DiI Perfusion come metodo per la visualizzazione vascolare in<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Riepilogo

Utilizzando una tecnica di colorazione perplata di Di-tetraetilindocarbocyanina perchlorato (DiI) lipofilica, l' Ambystoma mexicanum può essere sottoposta a perfusione vascolare per consentire una facile visualizzazione della vasculatura.

Abstract

Le tecniche di perfusione sono state utilizzate da secoli per visualizzare la circolazione dei tessuti. Axolotl (Ambystoma mexicanum) è una specie di salamandra che è emersa come un modello essenziale per gli studi di rigenerazione. Poco si sa circa come si verifica la rivascolarizzazione nel contesto della rigenerazione in questi animali. Qui riportiamo un metodo semplice per la visualizzazione della vasculatura in axolotl attraverso la perfusione di 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocyanin perchlorato (DiI). DiI è un colorante lipocilico di carbocyanina che inserisce istantaneamente nella membrana plasmatica delle cellule endoteliali. La perfusione avviene usando una pompa peristaltica in modo che DiI entri nella circolazione attraverso l'aorta. Durante la perfusione, il colorante scorre attraverso i vasi sanguigni dell'assolotl e si incorpora nel bilayer lipidico delle cellule endoteliali vascolari al contatto. La procedura di perfusione dura circa un'ora per un axolotl da otto pollici. Immediatamente dopo la perfusione wiTh DiI, l'axolotl può essere visualizzata con un microscopio fluocentrico confocale. Il DiI emette luce nella gamma rossa-arancione quando viene eccitato con un filtro fluorescente verde. Questa procedura di perfusione DiI può essere usata per visualizzare la struttura vascolare degli assoloti o per dimostrare modelli di rivascolarizzazione nei tessuti rigeneranti.

Introduzione

La visualizzazione della vascolarizzazione svolge un ruolo fondamentale nella comprensione della struttura e della funzione degli organismi in molte specie. A partire dal ^XVI secolo con Leonardo da Vinci sono stati studiati modelli e rappresentazioni grafiche della circolazione ¹ . Utilizzando cere e stampi di gomma, i tessuti sono stati perfusi per creare modelli tridimensionali della vasculatura, che hanno permesso lo studio dell'organogenesis e della patogenesi ^{1 , 2} . Le resine e le cere sono state colorate con coloranti come India Ink o rosso carminio per consentire la loro facile visualizzazione ^{1 , 2} . Tuttavia, queste tecniche hanno causato molti problemi perché le loro elevate viscosità impediscono la perfusione completa del tessuto di interesse ¹ . Poiché il campo è diventato più sofisticato, l'uso di microscopi confocali ed elettronici è entrato in gioco, spostando la tecnica di perfusione Lontano dagli stampi e verso perfusioni liquide della vasculatura, alcune delle quali permettevano la perfusione e l'imaging dei vasi sanguigni senza distruggere il tessuto iniziale ³ . DiI, un colorante fluorescente di carbocyanina, è una tale macchia che permette la perfusione di animali senza danneggiare il tessuto vascolare.

I coloranti di carbocianina sono coloranti lipofili che incorporano nelle membrane cellulari al contatto. Questi coloranti permettono la colorazione facile e istantanea di cellule endoteliali vascolari, che possono essere visualizzate sotto un microscopio confocale fluorescente. DiI si muove attraverso la diffusione laterale nella membrana lipidica delle cellule, come mostrato nell'etichettatura e nella traccia dei neuroni ⁴ . Chemically, le due catene alchiliche di Di conferiscono al colorante la sua elevata affinità per le membrane cellulari, mentre due anelli coniugati da un fluorochrome che è responsabile di emettere una lunghezza d'onda rossa quando eccitato dai filtri di luce fluorescenti verdi> 4. DiI è stato utilizzato in molte capacità, tra cui l'etichettatura di successo della membrana plasmatica e l'etichettatura anterograda e retrograda nei neuroni ^{5 , 6} . DiI è stato precedentemente utilizzato nei protocolli di perfusione mentre visualizza la vasculatura dei topi ⁷ .

Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) sono salamandri che vivono esclusivamente in laghetti salmastre vicino a Città del Messico, in Messico. Questi animali sono diventati un importante modello per comprendere processi rigenerativi in ​​quanto possono regenerare gli arti completi, la coda (compreso il cavo nervo), le parti del cuore e altri organi interni e le parti dell'occhio come adulti ^{8 , 9} . Inoltre, con la recente applicazione di strumenti genetici in axolotls, è ora possibile conoscere senza precedenti le molecole e le cellule che guidano questi processi ⁸ . Il regene di successoLa razione di un arto intero richiede un ampio processo di rivascolarizzazione, che può svolgere un ruolo significativo nella rigenerazione oltre le semplici funzioni dei vasi sanguigni nel fornire ossigeno e sostanze nutritive. La comprensione della rivascolarizzazione nel contesto della rigenerazione dei tessuti è indispensabile. I vasi sanguigni Axolotl sono stati precedentemente visualizzati usando l'India Ink e, mentre i risultati erano intriganti, questo processo non è stato rivisto nei decenni successivi ¹⁰ . Abbiamo cercato di adattare un protocollo di perfezionamento DiI sviluppato per essere utilizzato nei mammiferi per consentire una completa perfusione e visualizzazione della vasculatura axolotl ⁷ . Questo protocollo descrive le fasi adottate per perfezionare e successivamente visualizzare la circolazione dell'assolotlina con una tecnica di colorazione DiI. Questa procedura consentirà una visualizzazione precisa dei vasi sanguigni di brevetto nei tessuti omeostatici, nonché nel rigenerare i tessuti e fornisce un nuovo metodo di visualizatioN e l'analisi del processo di rivascolarizzazione nell'assolotl.

Protocollo

Tutta la sperimentazione dell'assolotl è stata eseguita in accordo con il comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di Brigham e dell'ospedale femminile (BWH).

1. Impostare Esperimento di Perfusion

1. Posizionare un axolotl adulto in un contenitore di plastica riempito con soluzione 0,1% di tricina (MS222) per 15-20 min o fino a quando completamente anestetizzato. Assicurarsi che il contenitore sia riempito con sufficiente soluzione di triciclici in modo che l'axolotl sia completamente sommerso.
   Nota: Tutte le procedure devono essere eseguite in conformità alle istruzioni istituzionali per la cura degli animali. A BWH, un axolotl è considerato completamente anestetizzato quando non riesce a provare un pizzicotto, il che significa che non c'è movimento riflessivo quando il piede viene spremuto dolcemente.
   Attenzione: Anche se la tricina è un anestetico specificamente utilizzato per gli organismi acquatici, è necessario evitare il contatto diretto della pelle con la soluzione tricina.
2. Impostare la stazione di perfusione axolotl.
   1. Posiziona ilRilievo assorbente su una superficie piana e livellata con il lato assorbente rivolto verso l'alto.
   2. Tagliare un foro nel telaio in polistirolo espanso che è la dimensione e la forma appropriati per l'assolotolo anestetizzato per giacere in posizione supina. Posizionare il telaio sul tampone assorbente.
      Nota: alcuni tovaglioli di carta supplementari possono essere posizionati immediatamente sotto il telaio per ulteriori assorbimenti.
   3. Caricare la pompa peristaltica con il tubo di perfusione. Impostare la pompa ad una portata di 0,7 ml / min, che scorre in senso orario.
   4. Preparare la soluzione diluita con 0,7x PBS e 5% di glucosio in una miscela 1: 4.
   5. Mescolare 10 ml di soluzione diluente con 200 μL della soluzione di base DiI in un tubo conico da 50 ml. Coprire e mescolare per inversione. Coprire questo tubo con carta in alluminio per proteggere la soluzione di lavoro dall'esposizione alla luce.
      Nota: i volumi dovrebbero essere modificati in base alla dimensione dell'assolotl proporzionalmente. Questi valori sono per un axolotl di circa 15 cm (lunghezza da coda a coda). UNI nomi di questa dimensione non possono avere raggiunto la piena maturità sessuale, quindi il sesso animale non può essere determinato in questo momento.
   6. Riempire un tubo conico da 50 ml con 0,7x PBS.
      Nota: PBS verrà utilizzato per l'innesco del ciclo e dell'exolinguizzazione dell'assolotl.
   7. Fissare l'ago a farfalla a 27 gauge all'estremità di uscita del tubo di perfusione. Piegare le ali delle farfalle su un altro e collocare nel supporto del morsetto.
   8. Posizionare l'estremità libera del tubo di perfusione nel tubo conico da 50 ml riempito di 0,7x PBS e eseguire la pompa di perfusione fino a quando l'intero tubo è riempito di soluzione. Sospendi la pompa una volta che l'intero tubo è riempito con PBS.
      Nota: assicurarsi che il tubo sia privo di bolle d'aria in qualsiasi momento, in quanto ciò provocherà l'embolia nell'assolotl e impedisce la perfusione completa.
   9. Mettere un tovagliolo di carta nello stampo a forma di axolotl nel telaio in polistirolo espanso. Usando una pipetta di trasferimento, immergere l'asciugamano con la soluzione di tricaine.
      Nota: Tagliare un piccolo quadrato in mezzo alla trama della cartaEl per consentire il drenaggio dei fluidi durante la procedura di perfusione.
   10. Posizionare l'axolotl anestetizzato supino sul tovagliolo di carta all'interno del telaio in polistirene espanso.

2. Apertura della cassa dell'Asolotl

1. Utilizzare pinze chirurgiche per pizzicare la pelle lungo l'asse centrale del petto dell'assolotl, appena sotto la linea delle spalle. Tirare in su.
2. Usa un bisturi per fare una piccola incisione dove la pelle è stata tirata.
3. Rimuovere una patch quadrata di pelle sopra il torace per rivelare due piastre di cartilagine.
   1. Rimuovi la pelle per aprire una finestra sulla cavità toracica abbastanza grande da vedere chiaramente il cuore e circa 5 mm dell'aletta che si ramifica dal cuore.
4. Attentamente strappare il tessuto connettivo con pinze o forbici chiuse per evitare di tagliare i vasi sanguigni più importanti.
5. Sollevare ciascuna piastra di cartilagine singolarmente usando le pinze e scambiandoleCon le forbici chirurgiche.
6. Stringere con cautela il pericardio con le pinze, sollevare e forzarlo con le forbici chirurgiche; Questa incisione dovrebbe essere abbastanza profonda da percuotere il pericardio molto sottile e dovrebbe essere abbastanza grande da permettere la rimozione del pericardio. Fare attenzione a non tagliare il cuore.
7. Rimuovere delicatamente il pericardio per esporre il cuore e l'aorta.
   Nota: Usando una pipetta di trasferimento, periodicamente sciacquare la cavità toracica e le gole con la soluzione tricaine per mantenere l'area chiara e mantenere l'axolotl anestetizzato.

3. Perfusione dell'Asolotl

1. Posizionare lo staffa con l'ago a farfalla caricato accanto al telaio in polistirolo espanso, in modo tale che il braccio del morsetto possa essere facilmente manipolato per inserire l'ago nell'aletto axolotl. Puntare la punta dell'ago verso l'aspetto rostralo dell'animale durante l'inserimento e mantenere l'ago parallelo all'aorta per evitare di perforarla attraverso l'opLato positiva.
2. Accendere la pompa peristaltica. 0.7x PBS dovrebbe continuare a fluire attraverso il tubo.
3. Inserire l'ago nell'aletta.
   1. Far scivolare la pinza sotto l'arco aortico e sollevare leggermente per consentire un facile accesso.
   2. Manovrare la combinazione di aghi-ago in modo tale che l'ago corre lungo la lunghezza dell'arto, rivolto verso la testa. Inserire l'ago durante l'uso della pinza per il supporto dietro l'aorta.
      Nota: L'ago deve essere inserito abbastanza profondamente nell'aorta per assicurarsi che non scivoli durante la perfusione. Questo può essere di circa 5 mm per un axolotl da 15 cm. Assicurarsi che l'ago sia perfettamente in linea con l'aorta per evitare la completa foratura del vaso. Le puncture attraverso-e-through possono causare emorragie massicce e diminuire i tassi di successo della perfusione. L'inserimento riuscito può essere confermato dall'allargamento visibile dell'atria del cuore.
4. Rapidamente lacerate un atrio con la sciSsors e consentire il sangue di scarico.
   1. Sciacquare con la soluzione tricaina per prevenire l'accumulo di sangue e la formazione di coaguli nella cavità toracica.
5. Perfuse l'axolotl con circa 20-30 mL di PBS. L'animale dovrebbe cambiare da rosa chiaro in colore a bianco in una perfusione di successo.
6. Sospendi la pompa peristaltica e sposta l'estremità libera del tubo nel tubo da 15 ml di soluzione DiI. Riavviare la pompa, fai attenzione a non creare delle bolle d'aria nel tubo.
7. Perfuse l'axolotl con l'intero stock di DiI.
   Nota: in una perfetta perfusione, l'axolotl con colore cambiato al rosa brillante della DiI. Questo sarà più evidente nelle cavità.
8. Sospendi la pompa dopo la perfusione con DiI è completa e metta l'estremità libera del tubo in soluzione 4% di paraformaldeide (PFA) per fissare il tessuto. Riavviare la pompa e perfezionare almeno 10 mL di PFA.
   Attenzione: il PFA è tossico e deve essere manipolato e dispoSed di appropriato. Guanti e occhiali di protezione devono essere indossati e soluzioni devono essere fatte all'interno di un cappuccio. La perfusione dell'assolotl con PFA per fissare i tessuti provoca la morte dell'animale.

4. Terminare la preparazione della perfusione e della visualizzazione

1. Arrestare la pompa peristaltica e rimuovere l'ago dall'alettone axolotl.
2. Posizionare l'axolotl su una piastra di plastica.
   Nota: Utilizzando una metà di un grande piatto di Petri funziona bene e permette di versare una piccola quantità di Tricaine o PBS sull'assolotl per mantenere la pelle bagnata e migliorare la qualità della visualizzazione.
3. Smaltire tutti i materiali utilizzati nei contenitori idonei. Pulire gli attrezzi chirurgici con il 70% di etanolo, disinfettare con uno sterilizzatore di vetro tra gli animali e sterilizzare mediante autoclave seguendo la procedura. Infilare il tubo con la soluzione PBS e quindi scolare, asciugare completamente e conservare per ulteriori impieghi.

5. Visualizzare l'Axolotl Perfuso

1. Posizionare l'axolotl sotto un microscopio confocale fluorescente.
2. Spegni le luci come la visualizzazione delle navi trattate con DiI è ostacolata dalla luce.
3. Utilizzare un cubo di filtro per emissione di fluorescenza verde ( ad es. ET-CY3) con il microscopio confocale per visualizzare la vascolarizzazione dell'assolotl. Utilizzare la luce di eccitazione della lunghezza d'onda 545 nm.
   Nota: Per ottenere un'immagine di alta qualità, è possibile utilizzare i seguenti parametri: esposizione per 1,1 s, guadagno di 1x, saturazione di 1,0, ingrandimento di 2X.

Risultati

Con la colorazione DiI, la vasculatura dell'assolotl può essere facilmente visualizzata. I vasi sanguigni di animali perfusi con il colorante lipofile sono immediatamente visibili sotto un microscopio confocale fluorescente. La Figura 1 .1-1.5 è una rappresentazione schematica del protocollo di perfusione. Dopo la perfusione con il colorante rosa brillante, un axolotl perfuso perfettamente apparirà rosa. Usando un filtro fluores...

Discussione

La visualizzazione della vasculatura dell'assolotl può essere ottenuta con perfezionamento con il colorante lipocilico di carbocyanina, DiI. In questo studio descriviamo un nuovo protocollo per la perfusione dell'assolotl con DiI usando una pompa peristaltica. Mostriamo anche la successiva visualizzazione della vasculatura axolotl utilizzando un microscopio confocale fluorescente. Questo protocollo è stato un adattamento del protocollo di perfusione di roditore DiI visto in Li et al.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic Pump	Marshall Scientific	RD-RP1
Perfusion tubing	Excelon Lab & Vacuum Tubing	436901705	size S1A
27g butterfly needle	EXELint Medical Products	26709
NaCl	AmericanBio	7647-14-5
KCl	AmericanBio	7747-40-7
Na2HPO4	AmericanBio	7558-79-4
NaH2PO4	AmericanBio	10049-21-5
Distilled water
HCl	AmericanBio	7647-01-0
Glucose	ThermoFischer	A2494001
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	468495
Ethanol (100% vol/vol)	Sigma Aldrich	64-17-5
Surgical foreceps	Medline	MDG0748741
Polystyrene foam frame			any polystyrene foam square with an axolotl-shaped  cut out
Surgical scissors	Medline	DYND04025
Scalpel	Medline	MDS15210
Absorbent underpad	Avacare Medical	PKUFSx
Paper towels
Standard disposable transfer pipette	Fisherbrand	50216954
Clamp stand	Adafruit	291
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma Aldrich	E10521	Tricaine powder
Adult axolotl
MgSO4	AmericanBio	10034-99-8
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016-100G
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761-500G
Plastic tanks			Varying size appropriate for the axolotl
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	30525-89-4
Axolotl
Leica Microscope	Leica	M165 FC
ET-CY3 Fluorescent Filter	Leica	M205FA/M165FC
MS-222