 μL de suspension de cellules épithéliales mammaires dans un tampon gras en utilisant une seringue en verre de 100 μl attachée à une aiguille 27G.
8. Répétez les étapes 8.4-8.7 pour le tampon gras de l'autre côté.
9. Fermez la peau avec des clips enroulés.

9. Mammale Gland Whole Mount

1. Euthanaser la souris avec une dislocation cervicale CO ₂ plus 8 semaines après l'injection cellulaire (étape 8.7).
2. Faire une incision verticale à travers la couche de peau de la région thoracique à la région inguinale à l'aide de ciseaux, puis exposer les deux à droite et à gauche 4 mCoussinets gras gras. Enlevez les 4 ^th glandes mammaires ( Figure 2 ).
3. Posez les coussinets gras sur les lames de microscope en verre et fixez les coussinets gras avec le fixateur de Kahle (4% de formaldéhyde, 30% d'EtOH et 2% d'acide acétique glacial) à température ambiante pendant une nuit.
   Attention: le fixateur de Kahle est un irritant. Effectuez cette étape dans un capot chimique.
4. Laver les tampons gras dans 250 ml d'EtOH à 70% pendant 15 minutes puis dans 250 ml de dH ₂ O pendant 5 min. Tachez les tampons gras avec de l'alun de carmin (1 g de carmin et 2,5 g de sulfate de potassium d'aluminium dans 500 ml de dH2O) à température ambiante pendant une nuit.
5. Laver les tampons gras avec 250 ml d'EtOH à 70% pendant 15 min, 250 ml d'EtOH à 95% pendant 15 minutes et 250 ml d'EtOH à 100% pendant 15 min.
6. Nettoyez les tampons gras dans le xylène pendant des jours et arrête l'incubation au xylène lorsque les graisses se transforment.
   Attention: le xylène est un irritant. Effectuez cette étape dans un capot chimique.
7. Monter les diapositives avecÈme support de montage et prenez des images (2,400 ppp) des blocs de graisse à l'aide d'un scanner à glissière numérique.

Résultats

Comme il a été démontré que le blocage de la signalisation de PGE ₂ / EP ₄ déclenche la libération d'EV / exosome à partir de cellules souches basales de type mammaire ⁴ , ce travail présente une méthode pour isoler les EV / exosomes induits de la culture de cellules basales épithéliales mammaires (NAMEC). Étant donné que les NAMEC sont cultivés dans un milieu exempt de sérum, il n'existe pas d'EVs / exosomes préex...

Discussion

Les exosomes portent souvent des caractéristiques des cellules qui les libèrent, et la quantité d'exosomes libérés peut être induite par des stimuli ⁴ . Le milieu de culture des cellules peut être collecté et soumis à une ultracentrifugation différentielle pour la collecte EV / exosome ( figure 1 ). Il n'existe actuellement aucun accord général sur une méthode idéale pour isoler EV / exosomes. La méthode optimale utilisée ici a été détermin...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCDB 170	USBiological	M2162
DMEM/F12	Thermo	1250062
Optima L-100K ultracentrifuge	Beckman	393253
SW28 Ti Rotor	Beckman	342204
SW41 Rotor	Beckman	331306
NANOSIGHT LM10	Malvern	NANOSIGHT LM10	for nanoparticle tracking analysis (NTA)
Optiprep	Sigma-Aldrich	D1556	60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile).
CD81 antibody	GeneTex	GTX101766	1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
CD9 antibody	GeneTex	GTX100912	1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
CD63 antibody	Abcam	Ab59479	1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
TSG101 antibody	GeneTex	GTX118736	1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
GAPDH	GeneTex	GTX100118	1:6000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester)	Thermo	V12883
FACSCalibur	BD Biosciences		fluorescence cell analyzer
collagenase Type IV	Thermo	17104019
trypsin	Thermo	27250018
ITS	Sigma-Aldrich	I3146	a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite
accutase	ebioscience	00-4555-56	a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity
dispase	STEMCELL	7913	5 mg/ml = 5 U/ml
anti-CD49f antibody	Biolegend	313611	1:50
anti-EpCAM antibody	Biolegend	118213	1:200
FACSAria	BD Biosciences		cell sorter
carmine alum	Sigma-Aldrich	C1022
human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs)			gifts from Dr. Robert Weinberg
permount	Thermo Fisher Scientific	SP15-500
sodium bicarbonate	Zymeset	BSB101
EGF	Peprotech	AF-100-015
Hydrocoritisone	Sigma-Aldrich	SI-H0888
Insulin	Sigma-Aldrich	SI-I9278
BPE (bovine pituitary extract)	Hammod Cell Tech	1078-NZ
GW627368X	Cayman	10009162
15-cm culture dish	Falcon	353025
table-top centrifuge	Eppendrof	Centrifuge 3415R
ultracentrifuge tube	Beckman	344058
PBS (Phosphate-buffered saline)	Corning	46-013-CM
BCA Protein Assay	Thermo Fisher Scientific	23228
Transmission Electron Microscopy	Hitachi	HT7700
gelatin	STEMCELL	7903
10-cm culture dish	Falcon	353003
6-well culture dish	Corning	3516
female C57BL/6 mice	NLAC (National Laboratory Animal Center
FBS (Fetal Bovine Serum)	BioWest	S01520
gentamycin	Thermo Fisher Scientific	15710072
Pen/Strep	Corning	30-002-Cl
DNase I	5PRIMER	2500120
isofluorane	Halocarbon	NPC12164-002-25
formaldehyde	MACRON	H121-08
EtOH (Ethanol)	J.T. Baker	800605
glacial acetic acid	Panreac	131008.1611
aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	12625
Xylene	Leica	3803665
0.22 μm membranes	Merck Millipore	Millex-GP
AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm	BD Biosciences	427631
AUTOCLIP Wound Clip Applier	BD Biosciences	427630
CellMask™ Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C10046	plasma membrane stain