Trasferimento di abilità di formazione del ghiandale mammario tra le cellule epiteliali basali del mammifero e le cellule luminescenti mammarie attraverso le vescicole / esosomi extracellulari

Riepilogo

Questo protocollo descrive metodi per purificare, quantificare e caratterizzare vescicole extracellulari (EVs) / esosomi da cellule epiteliali mammarie non aderenti / mesenchimali e per usarle per trasferire la capacità di formazione delle ghiandole mammarie alle cellule epiteliali mammarie luminali. EVs / esosomi derivati ​​da cellule epiteliali mammarie simili a stelo possono trasferire questa proprietà cellulare alle cellule che ingeriscono gli EV / esosomi.

Abstract

Le cellule possono comunicare attraverso esosomi, vescicole extracellulari di ~ 100 nm (EVs) che contengono proteine, lipidi e acidi nucleici. Le vescicole extracellulari ottenute dalle cellule epiteliali mammarie non mescolate (NAMEC) possono essere isolate dal mezzo NAMEC tramite ultracentrifugazione differenziale. Sulla base della loro densità, gli EV possono essere purificati mediante ultracentrifugazione a 110.000 x g. La preparazione EV da ultracentrifugazione può essere ulteriormente separata usando un gradiente continuo di densità per impedire la contaminazione con proteine ​​solubili. Gli EVs purificati possono quindi essere ulteriormente valutati usando un'analisi di tracking nanoparticolare, che misura la dimensione e il numero di vescicole nel preparato. Le vescicole extracellulari con una dimensione variabile da 50 a 150 nm sono esosomi. Gli EVs / esosomi derivati ​​dal NAMEC possono essere ingeriti da cellule epiteliali mammarie, che possono essere misurate mediante citometria a flusso e microscopia confocale. Alcune proprietà delle cellule staminali del mammario ( ad esempio, la capacità di formare la ghiandola mammaria) possonoEssere trasferito da NAMEC-simili a gambo alle cellule epiteliali mammarie attraverso i EV / esosomi derivati ​​da NAMEC. Le cellule epiteliali mammarie luminose luminescenti epCAM ^hi / CD49f non possono formare ghiandole mammarie dopo essere state trapiantate nei rilievi di grasso del mouse, mentre le cellule epiteliali mammarie EpCAM ^lo / CD49f ^hi basali formano ghiandole mammarie dopo il trapianto. L'assorbimento di EV / esosomi derivati ​​da NAMEC da EpCAM ^hi / CD49f ^lo luminal cellule epiteliali mammarie permette loro di generare ghiandole mammarie dopo essere stati trapiantati in pastiglie grasse. Gli EVs / esosomi derivati ​​da cellule epiteliali mammarie simili al gambo trasferiscono la capacità di formare la ghiandola mammaria alle cellule epiteliali mammarie luminose EpCAM ^hi / CD49f.

Introduzione

Gli esosomi possono mediare la comunicazione cellulare trasferendo membrane e proteine ​​citosoliche, lipidi e RNA tra le cellule ¹ . La comunicazione esosomiale è stata dimostrata coinvolta in molti processi fisiologici e patologici ( es. Presentazione di antigene, sviluppo della tolleranza ² e progressione tumorale ³ ). Gli esosomi spesso hanno contenuti simili a quelli delle cellule di origine che li rilasciano. Così, gli esosomi possono trasportare proprietà cellulari specifiche dalle cellule sorgenti e trasferire queste proprietà alle cellule che ingeriscono ⁴ .

Gli esosomi sono vescicole a doppio strato da 50 a 150 nm e presentano marcatori specifici ( es. CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix e TSG101). Così, gli esosomi devono essere caratterizzati da vari metodi per diversi aspetti. La microscopia elettronica di trasmissione può essere usata per visualizzare le vescicole a membranaQuali esosomi ^{4 , 5} . L'analisi di nanoparticle tracking (NTA) e l'analisi della diffusione della luce dinamica (DLS) vengono utilizzati per misurare la dimensione e il numero di esosomi purificati ⁴ . Il contenuto di membrana lipidica degli esosomi può essere verificato mediante gradiente di densità. Marcatori esosomali, come CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix e TSG101 6,7, possono essere misurati mediante blottatura Western.

Le cellule basali del mammario hanno la capacità di generare ghiandole mammarie quando vengono impiantati in pastiglie grasse, mentre le cellule luminali non possono essere ^{8 , 9 , 10} . Così, le cellule basali del mammario sono anche definite come unità ripopolanti mammarie. Utilizzando il modello delle cellule mammarie basali e luminali, è possibile esaminare la capacità di EVs / esosomi di trasferire le caratteristiche delle cellule tra diverse popolazioni cellulari. Questo lavoroDimostra il metodo di trasferire la capacità di formazione delle ghiandole dalle cellule epiteliali basali del mammario alle cellule epiteliali luminescenti mammarie usando EVs / esosomi derivanti da cellule epiteliali basali mammarie. Le cellule epiteliali mammarie luminescenti hanno acquisito proprietà cellulari basali dopo l'ingestione di EV / esosomi secretati dalle cellule basali e quindi possono formare ghiandole mammarie ⁴ .

Protocollo

Tutte le ricerche relative agli animali sono conformi ai protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura degli animali.

1. Isolamento e validazione di vescica extracellulare / esosomi

1. Le cellule basali dell'epitelio mammario della cultura, NAMECs ⁴ , con mezzo fresco e privo di siero costituito da 500 mL di MCDB 170, pH 7.4 + 500 mL di DMEM / F12 con bicarbonato di sodio (0,2438%); EGF (5 ng / mL); Idrocortisone (0,5 μg / mL); Insulina (5 μg / mL); Estratto di ipofisaro bovino (BPE; 35 μg / mL); E GW627368X (1 μg / mL) nei piatti da 15 cm.
2. Dopo il conteggio delle cellule con un emocitometro, le sementi 1,2 x 106 cellule in 12 ml di media per piatto da 15 cm nel giorno 0 per 4 giorni ⁴ .
3. Dopo 4 giorni di coltura, centrifugare il mezzo di coltura a 300 xg per 5 minuti utilizzando una centrifuga a tavola. Trasferire il surnatante in un tubo conico ( Figura 1 ).
4. Centrifugare il surnatanteA 2.000 xg per 20 minuti in una centrifuga a tavola. Trasferire il surnatante in un tubo di ultracentrifuga e lasciare le cellule morte e detriti cellulari ( Figura 1 ).
5. Centrifugare il supernatante a 10.000 xg per 30 minuti a 4 ° C. Trasferire il supernatante ad un nuovo tubo ultracentrifugo ( Figura 1 ).
6. Centrifugare il surnatante a 110.000 xg per 60 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet EV / esosoma in PBS ( Figura 1 ).
7. Centrifugare il surnatante a 110.000 xg per 60 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante. Resuspendere il pellet EV / exosome in PBS ( Figura 1 ). Resuspendere il pellet isolato da 240-480 ml di mezzo NAMEC-condizionato in 100 μL.
8. Misurare la concentrazione proteica della sospensione EV con il saggio della proteina BCA. Assicurarsi che la concentrazione sia di circa 20-40 μg / 100 μL. Conservare a -20 ° C perUlteriori analisi.
9. Misurare la concentrazione e la dimensione degli EVs / esosomi mediante l'analisi del tracking nanoparticolare (NTA), come descritto precedentemente da Gardiner et al. ¹¹ . Diluire i EV / esosomi (20 μg / 100 μL) con PBS a 10.000 volte per l'analisi NTA.
   NOTA: Il risultato dell'analisi NTA riflette il numero e la dimensione delle vescicole analizzate.
10. Immagini EVs / esosomi con microscopia trasmissione elettronica (TEM), come descritto precedentemente da Lin et al ⁴ .

2. Purificazione Exosome utilizzando una gradiente di densità

1. Resuspendere il pellet da 110.000 g dal punto 1.7 in 40% (w / v) iodossanolo in PBS (2 mL). Sovrapporre la miscela in sequenza con aliquote di 30%, 20%, 10% e 5% (w / v) iodossanolo in PBS (2 mL ciascuno) per formare un gradiente di densità in un tubo di ultracentrifuga.
2. Centrifugare la miscela a 200.000 xg per 8 h a 4 ° C.
3. Raccogliere ogni frazione di gradiente (10 fractions; 1 mL / frazione) con una pipetta dalla parte superiore del tubo.
4. Analizzare la presenza di marcatori esosomi ( ad es. CD81, CD9, CD63 e Tsg101) in ciascuna frazione mediante SDS-PAGE ¹² e Western blot. Caricare 50 μl di sospensioni di ciascuna frazione su un gel di 10% contenente SDS 0,1% (w / v) e separare le proteine ​​in frazioni con elettroforesi a gel.
5. Trasferire le proteine ​​da un gel in una membrana PVDF e incubare la membrana con anticorpi contro i marcatori esosomi ( p. Es., CD81, CD9, CD63 e Tsg101) e la proteina GAPDH per la pulizia durante la notte ( Tabella dei materiali ) a 4 ° C.
   NOTA: Il risultato identifica la frazione contenente esosomi.

3. Vescicole extracellulari / etichettatura esotica

1. Sospendere gli EV / esosomi, ottenuti nel punto 1.7, in 10 μM di carbossfluoresceina succinimidil diacetato estere (CFSE) a 20 μg di proteina esosomale / 100 μL. Preparare un co-campione paralleloContenente solo CFSE e PBS, trattati allo stesso modo, come un controllo negativo per i successivi esami EV / esosomi. Lasciare le miscele a 37 ° C per 30 min.
2. Sospendere EVs / esosomi in volume 50x di PBS e centrifugare la sospensione a 110.000 xg per 60 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellame EV / esosoma in PBS. Ripetere la fase 3.2 una volta.
3. Sospendere EVs / esosomi in PBS ad una concentrazione di 20 μg di proteina esosomale / 100 μL e quindi filtrare gli EVs / esosomi attraverso membrane di 0,22 μm prima di aggiungere EVs / esosomi alle cellule.

4. Esame extracellulare della vescica / Exosome Uptake

1. Per ottenere una coltura media, mescolare 500 mL di MCDB 170, pH 7.4 + 500 mL di DMEM / F12 con bicarbonato di sodio (0,2438%); EGF (5 ng / mL); Idrocortisone (0,5 μg / mL); Insulina (5 μg / mL); E BPE (35 μg / mL) ⁴ . Piattare le cellule HMLE epiteliali mammarie umane in piatti a 6 pozzetti (1 x 10 ^{6 <}/ Sup> cellule / pozzo) un giorno prima del trattamento EV / exosome. Aggiungere 2 μg / mL CFSE EVS / exosome etichettato con fluorescenza, ottenuto nel passo 3.3, al terreno di coltura delle cellule HMLE per 2-6 h. Trattare le cellule HMLE del gruppo di controllo negativo con la preparazione parallela, descritta nel punto 3.1.
2. Dopo l'incubazione da 2 a 6 h, lavare le cellule due volte con 4 mL di PBS a temperatura ambiente.
3. Staccare le cellule con 0,25% di trysina per 10 min e ri-sospendere le cellule in PBS contenente 0,2% di FBS. Misurare l'assorbimento di EV / esosomi dall'intensità di fluorescenza nelle cellule utilizzando un analizzatore di celle di fluorescenza ⁴ . Immagini le cellule trattate con EVs / esosomi o il controllo negativo usando la microscopia confocale.
   NOTA: La fluorescenza verde nelle cellule è causata dall'assorbimento EV / esosomi. Vedere la leggenda della Figura 6 per le impostazioni del microscopio.

5. Isolamento delle cellule epiteliali del mammario primario

1. Preparare piatti rivestiti in gelatina aggiungendo 12 ml di soluzione gelatina 0,1% a piatti da 10 cm. Posizionare le piastre in un incubatore a 37 ° C per 30 min. Rimuovere la soluzione di gelatina e lasciare i coperchi dai piatti in un cappuccio di flusso laminare per 4 h finché il rivestimento di gelatina si è asciugato.
2. Sfogliare le ghiandole mammarie numero 2, 3, 4 e 5 ( Figura 2 ) dai maschi C57BL / 6 vergini di 12 settimane usando le forbici e tagliare le ghiandole in piccoli pezzi (2 mm ² ) usando un rasoio.
3. Far dissociare ulteriormente la slurry delle ghiandole mammarie (da 10 topi) per 60 minuti a 37 ° C, agitazione a 120 giri / min con 50 ml di DMEM / F12 contenente 0,2% di collageno tipo IV, 0,2% di tripsina, 5% FBS, 5 μg / ml di gentamicina , E 1x pen-strep.
4. Pellet giù gli organoidi epiteliali dalla miscela per centrifugazione a 350 xg per 10 minuti.
5. Sospendere gli organoidi epiteliali in 4 mL di DMEM / F12 con 0,1 mg / mL DNasi I per 5 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 6 ml di DMEM / F12 in una finaleVolume di 10 mL.
6. Centrifugare la sospensione a 400 xg per 10 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante.
7. Resuspendere il pellet in 10 ml di DMEM / F12. Centrifugare la sospensione ma colpire il freno quando la velocità raggiunge 400 x g. Scartare il surnatante.
   NOTA: Colpendo il freno, gli organoidi epiteliali vengono rapidamente abbassati, mentre i fibroblasti, come singole cellule, rimangono ancora nel surnatante.
8. Ripetere la fase 5.6 e 5.7 5-7 volte. Aggiungere una goccia della sospensione ad un emocitometro e controllare la clearance dei fibroblasti dalla miscela organoide sotto microscopia dopo ogni ciclo di centrifugazione ( Figura 3 ).
9. Piastra gli organoidi nel piatto rivestito di gelatina, ottenuto nel passaggio 5.1, per 48 ore con DMEM / F12 contenente 1x ITS, 5% FBS, 50 μg / mL gentamicina, 10 ng / mL EGF e 1x pen-strep.
10. Dopo 48 h, rimuovere le cellule galleggianti nella coltura sostituendo il mezzo con terreno di coltura fresco senza FBS (DMEM / F12 contenente 1x ITS, 50 μg / mL gentamicina, 10 ng / mL EGF e 1x pen-strep).
11. Confermare che un monostrato di cellule epiteliali mammarie migra e cresce dagli organoidi epiteliali collegati in 3 giorni.

6. Separazione delle cellule epiteliali mammarie basali / luminescenti primarie

1. Dopo la cultura di 3 giorni, staccare le cellule mammarie primarie del mouse con una miscela enzimatica naturale con attività enzimatica proteolitica e collagenolitica per 20 min. Neutralizzare l'attività enzimatica con il 5% di FBS in PBS.
2. Centrifugare la sospensione a 450 xg per 10 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Resuspendere il pellet cellulare in 5 mg / mL dispasi per 20 min. Neutralizzare l'attività enzimatica con il 5% di FBS in PBS.
3. Centrifugare la sospensione a 450 xg per 10 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante.
4. Riassemblare le cellule in 100 μl di PBS con 0,2% di FBS ad una concentrazione di 10 ⁷ cellule / ml con il diluitoAnticorpi anti-CD49f e anti-EpCAM sul ghiaccio per 1 ora nel buio.
5. Lavare le cellule con PBS e incubare le cellule con anticorpo secondario coniugato fluoroforo sul ghiaccio per 30 minuti al buio.
6. Lavare e ri-sospendere le cellule in PBS con 0,2% di FBS.
7. Ordinate le cellule epiteliali mammarie EpCAM ^hi / CD49f luminal su un cellulare ⁴ .

7. Vescicola extracellulare / trattamento esotico

1. Sezionare le cellule epiteliali mammarie luminose EpCAM ^hi / CD49f dal punto 6.7 sui piatti a 6 pozzetti rivestiti in gelatina (2 x 10 ⁵ cellule / pozzetto) e quindi trattarli con PBS o con EVS / esosomi derivanti da NAMEC da 2 μg / mL Ottenuto nel punto 1.7.
2. Per assicurare l'efficacia biologica dei EV / esosomi nel trattamento di coltura a lungo termine, sostituire ogni due giorni il mezzo di coltura cellulare con un mezzo fresco contenente PBS o 2 μg / mL di EV / esosomi derivati ​​dal NAMEC. Non dividere prima il mouseDurante le 10 giorni di trattamento.

8. Iniezione del grasso di cellule epiteliali del mammario

1. Anestetizzare un 3 settimane di sesso femminile C57BL / 6 con isofluorano 2-3% inalante.
2. Posizionare il mouse anestetizzato sulla schiena. Togliere la pelliccia sul mid-abdomen con una crema di rasoio / capelli e pulire il sito di chirurgia con tre cicli alternati di alcol al 70% e povidone-iodio.
3. Effettuare un'incisione verticale da 1,5 cm attraverso la pelle lungo la regione ventricolare toracica-inguinale con le forbici e poi alternare in modo alternato i tamponi di grasso a destra e sinistra del 4 ^° mammario.
4. Cancella ogni pastiglia grassa rimuovendo la parenchima delle ghiandole con forbici. Individuare il linfonodo nel tampone di grasso e poi rimuovere l'intera parenchima della ghiandola sotto il linfonodo.
   NOTA: Due terzi del blocco grasso devono rimanere in posizione.
5. Staccare le cellule ottenute dalla fase 7.2 con una miscela enzimatica naturale (vedi tabella dei materiali ) con proteolytic aNd attività enzimatica collagenolytica per 10 min. Neutralizzare l'attività enzimatica con il 5% di FBS in PBS.
6. Centrifugare la sospensione a 450 xg per 10 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Conte le cellule con un emocitometro e sospendere le cellule in PBS ad una concentrazione tale che 15 μL contiene la dose cellulare desiderata (10 ⁴ -10 ² cellule / pad).
7. Iniettare 15 μL di sospensione delle cellule epiteliali mammarie in un tampone di grasso usando una siringa di vetro da 100 μl attaccata ad un ago 27G.
8. Ripetere i passaggi 8.4-8.7 per il tampone di grasso dall'altro lato.
9. Chiudere la pelle con le clip della ferita.

9. Ghiandola mammaria

1. Eutanizzare il topo con CO _{2 e} dislocazione cervicale a 8 settimane dopo l'iniezione cellulare (punto 8.7).
2. Effettuare un'incisione verticale attraverso lo strato della pelle dalla regione toracica alla regione inguinale usando le forbici e quindi esporre sia la destra che la sinistra 4 mCuscinetti ammalici di grasso. Rimuovere le 4 gamme mammarie ( Figura 2 ).
3. Diffondere le pastiglie di grasso sulle vetrini del microscopio di vetro e fissare le pastiglie di grasso con il fissativo di Kahle (4% di formaldeide, 30% di EtOH e 2% di acido acetico glaciale) a temperatura ambiente durante la notte.
   Attenzione: il fissativo di Kahle è irritante. Eseguire questo passaggio in un cappuccio chimico.
4. Lavare i pastiglie grassi in 250 mL di EtOH 70% per 15 minuti e poi in 250 mL di dH ₂ O per 5 min. Stain le pastiglie grassi con allume di carminio (1 g di carmina e 2,5 g di solfato di potassio di alluminio in 500 mL di dH ₂ O) a temperatura ambiente durante la notte.
5. Lavare i cuscinetti grassi con 250 mL di EtOH 70% per 15 minuti, 250 mL di EtOH 95% per 15 minuti e 250 mL di 100% EtOH per 15 minuti.
6. Pulire i pastiglie grassi in xilene per giorni e fermare l'incubazione di xilene quando i pastiglie grassi diventano trasparenti.
   Attenzione: Xilene è un irritante. Eseguire questo passaggio in un cappuccio chimico.
7. Montare le diapositive wiIl mezzo di montaggio e fotografare (2.400 dpi) dei pasticci per grassi utilizzando un diapositario digitale.

Risultati

Dal momento che è stato dimostrato che bloccando la segnalazione di PGE ₂ / EP ₄ provoca il rilascio di EV / esosomi da cellule staminali simili al basale mammario ⁴ , questo lavoro presenta un metodo di isolamento degli EV / esosomi indotti dalla coltura cellulare basale epiteliale mammaria (NAMEC). Dal momento che NAMECs sono coltivati ​​in un mezzo senza siero, non esistono EVs / esosomi preesistenti derivati ​​dal siero

Discussione

Gli esosomi spesso trasportano caratteristiche delle cellule che li hanno liberati e la quantità di esosomi rilasciati può essere indotta da stimoli ⁴ . Il mezzo di coltura delle cellule può essere raccolto e sottoposto ad ultracentrifugazione differenziale per la raccolta di EV / esosomi ( Figura 1 ). Attualmente non esiste un accordo generale su un metodo ideale per isolare EV / esosomi. Il metodo ottimale utilizzato qui è stato determinato dall'applicazion...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCDB 170	USBiological	M2162
DMEM/F12	Thermo	1250062
Optima L-100K ultracentrifuge	Beckman	393253
SW28 Ti Rotor	Beckman	342204
SW41 Rotor	Beckman	331306
NANOSIGHT LM10	Malvern	NANOSIGHT LM10	for nanoparticle tracking analysis (NTA)
Optiprep	Sigma-Aldrich	D1556	60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile).
CD81 antibody	GeneTex	GTX101766	1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
CD9 antibody	GeneTex	GTX100912	1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
CD63 antibody	Abcam	Ab59479	1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
TSG101 antibody	GeneTex	GTX118736	1:1000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
GAPDH	GeneTex	GTX100118	1:6000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1X TBS, 0.1% Tween 20 at 4°C, overnight
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl diacetate ester)	Thermo	V12883
FACSCalibur	BD Biosciences		fluorescence cell analyzer
collagenase Type IV	Thermo	17104019
trypsin	Thermo	27250018
ITS	Sigma-Aldrich	I3146	a mixture of recombinant human insulin, human transferrin, and sodium selenite
accutase	ebioscience	00-4555-56	a natural enzyme mixture with proteolytic and collagenolytic enzyme activity
dispase	STEMCELL	7913	5 mg/ml = 5 U/ml
anti-CD49f antibody	Biolegend	313611	1:50
anti-EpCAM antibody	Biolegend	118213	1:200
FACSAria	BD Biosciences		cell sorter
carmine alum	Sigma-Aldrich	C1022
human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs)			gifts from Dr. Robert Weinberg
permount	Thermo Fisher Scientific	SP15-500
sodium bicarbonate	Zymeset	BSB101
EGF	Peprotech	AF-100-015
Hydrocoritisone	Sigma-Aldrich	SI-H0888
Insulin	Sigma-Aldrich	SI-I9278
BPE (bovine pituitary extract)	Hammod Cell Tech	1078-NZ
GW627368X	Cayman	10009162
15-cm culture dish	Falcon	353025
table-top centrifuge	Eppendrof	Centrifuge 3415R
ultracentrifuge tube	Beckman	344058
PBS (Phosphate-buffered saline)	Corning	46-013-CM
BCA Protein Assay	Thermo Fisher Scientific	23228
Transmission Electron Microscopy	Hitachi	HT7700
gelatin	STEMCELL	7903
10-cm culture dish	Falcon	353003
6-well culture dish	Corning	3516
female C57BL/6 mice	NLAC (National Laboratory Animal Center
FBS (Fetal Bovine Serum)	BioWest	S01520
gentamycin	Thermo Fisher Scientific	15710072
Pen/Strep	Corning	30-002-Cl
DNase I	5PRIMER	2500120
isofluorane	Halocarbon	NPC12164-002-25
formaldehyde	MACRON	H121-08
EtOH (Ethanol)	J.T. Baker	800605
glacial acetic acid	Panreac	131008.1611
aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	12625
Xylene	Leica	3803665
0.22 μm membranes	Merck Millipore	Millex-GP
AUTOCLIP Wound Clips, 9 mm	BD Biosciences	427631
AUTOCLIP Wound Clip Applier	BD Biosciences	427630
CellMask™ Deep Red	Thermo Fisher Scientific	C10046	plasma membrane stain