혈관 시각화를위한 DiI 관류<em&gt; 암 브리 스 토마 멕 시카 눔</em

요약

친 유성 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) 염색 기술을 사용하여 Ambystoma mexicanum 은 혈관 관류를 쉽게 시각화 할 수 있도록 혈관 재관류를받을 수 있습니다.

초록

관류 기술은 조직 순환을 시각화하기 위해 수세기 동안 사용되어 왔습니다. Axolotl (Ambystoma mexicanum)은 재생 연구에 필수적인 모델로 부상 한 도롱뇽 종입니다. 이러한 동물에서 재생의 맥락에서 혈관 재개 골이 어떻게 발생하는지에 대해서는 거의 알려지지 않았다. 여기에 우리는 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)의 관류를 통한 axolotl에서 vasculature의 시각화를위한 간단한 방법을보고합니다. DiI는 내피 세포의 원형질막에 순간적으로 삽입되는 친 유성 카보시 아닌 염료이다. 관류는 DiI가 대동맥을 통해 혈액 순환을 시작하도록 연동 펌프를 사용하여 이루어집니다. 관류 중에 염료는 axolotl의 혈관을 통해 흐르고 접촉시 혈관 내피 세포의 지질 이중층으로 통합됩니다. 관류 절차는 8 인치 axolotl에 대해 약 1 시간이 걸립니다. 관류 직후Axiotl은 공 촛점 형광 현미경으로 시각화 할 수 있습니다. DiI는 녹색 형광 필터로 여기 될 때 적색 주황색 범위에서 빛을 방출합니다. 이 DiI 관류 절차는 axolotls의 혈관 구조를 시각화하거나 재생 조직에서 revascularization의 패턴을 보여주는 데 사용할 수 있습니다.

서문

vasculature의 시각화는 많은 종의 생물체의 구조와 기능을 이해하는 데 중요한 역할을합니다. 레오나르도 다빈치 (Leonardo da Vinci)와 함께 16 세기를 시작으로 순환의 모델과 그래픽 표현이 연구되었습니다 ¹ . 왁스와 고무 몰드를 사용하여 조직을 관류하여 혈관 구조의 3 차원 모델을 만들어 기관 발생과 병인에 대한 연구를 허용했다. 수지 및 왁스는 인도 잉크 또는 카민 레드와 같은 염료로 착색되어 쉽게 시각화 할 수있었습니다 ^{1 , 2} . 그러나,이 기술은 높은 점도가 관심있는 조직의 완전한 재관류를 방해했기 때문에 많은 문제를 야기했습니다. 분야가 더욱 정교 해짐에 따라 공 초점 및 전자 현미경을 사용하여 관류 기술을 이동 시켰습니다 주형에서 떨어져서 혈관계의 액체 관류로 이동하며, 그 중 일부는 초기 조직을 파괴하지 않고 혈관의 관류 및 영상화를 허용한다. 형광 색소 인 DiI는 혈관 조직에 손상을주지 않고 동물의 재관류를 허용하는 얼룩 중 하나입니다.

Carbocyanine 염료는 접촉시 세포막에 통합되는 친 유성 염료입니다. 이 염료는 혈관 내피 세포를 쉽고 즉각적으로 염색 할 수있게하여 형광 공 촛점 현미경으로 관찰 할 수 있습니다. DiI는 세포의 지질막에서 측면 확산을 통해 이동하며, 뉴런의 표지 및 추적에 나와 있습니다 ⁴ . 화학적으로 DiI의 두 알킬 사슬은 염료에 세포막에 대한 높은 친 화성을 부여하는 반면 녹색 형광등 필터로 여기 될 때 적색 파장을 방출하는 형광 염료의 두 개의 공액 고리> 4. DiI는 뉴런 ^{5 , 6} 에서 원형질막의 성공적인 표지 및 전장 및 역행 라벨링을 포함한 많은 역량에 활용되어 왔습니다. DiI는 이전에 관류 프로토콜에서 마우스 ⁷ 의 혈관을 시각화하는 동안 사용되었습니다.

Axolotls ( Ambystoma mexicanum )는 멕시코 시티 인근의 소금기가 많은 호수에서 독점적으로 사는 도롱뇽입니다. 이 동물들은 전체 사지, 꼬리 (신경 코드 포함), 심장 및 기타 내장 기관의 일부 및 성인의 눈 부분을 재생할 수 있으므로 재생 과정을 이해하는 데 중요한 모델이되었습니다. 또한 Axolotls에 유전 도구를 최근에 적용함으로써 분자와 세포에 대한 전례없는 통찰력이 이제 가능 해졌다. 성공적인 재생산전체 사지 배합에는 광범위한 혈관 재개 화 과정이 필요하며 이는 단순히 산소와 영양소를 제공하는 혈관의 전통적인 기능 이상으로 중생에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 조직 재생의 맥락에서 재 시술을 이해하는 것이 필수적입니다. Axolotl 혈관은 이전에 India Ink를 사용하여 시각화되었으며 그 결과가 흥미 롭지 만이 과정은 이후 ¹⁰ 년 동안 재검토되지 않았습니다. 우리는 axolotl vasculature ⁷ 의 완벽한 재관류 및 시각화를 허용하기 위해 포유류에서 사용하기 위해 개발 된 DiI 관류 프로토콜을 채택하려고했습니다. 이 프로토콜은 DiI 얼룩 기법으로 axolotl 순환을 성공적으로 관류하고 시각화하는 단계를 설명합니다. 이 절차는 조직을 재생하는 것뿐만 아니라 항상성 조직에서 특허 혈관을 정확하게 시각화 할 수있게하며, 시각화를위한 새로운 방법을 제공합니다n 및 axolotl에서 revascularization 과정의 분석.

프로토콜

모든 axolotl 실험은 Brigham and Women 's Hospital (BWH) 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라 수행되었습니다.

1. 관류 실험 설정

1. 0.1 % 트리 카인 용액 (MS222)으로 채워진 플라스틱 용기에 성인 axolotl을 15-20 분 동안 또는 완전히 마취 될 때까지 놓습니다. axolotl이 완전히 잠기도록 용기에 충분한 트리 카인 용액이 채워 졌는지 확인하십시오.
   주 : 모든 절차는 기관 동물 관리 지침에 따라 수행되어야합니다. BWH에서 axolotl은 foot-pinch test에 실패 할 때 완전히 마비 된 것으로 간주됩니다. 즉, 발이 부드럽게 눌려 질 때 반사 운동이 없음을 의미합니다.
   주의 : 트리 세인은 수생 생물에 특별히 사용되는 마취제이지만 트리 카인 용액과 직접 피부 접촉을 피하십시오.
2. axolotl 관류 스테이션을 설정하십시오.
   1. 장소흡수성 패드를 평평하고 평평한 표면에 놓고 흡수성면을 위로 향하게합니다.
   2. anesthetized axolotl가 앙와위 위치에 누워 적절한 크기와 모양입니다 폴리스티렌 폼 프레임에 구멍을 자르십시오. 프레임을 흡수 패드 위에 놓습니다.
      참고 : 여분의 종이 타월은 흡수력을 높이기 위해 프레임 바로 아래에 배치 할 수 있습니다.
   3. 연동 튜브에 연동 펌프를로드하십시오. 펌프를 0.7 ml / min의 유속으로 설정하고 시계 방향으로 흐르게하십시오.
   4. 1 : 4 혼합물로 0.7x PBS와 5 % 포도당으로 희석액을 만듭니다.
   5. 희석액 10 mL와 DiI 원액 200 μL를 50 mL 원뿔 튜브에 섞는다. 모자를 씌우고 뒤집습니다. 이 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 작업 용액이 빛에 노출되지 않도록하십시오.
      참고 : 볼륨은 axolotl의 크기에 비례하여 변경해야합니다. 이 값은 약 15cm axolotl (주둥이 - 꼬리 길이)에 대한 것입니다. 에이이 크기의 nalals는 완전한 성적인 성숙에 도달하지 않았을 수 있으므로 동물성은 현재 결정되지 않을 수 있습니다.
   6. 0.7x PBS와 50 ML 원뿔 튜브를 채 웁니다.
      참고 : PBS는 루프 및 axolotl exsanguination을 준비하는 데 사용됩니다.
   7. 27 게이지 버터 플라이 바늘을 관류 튜빙의 출구 끝 부분에 부착하십시오. 나비 날개를 서로 접어 클램프 스탠드에 놓습니다.
   8. 전체 튜빙이 솔루션으로 가득 때까지 0.7x PBS로 채워진 50 ML 원뿔 튜브에 재관류 튜빙의 자유 엔드를 배치하고 재관류 펌프를 실행합니다. 전체 튜빙이 PBS로 채워지면 펌프를 멈추십시오.
      참고 : 튜빙에 항상 공기 방울이 없어야합니다. 튜브가 공기 방울이 없으므로 축삭 안에 공기 색전이 생기고 완전 관류가되지 않게됩니다.
   9. 폴리스티렌 폼 프레임의 axolotl 모양 금형에 종이 타월을 둡니다. 전송 피펫을 사용하여 수건에 트리 세인 용액을 담급니다.
      참고 : 종이 묶음의 중간에 작은 사각형을 자릅니다.el을 사용하여 재관류 과정 중에 유체의 배액을 허용합니다.
   10. 마취 된 axolotl을 폴리스티렌 폼 프레임 안의 종이 타월에 올려 놓습니다.

2. Axolotl 가슴 열기

1. 외과 용 집게를 사용하여 어깨 라인 바로 아래 axolotl 가슴의 중심 축을 따라 피부를 집어 넣습니다. 당겨.
2. 메스를 사용하여 피부를 뽑은 작은 절개를하십시오.
3. 두 개의 연골 판을 드러내려면 가슴 위에 피부의 정사각형 패치를 제거하십시오.
   1. 심장을 명확하게 볼 수있을만큼 충분히 큰 흉강과 심장에서 약 5 mm 떨어진 대동맥을 덮는 창을 열려면 피부를 제거하십시오.
4. 주요 혈관을 자르지 않으려면 포셉 또는 닫힌 가위를 사용하여 조심스럽게 결합 조직을 찢습니다.
5. 겸자를 사용하여 각 연골 플레이트를 개별적으로 들어 올리고수술 용 가위.
6. 조심스럽게 포 셉으로 심낭을 집어 올려서 위로 들어 올려 외과 용 가위로 구멍을 뚫습니다. 이 절개는 매우 얇은 심낭을 뚫기에 충분할 정도로 깊어 야하고 심낭을 제거 할만큼 충분히 커야합니다. 심장을 자르지 않도록주의하십시오.
7. 심장과 대동맥을 노출시키기 위해 섬세하게 심낭을 제거하십시오.
   참고 : 전송 피펫을 사용하여 주기적으로 흉강과 아가미를 트리 카인 용액으로 세척하여 영역을 깨끗하게 유지하고 axolotl을 마취 상태로 유지하십시오.

3. Axolotl의 관류

1. 클램프의 팔이 axolotl 대동맥에 바늘을 삽입하기 위해 쉽게 조작 할 수 있도록로드 된 나비 바늘과 폴리스티렌 폼 프레임 옆에 클램프 스탠드를 놓습니다. 삽입하는 동안 동물의 주동기 측면을 향해 바늘의 끝 부분을 가리키고 대동맥과 평행을 유지하여 수술을 통해 구멍을 뚫지 않도록하십시오긍정적 측면.
2. 연동 펌프를 켭니다. 0.7x PBS는 튜브를 통해 계속 흐릅니다.
3. 대동맥에 바늘을 삽입합니다.
   1. 대동맥 아치 아래에 집게를 슬라이드하고 쉽게 접근 할 수 있도록 약간 당겨.
   2. 바늘이 대동맥의 길이를 따라 움직 이도록 머리를 향해 위로 향하게하는 바늘 조이기 조합을 조종하십시오. 대동맥 뒤에 지원을위한 포 셉를 사용하는 동안 바늘을 삽입합니다.
      참고 : 바늘은 관류 중에 미끄러지지 않도록 충분히 깊게 대동맥에 삽입해야합니다. 이것은 15cm axolotl에 대해 약 5mm 일 수 있습니다. 혈관의 완전한 천공을 피하기 위해 바늘이 대동맥과 완벽하게 일치하는지 확인하십시오. through-and-through 구멍은 거대한 출혈을 일으키고 관류 성공률을 감소시킬 수 있습니다. 성공적인 삽입은 심장의 심방이 눈에 띄게 확대되어 확인할 수 있습니다.
4. sci로 하나의 아트리움을 빠르게 찢어 내십시오.혈액을 배출하도록 허용합니다.
   1. 흉강 내 혈액 축적 및 응고 형성을 방지하기 위해 트리 세인 용액으로 세척하십시오.
5. 약 20-30 ML PBS로 axolotl을 Perfuse. 동물은 성공적인 재관류에서 밝은 핑크색에서 흰색으로 바뀌어야합니다.
6. 연동 펌프를 멈추고 튜브의 자유 단을 DiI 용액 15 mL 튜브에 넣으십시오. 펌프를 다시 시작하고 튜빙에 공기 방울이 생기지 않도록주의하십시오.
7. DiI의 전체 작업 재고로 axolotl을 퍼 퓨즈하십시오.
   참고 : 성공적으로 재관류, Diol의 밝은 분홍색으로 변경 색상 axolotl. 이것은 아가미에서 가장 두드러 질 것입니다.
8. DiI로 관류 한 후 펌프를 멈추고 튜브의 자유 단을 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액에 넣고 조직을 고정시킵니다. 펌프를 다시 시작하고 PFA 10 mL 이상을 관류하십시오.
   주의 : PFA는 독성 물질이므로 취급 및 폐기해야합니다.적절하게 sed. 장갑과 보안경을 착용하고 용액을 흄 후드 안에서 만들어야합니다. 조직을 고정시키기 위해 PFA로 axolotl을 관류 시키면 동물이 사망하게됩니다.

4. 관류 및 시각화 준비 종료

1. 연동 펌프를 멈추고 axolotl 대동맥에서 바늘을 제거하십시오.
2. 플라스틱 접시에 axolotl을 놓으십시오.
   참고 : 대형 페트리 접시의 절반을 사용하면 잘 작동하고 피부를 젖게하고 시각화 품질을 향상시키기 위해 axricotl에 소량의 Tricaine 또는 PBS를 부어 넣을 수 있습니다.
3. 사용 된 모든 재료는 적절한 쓰레기통에 버리십시오. 수술 도구를 70 % 에탄올로 청소하고, 동물 사이에 유리 비드 멸균기를 사용하여 소독하고, 절차에 따라 고압 증기 멸균으로 멸균하십시오. PBS 용액으로 튜브를 세척 한 다음 배액하고 완전히 말린 다음 나중에 사용할 수 있도록 보관하십시오.

5. Perfused Axolotl의 시각화

1. Axolotl을 형광 공 촛점 현미경 아래에 놓습니다.
2. DiI로 염색 된 혈관의 시각화가 빛에 의해 방해되면 빛을 끕니다.
3. Axolotl의 vasculature을 시각화하기 위해 공 촛점 현미경과 녹색 형광 방출 필터 큐브 ( 예 : ET - CY3)를 사용하십시오. 파장 545 nm의 여기 광을 사용하십시오.
   참고 : 고화질 이미지를 얻으려면 1.1 초 노출, 1 배 게인, 1.0 채도, 2 배 배율의 매개 변수를 사용할 수 있습니다.

결과

DiI 염색으로 Axolotl의 혈관계를 쉽게 시각화 할 수 있습니다. 친 유성 염료로 관류 된 동물의 혈관은 형광 공 촛점 현미경으로 즉시 볼 수 있습니다. 그림 1 .1-1.5 는 재관류 프로토콜의 개략도입니다. 밝은 핑크색 염료로 관류 한 후, 성공적으로 관류 된 축색 돌기가 분홍색으로 보일 것입니다. 공 촛점 현미경에 녹색 형광 필터를 사용...

토론

axolotl의 vasculature의 시각화는 lipophilic 카보시 아닌 염료, DiI와 재관류를 통해 성공적으로 수행 할 수 있습니다. 이 연구에서는 연축 펌프를 사용하여 DiI로 axolotl을 재관류하기위한 새로운 프로토콜을 설명합니다. 우리는 또한 형광 공 촛점 현미경을 사용 axolotl vasculature의 후속 시각화를 보여줍니다. 이 프로토콜은 Li et al. 에서 볼 수있는 설치류 DiI 재관류 프로토콜의 적응 이다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic Pump	Marshall Scientific	RD-RP1
Perfusion tubing	Excelon Lab & Vacuum Tubing	436901705	size S1A
27g butterfly needle	EXELint Medical Products	26709
NaCl	AmericanBio	7647-14-5
KCl	AmericanBio	7747-40-7
Na2HPO4	AmericanBio	7558-79-4
NaH2PO4	AmericanBio	10049-21-5
Distilled water
HCl	AmericanBio	7647-01-0
Glucose	ThermoFischer	A2494001
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	468495
Ethanol (100% vol/vol)	Sigma Aldrich	64-17-5
Surgical foreceps	Medline	MDG0748741
Polystyrene foam frame			any polystyrene foam square with an axolotl-shaped  cut out
Surgical scissors	Medline	DYND04025
Scalpel	Medline	MDS15210
Absorbent underpad	Avacare Medical	PKUFSx
Paper towels
Standard disposable transfer pipette	Fisherbrand	50216954
Clamp stand	Adafruit	291
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma Aldrich	E10521	Tricaine powder
Adult axolotl
MgSO4	AmericanBio	10034-99-8
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016-100G
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761-500G
Plastic tanks			Varying size appropriate for the axolotl
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	30525-89-4
Axolotl
Leica Microscope	Leica	M165 FC
ET-CY3 Fluorescent Filter	Leica	M205FA/M165FC
MS-222