Vasküler Görselleştirme İçin Bir Yöntem Olarak DiI Perfüzyonu<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Özet

Bir lipofilik 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindokarbosiyanin perklorat (DiI) boyama tekniği kullanarak, Ambystoma mexicanum vasküler yapının kolay görselleştirilmesini sağlamak için vasküler perfüzyona uğrayabilir.

Özet

Perfüzyon teknikleri dokuların dolaşımını görselleştirmek için yüzyıllar boyunca kullanılmıştır. Axolotl (Ambystoma mexicanum), rejenerasyon çalışmaları için önemli bir model olarak ortaya çıkan bir semender çeşididir. Bu hayvanlarda rejenerasyon bağlamında revaskülarizasyonun nasıl gerçekleştiği hakkında pek az şey bilinmektedir. Burada 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) perfüzyonu ile axolotl vaskülatürün görselleştirilmesi için basit bir metodu sunuyoruz. DiI, endotel hücrelerinin plazma membranına anlık olarak giren bir lipofilik karbosiyanin boyadır. Perfüzyon, periyodik bir pompa kullanılarak gerçekleştirilir; böylece DiI, aort üzerinden dolaşıma girer. Perfüzyon sırasında, boya, aksolot'un kan damarları boyunca akar ve temas üzerine vasküler endotel hücrelerin lipid iki katmanına dahil edilir. Perfüzyon işlemi sekiz inçlik bir aksolot için yaklaşık bir saat sürer. Perfüzyon sonrası hemenDiolotl, konfokal flüoresan mikroskop ile görselleştirilebilir. DiI, yeşil-floresan filtresi ile heyecanlandığında kırmızı-turuncu renkte ışık yayar. Bu DiI perfüzyon prosedürü aksolotların vasküler yapısını görselleştirmek veya rejenere dokularda revaskülarizasyon modelleri göstermek için kullanılabilir.

Giriş

Vaskülatürün görselleştirilmesi, birçok canlıda organizmaların yapı ve işlevlerinin anlaşılmasında hayati bir rol oynamaktadır. 16. yüzyılda Leonardo da Vinci ile başlayan dolaşım modelleri ve grafik gösterimleri incelenmiştir. Balmumları ve kauçuk kalıpları kullanarak dokular, organogenez ve patogenez ^{1 , 2} çalışmasına izin veren vaskülatürün üç boyutlu modellerini oluşturmak için perfüze edildi. Reçineler ve mumlar Hindistan Mürekkebi veya karmin kırmızısı gibi boyalarla renklendirildi ve ^{1 , 2} kolay görselleştirmelerine izin verdi. Bununla birlikte, bu teknikler yüksek viskozite nedeniyle ilgi dokularının tam perfüzyonunu engellediğinden pek çok soruna neden olmuştur. Alan daha sofistike hale geldiğinde, konfokal ve elektron mikroskoplarının kullanımı, perfüzyon tekniğini Döküm kalıplarından ve vaskülatürün sıvı perfüzyonlarına doğru uzanır, bazıları ilk dokuyu yok etmeden kan damarlarının perfüzyon ve görüntülemesine izin verir ³ . DiI, flüoresan bir karbosiyanin boyası, hayvanların vasküler dokuya zarar vermeden perfüzyonuna izin veren böyle bir leke oluşturmaktadır.

Karbosiyanin boyaları, temas üzerine hücre zarlarına dahil edilen lipofilik boyalardır. Bu boyalar vasküler endotel hücrelerinin kolay ve anında lekelenmesine izin verir, bu da floresan bir konfokal mikroskop altında izlenebilir. Nöronların etiketlenmesinde ve izlenmesinde gösterildiği gibi DiI, yanal difüzyon yoluyla hücrelerin lipid zarında hareket eder ⁴ . Kimyasal olarak, DiI'nin iki alkil zinciri boya hücre zarları için yüksek afiniteye sahipken, yeşil flüoresan ışık filtreleri tarafından uyarıldığında kırmızı bir dalga boyu yaymaktan sorumlu bir florokromdan iki eşlenik halka> 4. DiI, plazma membranının başarılı bir şekilde etiketlenmesi ve nöronlarda anterograde ve retrograd etiketleme de dahil olmak üzere birçok kapasitede kullanılmıştır 5,6. DiI, daha önce, farelerin vaskülatürünü görselleştirirken perfüzyon protokollerinde kullanılmıştır ⁷ .

Axolotls ( Ambystoma mexicanum ), Mexico City, Meksika yakınlarındaki hafif tuzlu gölde yaşayan tezahüratçılardır. Bu hayvanlar, tam ekstremiteler, kuyruk (sinir kablosu dahil), kalp ve diğer iç organların bölümlerini ve yetişkinler ^{8 , 9} gibi göz kısımlarını yenileyebildikleri için rejeneratif işlemleri anlamak için önemli bir model haline gelmiştir. Ayrıca, son zamanlarda aksolotlarda genetik araçların uygulanmasıyla, bu süreçleri yönlendiren moleküllere ve hücrelere benzeri görülmemiş bir fikir verilmesi artık mümkündür. Başarılı rejimTüm ekstremitenin rasyonunda, oksijen ve besin sağlanmasındaki kan damarlarının sadece geleneksel işlevlerinin ötesinde yenilemede önemli bir rol oynayabilecek kapsamlı bir revaskülarizasyon süreci gereklidir. Doku rejenerasyonu bağlamında revaskülarizasyonu anlamak zorunludur. Axolotl kan damarları daha önce Hindistan Mürekkebi kullanılarak görselleştirildi ve sonuç ilginç iken, sonraki süreçte bu süreç tekrar gözden geçirilmedi ¹⁰ . Memelilerde kullanılmak üzere geliştirilmiş bir DiI perfüzyon protokolünü tam bir perfüzyona ve axolotl vaskülatürünün görselleştirilmesine izin vermek için uyarlamaya çalıştık. Bu protokol, DiI boyama tekniği ile başarılı bir şekilde perfüzyon yapmak ve ardından aksolotil dolaşımı görselleştirmek için atılan adımları açıklar. Bu prosedür, homeostatik dokularda patent kan damarlarının hassas şekilde görüntülenmesine ve dokuların yenilenmesine olanak tanır ve görselleştirme için yeni bir yöntem sunarN ve axolotl'deki revaskülarizasyon sürecinin analizi.

Protokol

Tüm axolotl deneyleri Brigham ve Kadın Hastanesi (BWH) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi'ne uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Perfüzyon Deneyi oluşturun

1. Yetişkin bir aksolotu% 15 tricaine solüsyonu (MS222) ile dolu plastik bir kapta 15-20 dakika boyunca veya tamamen anestezi edilinceye kadar yerleştirin. Kabın, aksolotl tamamen suya batırılmış olacak şekilde yeterli tricaine solüsyonu ile doldurulduğundan emin olun.
   Not: Bütün prosedürler, kurumsal hayvan bakım kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmelidir. BWH'de, bir ayak-sıkışması testinde başarısız olduğunda bir aksolot'un tamamen anestezi altına alındığı düşünülür; yani, ayak hafifçe sıkıldığında refleksive bir hareket yoktur.
   Dikkat: Tricaine, suda yaşayan organizmalar için özel olarak kullanılan anestezik olmasına rağmen, tricaine solüsyonuyla doğrudan cilt temasından kaçınılmalıdır.
2. Axolotl perfüzyon istasyonunu kurun.
   1. YerleştirinEmici ped, emici taraf yukarı bakacak şekilde düz, düz bir yüzeye yerleştirilir.
   2. Polystyrene foam çerçevesinde, anestezi uygulanmış axolotl'un sırtüpe yerleştirilmesi için uygun boyut ve şekle sahip bir delik açın. Çerçeveyi emici ped üzerine yerleştirin.
      Not: İlave emici olması için bazı ilave kağıt havluları çerçevenin hemen altına yerleştirilebilir.
   3. Peristaltik pompayı perfüzyon hortumu ile yükleyin. Pompayı, saat yönünde akan 0,7 ml / dakika akış hızına ayarlayın.
   4. 1: 4 oranında 0.7x PBS ve% 5 glukoz ile seyreltici solüsyon yapın.
   5. 10 mL seyreltici solüsyonu 50 mL'lik konik bir tüp içerisinde 200 μL DiI stok solüsyonuyla karıştırın. Kap ve karıştırarak karıştırın. Işık solüsyonunu ışığa maruz kalmamak için alüminyum folyo kağıdıyla tüpü kapatın.
      Not: Ciltler orantılı olarak axolotl boyutuna göre değiştirilmelidir. Bu değerler, yaklaşık 15 cm'lik bir aksolot (burun-kuyruk uzunluğu) içindir. birBu büyüklükteki nimals tam cinsel olgunluğa ulaşmamış olabilir, bu nedenle hayvan cinsiyeti şu anda belirlenemeyebilir.
   6. 0.7x PBS ile 50 mL konik tüpe doldurun.
      Not: PBS döngü ve axolotl salınmasını önlemek için kullanılacaktır.
   7. Perfüzyon borusunun çıkış ucuna 27 ayarlı kelebek iğne takın. Kelime kanatlarını birbirine katlayın ve kelepçe standına yerleştirin.
   8. 0.7x PBS ile dolu 50 mL konik tüp içine perfüzyon tüpünün serbest ucunu yerleştirin ve tüm tüp çözelti dolana kadar perfüzyon pompası çalıştırın. Tüm hortum PBS ile doldurulduktan sonra pompayı duraklatın.
      Not: Tüpün daima hava kabarcığı olmadığından emin olun, aksi takdirde bunlar aksolotlun içindeki hava embolisine neden olur ve tam perfüzyonu önler.
   9. Polistren köpük çerçevesindeki aksolot şeklindeki kalıba bir kağıt havlu yerleştirin. Bir transfer pipeti kullanarak havluyu tricaine solüsyonuyla ıslatın.
      Not: Kağıt çekirken ortasında küçük bir kareyi kesinPerfüzyon prosedürü sırasında sıvıların drenajına izin vermek için.
   10. Polestiren köpük çerçevenin içindeki kağıt havlu üzerine anestezi altındaki axolotl yatağını yerleştirin.

2. Axolotl Göğüsün Açılması

1. Cerrahi forseps kullanarak cildi, omuzların çizgisinin hemen altındaki aksolot göğsünün merkez ekseni boyunca tutturun. Çekilin.
2. Derinin çekildiği küçük bir kesi yapmak için bir neşter kullanın.
3. İki kıkırdak tablası ortaya çıkarmak için göğüs üzerinde bir kare deri parçasını çıkarın.
   1. Kalbi açıkça görebilmek için yeterince büyük olan ve kalpten ayrılan yaklaşık 5 mm aorta göğüs boşluğunun üzerinde bir pencere açmak için cildi çıkarın.
4. Büyük kan damarlarının kesilmesini önlemek için bağ dokusunu forseps veya kapalı makas kullanarak dikkatlice yırtın.
5. Her bir kıkırdak tablasını forseps kullanarak tek tek kaldırın ve onlarıCerrahi makasla
6. Dikkatle forseps ile perikard tutun, çekin ve cerrahi makas kullanarak delin; Bu kesik çok ince perikardı delmek için yeterince derin olmalıdır ve perikardın çıkarılmasına izin verecek kadar büyük olmalıdır. Kalbi kesmemeye özen gösterin.
7. Kalbi ve aortu ortaya çıkarmak için dikkatlice perikardı çıkarın.
   Not: Bir transfer pipeti kullanarak, periyodik olarak bölgeyi açık tutmak ve aksolotu anestezi altında tutmak için göğüs boşluğunu ve solungaçları tricaine solüsyonuyla yıkayın.

3. Axolotl'ın perfüzyonu

1. Yüklü kelebek iğne ile kelepçe standını polistiren köpük çerçevesinin yanına yerleştirin, böylece kelepçenin kolu iğneyi aksolotlu aortaya sokmak için kolaylıkla manipüle edilebilir. Ekleme esnasında iğnenin ucunu hayvanın rostral yönüne doğru tutun ve iğne boyunca delmeden kaçınmak için iğneyi aorta paralel tutunPosite tarafı.
2. Peristaltik pompayı açın. 0.7x PBS borudan akmaya devam etmelidir.
3. İğneyi aorta yerleştirin.
   1. Forsepsi aortik kemerin altına kaydırın ve kolay erişmek için hafifçe yukarı çekin.
   2. İğne kelepçesi kombinasyonunu, iğnenin aortun uzunluğu boyunca kafaya doğru ilerlediği şekilde manevra edin. Aortun arkasındaki destek için forseps kullanırken iğneyi yerleştirin.
      Not: İğne, perfüzyon sırasında kaymayacağından emin olmak için aortun içine yeterince derin yerleştirilmelidir. Bu, 15 cm'lik bir aksolot için yaklaşık 5 mm olabilir. Geminin tam delinmesini önlemek için iğnenin aort ile tam uyumlu olduğundan emin olun. Through-and-through delikleri büyük kanamalara neden olabilir ve perfüzyon başarı oranlarını düşürebilir. Başarılı yerleştirme, kalbin atriyumunun görünür biçimde genişlemesi ile teyit edilebilir.
4. Bilimlerle bir atriyumu çabucak yaralayınSsors ve kan tahliye etmesine izin ver.
   1. Göğüs boşluğunda kan birikimi ve pıhtı oluşumunu önlemek için tricaine solüsyonu ile yıkayın.
5. Aksolotiyi yaklaşık 20-30 mL PBS ile boşaltın. Hayvan, başarılı bir perfüzyonda açık pembeden beyaza beyaza dönüşmelidir.
6. Peristaltik pompayı duraklatın ve borunun serbest ucunu 15 mL DiI çözeltisindeki tüpün içine alın. Pompayı yeniden başlatın, hortumda hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat edin.
7. Aksolot'u DiI'nin tüm çalışma stokuyla arıtın.
   Not: Başarılı bir perfüzyonda, aksolotl DiI'nin parlak pembe renge dönüşür. Solungaçlarda bu en belirgin olacaktır.
8. DiI ile perfüzyon tamamlandıktan sonra pompayı duraklatın ve dokuyu düzeltmek için hortumun serbest ucunu% 4 Paraformaldehit (PFA) çözeltisi içine yerleştirin. Pompayı yeniden başlatın ve en az 10 mL PFA'yı perfüze edin.
   Dikkat: PFA toksiktir ve ele alınmalı ve kullanılmamalıdır.Uygun bir şekilde sed. Eldiven ve koruyucu gözlük takılmalı ve çözümler bir davlumbazın içinde yapılmalıdır. Doku düzeltmek için aksolotlun PFA ile perfüzyonu hayvanın ölümüyle sonuçlanır.

4. Perfüzyonun ve Görselleştirme Hazırlığının Sona Erdirilmesi

1. Peristaltik pompayı durdurun ve iğneyi aksolotlu aortadan çıkarın.
2. Aksolot'u plastik bir plakaya yerleştirin.
   Not: Büyük bir Petri kabının yarısını kullanmanız iyi bir sonuçtur ve cildini ıslak tutmak ve görselleştirme kalitesini iyileştirmek için küçük miktarda Tricaine veya PBS'yi axolotl üzerine dökmeye izin verir.
3. Kullanılmış tüm malzemeleri uygun çöp bidonlarına atın. % 70 etanol ile cerrahi aletleri temizleyin, hayvanlar arasında cam boncuk sterilizatör kullanarak dezenfekte edin ve prosedürü izleyen otoklavla sterilize edin. Boruyu PBS çözeltisiyle yıkayın ve daha sonra boşaltın, tamamen kurutun ve daha ileri bir kullanım için saklayın.

5. Perfused Axolotl'ın görselleştirilmesi

1. Aksolotl'u floresan bir konfokal mikroskop altında yerleştirin.
2. Işıkla DiI lekeli kapların görselleştirilmesi engellendiği için ışıkları kapatın.
3. Aksolotlun vaskülatürünü görselleştirmek için konfokal mikroskop ile yeşil bir fluoresans emisyon filtresi küpü ( örn. ET-CY3) kullanın. 545 nm dalga boyundaki uyarılma ışığını kullanın.
   Not: Yüksek kaliteli bir görüntü elde etmek için aşağıdaki parametreler kullanılabilir: 1.1 s için pozlama, 1 kat artışı, 1.0 doygunluk, 2X büyütme.

Sonuçlar

DiI boyama ile, aksolotlu damar sistemi kolaylıkla görselleştirilebilir. Lipofilik boya ile perfüze edilen hayvanların kan damarları flüoresan konfokal mikroskop altında hemen görülebilir. Şekil 1..1-1.5 , perfüzyon protokolünün şematik bir temsilidir. Parlak pembe boya ile perfüzyon yapıldıktan sonra, başarılı bir şekilde akıtılmış bir aksolotl pembe görünür. Konfokal mikroskopta yeşil bir fluoresan filtr...

Tartışmalar

Aksolotlun vaskülatürünün görselleştirilmesi lipofilik karbosiyanin boyası DiI ile perfüzyon yoluyla başarıyla başarılabilir. Bu çalışmada, bir peristaltik pompa kullanarak diolotl'in diI ile perfüzyonu için yeni bir protokol açıklanmaktadır. Ayrıca bir floresan konfokal mikroskop kullanarak axolotl damar sisteminin daha sonraki görselleştirmesini gösteririz. Bu protokol, Li ve ark.'ında görülen kemirgen DiI perfüzyon protokolünün bir uyarlamasıydı .

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic Pump	Marshall Scientific	RD-RP1
Perfusion tubing	Excelon Lab & Vacuum Tubing	436901705	size S1A
27g butterfly needle	EXELint Medical Products	26709
NaCl	AmericanBio	7647-14-5
KCl	AmericanBio	7747-40-7
Na2HPO4	AmericanBio	7558-79-4
NaH2PO4	AmericanBio	10049-21-5
Distilled water
HCl	AmericanBio	7647-01-0
Glucose	ThermoFischer	A2494001
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	468495
Ethanol (100% vol/vol)	Sigma Aldrich	64-17-5
Surgical foreceps	Medline	MDG0748741
Polystyrene foam frame			any polystyrene foam square with an axolotl-shaped  cut out
Surgical scissors	Medline	DYND04025
Scalpel	Medline	MDS15210
Absorbent underpad	Avacare Medical	PKUFSx
Paper towels
Standard disposable transfer pipette	Fisherbrand	50216954
Clamp stand	Adafruit	291
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma Aldrich	E10521	Tricaine powder
Adult axolotl
MgSO4	AmericanBio	10034-99-8
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016-100G
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761-500G
Plastic tanks			Varying size appropriate for the axolotl
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	30525-89-4
Axolotl
Leica Microscope	Leica	M165 FC
ET-CY3 Fluorescent Filter	Leica	M205FA/M165FC
MS-222