通过细胞外囊泡/外来体转移乳腺基质上皮细胞和乳腺腔细胞之间的乳腺形成能力

摘要

该方案描述了从非贴壁/间充质乳腺上皮细胞中纯化，定量和表征细胞外囊泡（EVs）/外来体的方法，并使用它们将乳腺形成能力转移到乳腺上皮细胞。衍生自茎状乳腺上皮细胞的EVs /外来体可以将该细胞特性转移到摄入EV /外来体的细胞中。

摘要

细胞可以通过外来体，含有蛋白质，脂质和核酸的〜100-nm胞外囊泡（EVs）进行通信。非贴壁/间充质乳腺上皮细胞（NAMEC）衍生的细胞外囊泡可以通过差异超速离心从NAMEC培养基中分离。基于它们的密度，EV可以通过110,000×g的超速离心纯化。可以使用连续密度梯度进一步分离来自超速离心的EV制剂，以防止可溶性蛋白质的污染。然后可以使用纳米颗粒跟踪分析进一步评估纯化的EV，其测量制剂中囊泡的大小和数量。尺寸范围为50至150nm的细胞外囊泡是外来体。 NAMEC衍生的EVs /外来体可以通过乳腺上皮细胞摄取，可以通过流式细胞术和共焦显微镜检测。一些乳腺干细胞性质（ 如乳腺形成能力）可以通过来自NAMEC的EVs /外来体从茎状NAMEC转移到乳腺上皮细胞。分离的原代EpCAM ^hi / CD49f细胞乳腺上皮细胞在移植到小鼠脂肪垫后不能形成乳腺，而EpCAM ^lo / CD49f基底乳腺上皮细胞在移植后形成乳腺。通过EpCAM ^hi / CD49f细胞乳腺上皮细胞摄取NAMEC衍生的EVs /外来体允许它们在移植到脂肪垫中之后产生乳腺。衍生自干样乳腺上皮细胞的EVs /外来体转移到EpCAM ^hi / CD49f细胞乳腺上皮细胞的乳腺形成能力。

引言

外来体可以通过在细胞之间转移膜和细胞质蛋白，脂质和RNA来介导细胞交流¹ 。已经证明外来体介导的通信涉及许多生理和病理过程（ 即抗原呈递，耐受性发展²和肿瘤进展³ ）。外来体通常具有与释放它们的源细胞相似的内容。因此，外来体可以从源细胞携带特定的细胞特性，并将这些性质转移到摄取它们的细胞中。

外来体是50至150纳米的双层膜囊泡，并呈现特异性标记（ 例如 CD9，CD81，CD63，HSP70，Alix和TSG101）。因此，外来体必须通过不同方面的各种方法来表征。透射电子显微镜可用于观察膜囊泡如外来体^4,5 。纳米粒子跟踪分析（NTA）和动态光散射分析（DLS）用于测量纯化外来体的大小和数量⁴ 。可以通过密度梯度验证外来体的脂质膜含量。染色体标志物，例如CD9，CD81，CD63，HSP70，Alix和TSG101,6,7可以通过Western印迹法测定。

乳腺基底细胞在植入脂肪垫时具有产生乳腺的能力，而腔细胞不能^8,9,10 。因此，乳腺基底细胞也称为乳腺再生单位。通过使用乳腺基底细胞和腔细胞模型，可以检测EVs /外来体在不同细胞群体之间转运细胞特征的能力。这个工作证明了通过使用源自乳腺基底上皮细胞的EVs /外来体将腺体形成能力从乳腺基底上皮细胞转移到乳腺腔上皮细胞的方法。乳腺上皮细胞摄取基底细胞分泌的EV /外来体后获得基础细胞特性，然后形成乳腺。

研究方案

所有涉及动物的研究均符合动物保护机构委员会批准的方案。

细胞外囊泡/外来体分离和鉴定

1. 培养乳腺上皮基底细胞NAMEC4，用500mL MCDB 170，pH 7.4 + 500mL DMEM / F12与碳酸氢钠（0.2438％）制备的新鲜无血清培养基; EGF（5 ng / mL）;氢可替康（0.5μg/ mL）;胰岛素（5μg/ mL）;牛垂体提取物（BPE;35μg/ mL）;和GW627368X（1μg/ mL）。
2. 用血细胞计数器计数细胞后，在第0天将1.2×10 ^6个细胞在每15cm培养皿中的12mL培养基中种植4天⁴ 。
3. 培养4天后，使用台式离心机将培养基以300×g离心5分钟。将上清液转移到锥形管（ 图1 ）。
4. 离心上清液在台式离心机中以2,000 x g进行20分钟。将上清液转移到超速离心管中，留下死细胞和细胞碎片（ 图1 ）。
5. 在4℃下以10,000xg离心上清30分钟。将上清液转移到新的超速离心管（ 图1 ）。
6. 在4℃下将上清液以110,000xg离心60分钟。去除上清液并将EV /外来物质沉淀重悬于PBS中（ 图1 ）。
7. 在4℃下将上清液以110,000xg离心60分钟。去除上清液。重悬于PBS中的EV /外来体颗粒（ 图1 ）。将从240-480 mL NAMEC条件培养基中分离的沉淀物重悬于100μL。
8. 用BCA蛋白测定法测定EV悬浮液的蛋白质浓度。确保浓度在20-40μg/ 100μL左右。储存于-20°C进一步分析。
9. 通过纳米粒子跟踪分析（NTA）测量EVs /外来体的浓度和大小，如Gardiner 等人先前所述。 ¹¹ 。用PBS稀释EVs /外来体（20μg/100μL）至NTA分析10,000倍。
   注意:NTA分析的结果反映了分析的囊泡的数量和大小。
10. 用透射电子显微镜（TEM）对EV /外来体进行成像，如Lin 等人 ⁴所述。

2.使用密度梯度的外来体纯化

1. 将来自步骤1.7的110,000g沉淀物重悬于40％（w / v）碘克沙醇的PBS（2mL）中。按照在PBS（每次2mL）中的30％，20％，10％和5％（w / v）碘克沙醇的等分试样依次覆盖混合物，以在超速离心管中形成密度梯度。
2. 将混合物在4℃下以200,000xg离心8小时。
3. 收集每个梯度分数（10分）附件; 1 mL /分），从管顶部移液。
4. 通过SDS-PAGE ¹²和Western印迹分析每个级分中exosome标记物（ 如 CD81，CD9，CD63和Tsg101）的存在。将每个级分的50μL悬浮液加到含有0.1％（w / v）SDS的10％凝胶上，并用凝胶电泳分离各部分的蛋白质。
5. 将蛋白质从凝胶转移到PVDF膜，并在4℃下将膜与抗外来体标记物（ 例如 CD81，CD9，CD63和Tsg101）和内脏蛋白GAPDH孵育过夜（ 表材料 ）。
   注意:结果确定含有外来体的部分。

细胞外囊泡/外来体标签

1. 将20μl胞外蛋白/100μL的步骤1.7获得的EVs /外来体悬浮于10μM羧基荧光素琥珀酰亚胺基二乙酸酯（CFSE）中。准备一个平行样本公司仅以相同的方式处理CFSE和PBS，作为后续EV /外来物吸收测定的阴性对照。将混合物在37℃下放置30分钟。
2. 将EVs /外来体悬挂在50倍体积的PBS中，并在4℃下以110,000xg离心悬浮液60分钟。去除上清液并将EV /外来物质沉淀重悬于PBS中。重复步骤3.2一次。
3. 将EVs /外来体悬浮在PBS中，浓度为20μg的外来蛋白/100μL，然后在将EV /外来体添加到细胞之前通过0.22μm膜过滤EV /外来体。

细胞外囊泡/外来体摄取测定

1. 为了制备培养基，将500mL的MCDB 170，pH 7.4 + 500mL的DMEM / F12与碳酸氢钠（0.2438％）混合; EGF（5 ng / mL）;氢可替康（0.5μg/ mL）;胰岛素（5μg/ mL）;和BPE（35μg/ mL） ⁴ 。将人乳腺上皮HMLE细胞置于6孔培养皿中（1×10 ^6个/ sup>细胞/孔），EV / exosome处理前一天。将2μg/ mL CFSE荧光标记的EVs / exosome（在步骤3.3中获得）添加到HMLE细胞的培养基中2-6小时。用平行制剂处理阴性对照组的HMLE细胞，如步骤3.1所述。
2. 孵育2至6小时后，在室温下用4mL PBS洗涤细胞两次。
3. 用0.25％胰蛋白酶分离细胞10分钟，并将细胞重新悬浮在含有0.2％FBS的PBS中。使用荧光细胞分析仪测量细胞中荧光强度的EV /外来体摄取。使用共聚焦显微镜对用EVs /外来体处理的细胞或阴性对照进行成像。
   注意:细胞中的绿色荧光是由EV /外来体吸收引起的。有关显微镜设置， 请参见图6的图例。

5.分离原代小鼠乳腺上皮细胞

1. 通过向10cm的培养皿中加入12mL的0.1％明胶溶液来制备明胶包衣的菜肴。将板放在37℃的培养箱中30分钟。取出明胶溶液，并将盖子从层流罩中离开盘子4小时直到明胶涂层干燥。
2. 使用剪刀从12周龄的女性C57BL / 6小鼠解剖数目2,3,4和5个乳腺（ 图2 ），并使用剃须刀将腺切成小块（2mm）。
3. 进一步解离乳腺浆液（10只小鼠）在37℃，60分钟搅拌120毫升DMEM / F12含0.2％胶原酶IV，0.2％胰蛋白酶，5％FBS，5微克/毫升庆大霉素和1x pen-strep。
4. 通过在350×g离心10分钟从混合物中沉淀上皮组织。
5. 将上清组织悬浮于4mL含有0.1mg / mL DNA酶I的DMEM / F12中，室温5分钟。加入6mL DMEM / F12至最终体积10 mL。
6. 将悬浮液在室温下以400xg离心10分钟，弃去上清液。
7. 将沉淀重悬于10mL DMEM / F12中。离心机悬挂，当速度达到400 x g时，刹车。丢弃上清液。
   注意:通过击打制动器，上皮组织被迅速沉淀下来，而成纤维细胞作为单细胞仍然停留在上清液中。
8. 重复5.6和5.7 5-7次。将一滴悬浮液添加到血细胞计数器中，然后在每次离心后在显微镜下检查来自有机体混合物的成纤维细胞的清除（ 图3 ）。
9. 将含有1x ITS，5％FBS，50μg/ mL庆大霉素，10ng / mL EGF和1×pen-strep的DMEM / F12，在步骤5.1中获得的明胶包被的培养皿中的组织样品放置48小时。
10. 48小时后，用不含FBS的新鲜培养基替换培养基，去除培养物中的浮游细胞（含有ITS，50μg/ mL庆大霉素，10ng / mL EGF和1x pen-strep的DMEM / F12）。
11. 确认单层乳腺上皮细胞在3天内迁移并从附着的上皮组织中生长出来。

原代小鼠基底/乳腺上皮细胞分离

1. 3天培养后，用具有蛋白水解和胶原酶活性的天然酶混合物分离小鼠原代乳腺细胞20分钟。用PBS中的5％FBS中和酶活性。
2. 在室温下将悬浮液以450×g离心10分钟，弃去上清液。将细胞沉淀重悬于5mg / mL分散液中20分钟。用PBS中的5％FBS中和酶活性。
3. 在室温下将悬浮液以450×g离心10分钟，弃去上清液。
4. 用浓度为10 ^7个细胞/ mL的稀释的0.2％FBS将细胞重新悬浮于100μLPBS中抗CD49f和抗EpCAM抗体在黑暗中1小时。
5. 用PBS洗涤细胞，然后在黑暗中将细胞与荧光团缀合的第二抗体在冰上孵育30分钟。
6. 用0.2％FBS洗涤并重新悬浮在PBS中的细胞。
7. 将细胞分选器⁴上的EpCAM ^hi / CD49f细胞乳腺上皮细胞分选。

细胞外囊泡/外来体治疗

1. 将来自步骤6.7的明胶包被的6孔培养皿（2×10 ^5个细胞/孔）上的分选的EpCAM ^hi / CD49f细胞乳腺上皮细胞种子，然后用PBS或2μg/ mL NAMEC衍生的EVs /外来体在步骤1.7中获得。
2. 为了确保EVs /外来体在长期培养处理中的生物学功效，每隔两天用含有PBS或2μg/ mL NAMEC衍生的EVs /外来体的新鲜培养基代替细胞培养基。不要分开鼠标prima在10天的治疗期间的腔细胞。

8.脂肪垫注射乳腺上皮细胞

1. 麻醉3周龄雌性C57BL / 6小鼠与异氟烷2-3％吸入。
2. 把麻醉的老鼠放在背上。用剃刀/发乳去除中腹部的毛皮，并用70％酒精和聚维酮碘的三个交替周期清洁手术部位。
3. 用剪刀沿腹侧胸腹部区域穿过皮肤进行1.5厘米的垂直切口，然后交替暴露右侧和左侧^第 4 ^个乳房脂肪垫。
4. 用剪刀去除腺体实质，清除每个脂肪垫。找到脂肪垫中的淋巴结，然后取出淋巴结下方的整个腺体实质。
   注意:三分之二的脂肪垫应该保持在原位。
5. 用天然酶混合物（参见材料表 ）与蛋白水解a分离从步骤7.2获得的细胞nd胶原酶活性10分钟。用PBS中的5％FBS中和酶活性。
6. 在室温下将悬浮液以450×g离心10分钟，弃去上清液。用血细胞计数器计数细胞，并将细胞悬浮在PBS中，浓度使得15μL含有所需的细胞剂量（10 ⁴ -10 ²细胞/垫）。
7. 使用连接到27G针的100μL玻璃注射器将15μL乳腺上皮细胞悬液注入脂肪垫。
8. 对另一侧的脂肪垫重复步骤8.4-8.7。
9. 用伤口夹闭合皮肤。

乳腺全身

1. 细胞注射后8周用CO ₂加颈椎脱位来安乐死小鼠（步骤8.7）。
2. 使用剪刀从胸部区域到腹股沟区域的皮肤层进行垂直切口，然后暴露右侧和左侧4 ^号乳房脂肪垫去除第4 ^个乳腺（ 图2 ）。
3. 在玻璃显微镜载玻片上涂抹脂肪垫，并在室温下用Kahle固定剂（4％甲醛，30％EtOH和2％冰乙酸）固定脂肪垫。
   注意:Kahle的固定剂是刺激性的。在化学品罩中执行此步骤。
4. 在250mL 70％EtOH中洗涤脂肪垫15分钟，然后在250mL的dH ₂ O中洗涤5分钟。在室温下用胭脂红明矾（1g胭脂红和2.5g硫酸铝钾）在500mL dH ₂ O中染上脂肪垫。
5. 用250mL 70％EtOH洗涤脂肪垫15分钟，250mL 95％EtOH洗涤15分钟，加入250mL 100％EtOH 15分钟。
6. 清洁二甲苯中的脂肪垫数天，并在脂肪垫变透明时停止二甲苯培养。
   注意:二甲苯是一种刺激性。在化学品罩中执行此步骤。
7. 装载幻灯片wi使用数字幻灯片扫描仪拍摄图像（2,400 dpi）的脂肪垫。

结果

由于已经显示阻断PGE ₂ / EP ₄信号传导从乳腺基底样干细胞⁴引发EV /外来体释放，这项工作提出了从乳腺上皮基底细胞（NAMEC）培养物中分离诱导的EVs /外来体的方法。由于NAMECs在无血清培养基中培养，所以不存在来自血清^13的预先存在的EV /外来体。对于在含有血清的培养基中培养的细胞，培养基中预先存在的外来体必须通...

讨论

外来体通常携带释放它们的细胞的特征，并且释放的外来体的量可以由刺激诱导⁴ 。可以收集细胞的培养基并进行差异超速离心用于EV /外来物质收集（ 图1 ）。目前对于分离EV /外来体的理想方法目前尚无普遍的共识。这里使用的最佳方法已经由下游应用^14确定 。超速离心是分离EV /外来体的相对快速的方法，可以保护EV /外来体的生物活性?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCDB 170	USBiological	M2162
DMEM/F12	Thermo	1250062
Optima L-100K ultracentrifuge	Beckman	393253
SW28 Ti Rotor	Beckman	342204
SW41 Rotor	Beckman	331306
NANOSIGHT LM10	Malvern	NANOSIGHT LM10	for nanoparticle tracking analysis (NTA)
Optiprep	Sigma-Aldrich	D1556	60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile).
CD81 antibody	GeneTex	GTX101766	1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
CD9 antibody	GeneTex	GTX100912	1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
CD63 antibody	Abcam	Ab59479	1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
TSG101 antibody	GeneTex	GTX118736	1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
GAPDH	GeneTex	GTX100118	1:6000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester)	Thermo	V12883
FACSCalibur	BD Biosciences		fluorescence cell analyzer
collagenase Type IV	Thermo	17104019
trypsin	Thermo	27250018
ITS	Sigma-Aldrich	I3146	a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite
accutase	ebioscience	00-4555-56	a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity
dispase	STEMCELL	7913	5 mg/ml = 5 U/ml
anti-CD49f antibody	Biolegend	313611	1:50
anti-EpCAM antibody	Biolegend	118213	1:200
FACSAria	BD Biosciences		cell sorter
carmine alum	Sigma-Aldrich	C1022
human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs)			gifts from Dr. Robert Weinberg
permount	Thermo Fisher Scientific	SP15-500
sodium bicarbonate	Zymeset	BSB101
EGF	Peprotech	AF-100-015
Hydrocoritisone	Sigma-Aldrich	SI-H0888
Insulin	Sigma-Aldrich	SI-I9278
BPE (bovine pituitary extract)	Hammod Cell Tech	1078-NZ
GW627368X	Cayman	10009162
15-cm culture dish	Falcon	353025
table-top centrifuge	Eppendrof	Centrifuge 3415R
ultracentrifuge tube	Beckman	344058
PBS (Phosphate-buffered saline)	Corning	46-013-CM
BCA Protein Assay	Thermo Fisher Scientific	23228
Transmission Electron Microscopy	Hitachi	HT7700
gelatin	STEMCELL	7903
10-cm culture dish	Falcon	353003
6-well culture dish	Corning	3516
female C57BL/6 mice	NLAC (National Laboratory Animal Center
FBS (Fetal Bovine Serum)	BioWest	S01520
gentamycin	Thermo Fisher Scientific	15710072
Pen/Strep	Corning	30-002-Cl
DNase I	5PRIMER	2500120
isofluorane	Halocarbon	NPC12164-002-25
formaldehyde	MACRON	H121-08
EtOH (Ethanol)	J.T. Baker	800605
glacial acetic acid	Panreac	131008.1611
aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	12625
Xylene	Leica	3803665
0.22 μm membranes	Merck Millipore	Millex-GP
AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm	BD Biosciences	427631
AUTOCLIP Wound Clip Applier	BD Biosciences	427630
CellMask™ Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C10046	plasma membrane stain