الجاذبة الإرواء كطريقة لتصور الأوعية الدموية في<em&gt; أمبيستوما ميكسيكانوم</em

Anna J. Saltman; May Barakat; Donald M. Bryant; Anastasia Brodovskaya; Jessica L. Whited

doi:10.3791/55740

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Method Article

الجاذبة الإرواء كطريقة لتصور الأوعية الدموية في

DOI:

10.3791/55740

⸱

June 16th, 2017

Anna J. Saltman*¹^,², May Barakat*¹, Donald M. Bryant¹, Anastasia Brodovskaya¹, Jessica L. Whited¹

¹Department of Orthopedic Surgery, Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital, ²Division of Graduate Medical Sciences, Boston University

* These authors contributed equally

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Summary

باستخدام محبة للدهون 1،1'- ديوكتاديسي -3،3،3 '، 3'-تيتراميثيليندوكاربوسيانين البركلورات (الجاذبة) تقنية تلطيخ، أمبيستوما ميكسيكانوم يمكن أن يخضع نضح الأوعية الدموية للسماح لتصور سهلة من الأوعية الدموية.

Abstract

وقد استخدمت تقنيات الإرواء لعدة قرون لتصور تداول الأنسجة. أكسولوتل (أمبيستوما ميكسيكانوم) هو نوع من السمندل الذي برز كنموذج أساسي لدراسات التجدد. لا يعرف إلا القليل عن كيفية إعادة التوعي يحدث في سياق التجدد في هذه الحيوانات. هنا نحن الإبلاغ عن طريقة بسيطة لتصور الأوعية الدموية في أكسولوتل عن طريق نضح من 1،1'-ديوكتاديسي 3،3،3 '، 3'-تيتراميثيليندوكاربوسيانين البيركلورات (الجاذبة). الجاذبة هو صبغ كاربوسيانين محبة للدهون التي تدرج في غشاء البلازما من الخلايا البطانية على الفور. يتم الإرواء باستخدام مضخة تحوي بحيث يدخل الجاذبة الدورة الدموية من خلال الشريان الأبهر. خلال نضح، وتدفق صبغ من خلال الأوعية الدموية أكسولوتل ودمجها في طبقة ثنائية الدهون من الخلايا البطانية الوعائية عند الاتصال. الإجراء نضح يستغرق حوالي ساعة واحدة لمدة 8 بوصة أكسولوتل. مباشرة بعد نضح وايث داي، و أكسولوتل يمكن تصور مع المجهر متحد البؤر الفلورسنت. ينبعث مؤشر الجاذب الضوئي الضوء في نطاق أحمر برتقالي عندما متحمس مع مرشح الفلورسنت الأخضر. هذا الإجراء نضح الجاذبة يمكن استخدامها لتصور بنية الأوعية الدموية من أكسولوتلس أو لإظهار أنماط إعادة التوعي في تجديد الأنسجة.

Introduction

تصور الأوعية الدموية يلعب دورا حيويا في فهم بنية ووظيفة الكائنات الحية عبر العديد من الأنواع. ابتداء من القرن ^ال 16 مع ليوناردو دا فينشي، وقد تم دراسة النماذج والرسوم البيانية من الدورة الدموية ¹ . باستخدام الشمع والقوالب المطاطية، تم بيرفوسد الأنسجة لخلق نماذج ثلاثية الأبعاد من الأوعية الدموية، مما سمح لدراسة أورغانوجينيسيس والمرضية ¹ ^، ² . تم تلوين الراتنجات والشمع مع الأصباغ مثل الهند الحبر أو القرمزي الأحمر للسماح لتصورها سهلة ¹ ^، ² . ومع ذلك، تسببت هذه التقنيات العديد من القضايا لأن اللزوجة العالية منعت نضح كامل من الأنسجة من الفائدة ¹ . كما أصبح الحقل أكثر تطورا، واستخدام المجاهر متحد البؤر والإلكترون دخلت حيز اللعب، ونقل تيشنيق نضح إيس بعيدا عن قوالب الزهر نحو بيرفوسيونس السائل من الأوعية الدموية، وبعضها سمح للنضح والتصوير من الأوعية الدموية دون تدمير الأنسجة الأولية ³ . دي، صبغ كاربوسيانين الفلورسنت، هو واحد من مثل وصمة عار الذي يسمح لنضح الحيوانات دون الأضرار التي لحقت أنسجة الأوعية الدموية.

الأصباغ كاربوسيانين هي الأصباغ محبة للدهون التي تدمج في أغشية الخلايا عند الاتصال. هذه الأصباغ تسمح لتلطيخ سهلة وحظية من الخلايا البطانية الوعائية، والتي يمكن بعد ذلك أن ينظر إليها تحت المجهر متحد البؤر الفلورسنت. تتحرك الجاذبة عن طريق الانتشار الجانبي في غشاء الدهون من الخلايا، كما هو مبين في وضع العلامات وتعقب الخلايا العصبية ⁴ . كيميائيا، وسلاسل ألكيل اثنين من الجاذبة تعطي الصبغة تقارب عالية لأغشية الخلايا، في حين أن اثنين من حلقات مترافق من فلوريوكروم الذي هو المسؤول عن انبعاث الطول الموجي الأحمر عندما متحمس من الفلورسنت الضوء الأخضر مرشحات> 4. وقد استخدمت الجاذبة في العديد من القدرات، بما في ذلك وضع العلامات الناجحة للغشاء البلازما وعلى حد سواء أنتيروغريد والوراء إلى الوراء في الخلايا العصبية ⁵ ^، ⁶ . وقد استخدمت سابقا الجاذبة في بروتوكولات نضح في حين تصور الأوعية الدموية من الفئران ⁷ .

أكسولوتلس ( أمبيستوما ميكسيكانوم ) هي السلمندرات التي تعيش حصرا في البحيرات المالحة بالقرب من مكسيكو سيتي، المكسيك. وقد أصبحت هذه الحيوانات نموذجا هاما لفهم عمليات التجدد لأنها يمكن أن تجدد أطرافه الكاملة والذيل (بما في ذلك الحبل العصبي)، وأجزاء من القلب والأعضاء الداخلية الأخرى، وأجزاء من العين والبالغين ⁸ ^، ⁹ . بالإضافة إلى ذلك، مع التطبيق الأخير من الأدوات الجينية في أكسولوتلس، نظرة غير مسبوقة في الجزيئات والخلايا التي تقود هذه العمليات من الممكن الآن ⁸ . نجاح ريجينالتموينية من طرف كامل يتطلب عملية إعادة التوعي واسعة النطاق، والتي قد تلعب دورا هاما في تجديد بعد مجرد الوظائف التقليدية للأوعية الدموية في توفير الأكسجين والمواد المغذية. فهم إعادة التوعي في سياق تجديد الأنسجة أمر حتمي. وقد سبق تصور الأوعية الدموية أكسولوتل باستخدام الهند الحبر، وبينما كانت النتائج مثيرة للاهتمام، لم يتم إعادة النظر في هذه العملية في العقود اللاحقة ¹⁰ . سعينا إلى تكييف بروتوكول نضح الجاذبة وضعت لاستخدامها في الثدييات للسماح لنضح كاملة والتصور من الأوعية الدموية أكسولوتل ⁷ . يصف هذا البروتوكول الخطوات التي اتخذت لإرواء بنجاح وبعد ذلك تصور الدورة الدموية أكسولوتل مع تقنية تلطيخ الجاذبة. هذا الإجراء سوف يسمح لتصور دقيق من الأوعية الدموية براءات الاختراع في الأنسجة التماثل، وكذلك في تجديد الأنسجة، ويوفر طريقة جديدة ل فيسواليزاتيون وتحليل عملية إعادة التوعي في أكسولوتل.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب أكسيولوتل وفقا ل بريغهام ومستشفى المرأة (بو) المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة.

1. إعداد تجربة الإرواء

وضع أكسولوتل الكبار في حاوية بلاستيكية مليئة 0.1٪ تريكين حل (MS222) لمدة 15-20 دقيقة أو حتى تخدير تماما. تأكد من أن الحاوية مليئة ما يكفي من محلول تريكين بحيث يتم المغمورة تماما أكسولوتل.
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان المؤسسية. في بو، يعتبر أكسولوتل تخدير كامل عندما يفشل اختبار قرصة القدم، وهذا يعني أنه لا يوجد حركة الانعكاسية عندما يتم تقلص القدم بلطف.
الحذر: على الرغم من تريكين هو مخدر تستخدم خصيصا للكائنات المائية، وينبغي تجنب ملامسة الجلد مباشرة مع الحل تريكين.
إعداد محطة نضح أكسولوتل.
1. ضع الوسادة ماصة على شقة، سطح مستو مع الجانب ماص مواجهة.
2. قطع حفرة في إطار رغوة البوليسترين الذي هو الحجم المناسب والشكل ل أكسولوتل تخدير لوضعها في موقف ضعيف. وضع الإطار على وسادة ماصة.
  ملاحظة: يمكن وضع بعض المناشف الورقية الإضافية مباشرة تحت الإطار لمزيد من الامتصاصية.
3. تحميل مضخة تحوي مع أنابيب نضح. تعيين المضخة إلى معدل تدفق 0.7 مل / دقيقة، وتتدفق في اتجاه عقارب الساعة.
4. جعل الحل المخفف مع برنامج تلفزيوني 0.7x و 5٪ الجلوكوز في خليط 1: 4.
5. مزيج 10 مل من محلول مخفف مع 200 ميكرولتر من حل الأسهم ديي في أنبوب مخروطي 50 مل. كاب ومزيج من انعكاس. تغطية هذا الأنبوب مع رقائق الألومنيوم ورقة لحماية حل العمل من التعرض للضوء.
  ملاحظة: يجب تغيير الأحجام وفقا لحجم أكسولوتل نسبيا. هذه القيم هي حوالي 15 سم أكسولوتل (طول الذيل إلى الذيل). انيمالس من هذا الحجم قد لا تكون قد وصلت إلى النضج الجنسي الكامل حتى الجنس الحيوان قد لا يتم تحديدها في هذا الوقت.
6. ملء أنبوب مخروطي 50 مل مع برنامج تلفزيوني 0.7x.
  ملاحظة: سيتم استخدام برنامج تلفزيوني لتشكيل الحلقة و إكسولانغيناتيون أكسولوتل.
7. نعلق إبرة فراشة 27 قياس إلى نهاية خروج أنابيب نضح. أضعاف أجنحة فراشة على بعضها البعض ومكان في موقف المشبك.
8. وضع نهاية حرة من أنابيب نضح في أنبوب مخروطي 50 مل مليئة برنامج تلفزيوني 0.7X وتشغيل مضخة نضح حتى يتم تعبئة كامل أنابيب مع الحل. وقفة المضخة مرة واحدة يتم ملء أنابيب بأكملها مع برنامج تلفزيوني.
  ملاحظة: تأكد من أنابيب خالية من فقاعات الهواء في جميع الأوقات، وهذه سوف تسبب صمة الهواء في أكسولوتل ومنع نضح الكامل.
9. وضع منشفة ورقية في العفن على شكل أكسولوتل في إطار رغوة البوليسترين. باستخدام ماصة نقل، نقع منشفة مع الحل تريكين.
  ملاحظة: قطع مربع صغير في منتصف سحب الورقإل للسماح لتصريف السوائل أثناء إجراء التروية.
10. وضع مستحلب أكسولوتل مستلق على منشفة ورقية داخل إطار رغوة البوليسترين.

2. فتح الصدر أكسولوتل

استخدام ملقط الجراحية لقرصة الجلد على طول المحور المركزي للصدر أكسولوتل، فقط تحت خط الكتفين. اسحب.
استخدام مشرط لجعل شق صغير حيث تم سحب الجلد.
إزالة التصحيح مربع من الجلد على صدره من أجل الكشف عن اثنين من لوحات الغضروف.
1. إزالة الجلد لفتح نافذة على التجويف الصدري كبيرة بما فيه الكفاية لرؤية بوضوح القلب وحوالي 5 ملم من الشريان الأورطي المتفرعة من القلب.
تمزيق الأنسجة الضامة بعناية باستخدام ملقط أو مقص مغلقة من أجل تجنب قطع أي الأوعية الدموية الرئيسية.
رفع كل لوحة الغضروف بشكل فردي باستخدام ملقط ومكوس لهم ثإيث مقص جراحي.
قرصة بعناية التامور مع ملقط، سحب ما يصل، وثقب ذلك باستخدام مقص جراحي. وينبغي أن يكون هذا شق عميق فقط بما فيه الكفاية لثقب التامور رقيقة جدا، وينبغي أن تكون كبيرة بما يكفي للسماح لإزالة التامور. الحرص على عدم قطع القلب.
إزالة بدقة التامور لفضح القلب والشريان الأبهر.
ملاحظة: باستخدام ماصة نقل، دافق بشكل دوري تجويف الصدر والخياشيم مع حل تريكين للحفاظ على المنطقة واضحة والحفاظ على تخدير أكسولوتل.

3. إرواء أكسولوتل

وضع موقف المشبك مع إبرة فراشة تحميل بجانب إطار رغوة البوليسترين، بحيث يمكن بسهولة التلاعب في ذراع المشبك لإدراج الإبرة في الشريان الأبهر أكسولوتل. نقطة طرف الإبرة نحو الجانب منقاري من الحيوان خلال الإدراج والحفاظ على موازية الإبرة إلى الشريان الأبهر لتجنب ثقب ذلك من خلال المرجعبوسيت الجانب.
بدوره على مضخة تحوي. وينبغي أن يستمر برنامج تلفزيوني 0.7X في التدفق من خلال الأنابيب.
إدراج الإبرة في الشريان الأبهر.
1. حرك الملقط تحت القوس الأبهر وسحب ما يصل قليلا للسماح لسهولة الوصول إليها.
2. مناورة مجموعة إبرة المشبك مثل أن الإبرة يمتد على طول الشريان الأبهر، لافتا نحو الرأس. إدراج الإبرة أثناء استخدام ملقط للدعم وراء الشريان الأبهر.
  ملاحظة: يجب إدراج إبرة عميقة بما فيه الكفاية في الشريان الأورطي للتأكد من أنها لن تنزلق خلال نضح. قد يكون هذا حوالي 5 ملم ل 15 سم أكسولوتل. تأكد من أن الإبرة هو تماما في خط مع الشريان الأبهر لتجنب ثقب كامل من السفينة. من خلال-- من خلال-- ثقب من خلال يمكن أن يسبب نزيف هائل ونقصان معدلات نجاح نضح. يمكن تأكيد الإدراج الناجح عن طريق توسيع مرئية من أتريا القلب.
بسرعة تمزيق أتريوم واحد مع الخيال العلميسسورس والسماح الدم لاستنزاف.
1. دافق مع حل تريكين لمنع تراكم الدم وتشكل الجلطة في تجويف الصدر.
يروي أكسولوتل مع حوالي 20-30 مل من برنامج تلفزيوني. الحيوان يجب أن تتغير من الضوء الوردي في اللون إلى الأبيض في نضح ناجحة.
وقفة مضخة تحوي ونقل نهاية خالية من الأنابيب في أنبوب 15 مل من حل الجاذبة. إعادة تشغيل المضخة، ورعاية لتجنب خلق أي فقاعات الهواء في الأنابيب.
يروي أكسولوتل مع الأسهم العمل بأكمله من الجاذبة.
ملاحظة: في نضح ناجحة، و أكسولوتل مع تغيير اللون إلى الوردي مشرق من الجاذبة. وهذا سيكون أكثر وضوحا في الخياشيم.
وقفة مضخة بعد نضح مع الجاذبة كاملة ووضع نهاية حرة من الأنابيب إلى 4٪ بارافورمالدهيد (بفا) حل لإصلاح الأنسجة. إعادة تشغيل مضخة وإرواء لا يقل عن 10 مل من بفا.
الحذر: بفا هو سامة ويجب التعامل معها و ديسبوسيد من المناسب. يجب ارتداء القفازات ونظارات السلامة، ويجب أن تكون الحلول داخل غطاء الدخان. إرواء من أكسولوتل مع بفا لإصلاح نتائج الأنسجة في وفاة الحيوان.

4. إنهاء الإرواء والتصور التحضير

وقف مضخة تحوي وإزالة الإبرة من الشريان الأبهر أكسولوتل.
وضع أكسولوتل على لوحة من البلاستيك.
ملاحظة: استخدام نصف طبق بتري كبير يعمل بشكل جيد ويسمح لصب كمية صغيرة من تريكين أو برنامج تلفزيوني على أكسولوتل للحفاظ على بشرتها الرطب وتحسين جودة التصور.
تخلص من جميع المواد المستخدمة في صناديق النفايات المناسبة. تنظيف الأدوات الجراحية مع الايثانول 70٪، وتطهير باستخدام معقم الزجاج حبة بين الحيوانات، وتعقيم عن طريق التعقيم بعد الإجراء. تدفق أنابيب مع الحل بس ومن ثم استنزاف، تجف تماما، وتخزين لمزيد من الاستخدام.

5. التصور بيرفوسد أكسولوتل

وضع أكسولوتل تحت المجهر متحد البؤر الفلورسنت.

إيقاف الأضواء كما التصور من الأوعية الملوثة الجاذبة هو عائق من الضوء.

استخدام الأخضر مضان مرشح تصفية الانبعاثات (على سبيل المثال إت-CY3) مع المجهر متحد البؤر لتصور الأوعية الدموية من أكسولوتل. استخدام ضوء الإثارة من الطول الموجي 545 نانومتر.
ملاحظة: للحصول على صورة ذات جودة عالية، يمكن استخدام المعلمات التالية: التعرض ل 1.1 ثانية، وكسب 1X، والتشبع من 1.0، والتكبير 2X.

النتائج

مع تلطيخ الجاذبة، والأوعية الدموية من أكسولوتل يمكن تصور بسهولة. الأوعية الدموية من الحيوانات بيرفوسد مع صبغ محبة للدهون هي مرئية على الفور تحت المجهر متحد البؤر الفلورسنت. الشكل 1-1-1.5 هو تمثيل تخطيطي لبروتوكول نضح. بعد ?...

Discussion

التصور من الأوعية الدموية من أكسولوتل يمكن أن يتحقق بنجاح عن طريق نضح مع صبغ كاربوسيانين محبة للدهون، الجاذبة. في هذه الدراسة، ونحن تصف بروتوكول رواية لنضح من أكسولوتل مع الجاذبة باستخدام مضخة تحوي. وتبين لنا أيضا التصور اللاحق من الأوعية الدموية أكسولوتل باستخدام ?...

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

وأيد هذا البحث من قبل مستشفى بريغهام والمرأة ومارس دايمس. ويود المؤلفون أن يشكروا جميع أعضاء مختبر وايتيد على دعمهم ومشورتهم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic Pump	Marshall Scientific	RD-RP1
Perfusion tubing	Excelon Lab & Vacuum Tubing	436901705	size S1A
27g butterfly needle	EXELint Medical Products	26709
NaCl	AmericanBio	7647-14-5
KCl	AmericanBio	7747-40-7
Na₂HPO₄	AmericanBio	7558-79-4
NaH₂PO₄	AmericanBio	10049-21-5
Distilled water
HCl	AmericanBio	7647-01-0
Glucose	ThermoFischer	A2494001
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	468495
Ethanol (100% vol/vol)	Sigma Aldrich	64-17-5
Surgical foreceps	Medline	MDG0748741
Polystyrene foam frame			any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out
Surgical scissors	Medline	DYND04025
Scalpel	Medline	MDS15210
Absorbent underpad	Avacare Medical	PKUFSx
Paper towels
Standard disposable transfer pipette	Fisherbrand	50216954
Clamp stand	Adafruit	291
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma Aldrich	E10521	Tricaine powder
Adult axolotl
MgSO₄	AmericanBio	10034-99-8
CaCl₂	Sigma Aldrich	C1016-100G
NaHCO₃	Sigma Aldrich	S5761-500G
Plastic tanks			Varying size appropriate for the axolotl
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	30525-89-4
Axolotl
Leica Microscope	Leica	M165 FC
ET-CY3 Fluorescent Filter	Leica	M205FA/M165FC
MS-222

References

Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels. J Vis Exp. (71), e4374 (2013).
Minnich, B., Lametschwandtner, A. Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues. Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).
Honig, M., Hume, R. I. DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).
Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
Schwartz, M., Agranoff, B. W. Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells. Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).
Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).
Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl. Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).
Brockes, J. P., Kumar, A. Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine. Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).
Smith, A. R., Wolpert, L. Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration. Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

124 1 1 3 3 3 3

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: