A perfusão DiI como método de visualização vascular em<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Resumo

Utilizando uma técnica de coloração de perclorato de diisoxifenil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina lipofílica (DiI) lipofílica, o Ambystoma mexicanum pode sofrer perfusão vascular para permitir uma fácil visualização da vasculatura.

Resumo

As técnicas de perfusão têm sido utilizadas há séculos para visualizar a circulação de tecidos. Axolotl (Ambystoma mexicanum) é uma espécie de salamandra que emergiu como um modelo essencial para estudos de regeneração. Pouco se sabe sobre como a revascularização ocorre no contexto da regeneração nesses animais. Aqui, relatamos um método simples para a visualização da vasculatura no axolotl através da perfusão de perclorato de 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocyanina (DiI). DiI é um corante de carbocyanina lipofílico que se insere instantaneamente na membrana plasmática de células endoteliais. A perfusão é feita usando uma bomba peristáltica, de modo que a DiI entre na circulação através da aorta. Durante a perfusão, o corante flui através dos vasos sanguíneos do axolotl e incorpora na bicamada lipídica das células endoteliais vasculares após o contato. O procedimento de perfusão leva aproximadamente uma hora para um axolotl de oito polegadas. Imediatamente após a perfusãoDiI, o axolotl pode ser visualizado com um microscópio fluorescente confocal. O DiI emite luz no intervalo vermelho-laranja quando excitado com um filtro fluorescente verde. Este procedimento de perfusão DiI pode ser usado para visualizar a estrutura vascular de axolotls ou para demonstrar padrões de revascularização em tecidos regeneradores.

Introdução

A visualização da vasculatura desempenha um papel vital na compreensão da estrutura e função dos organismos em muitas espécies. A partir do ^século 16 com Leonardo da Vinci, foram estudados modelos e representações gráficas da circulação ¹ . Usando ceras e moldes de borracha, os tecidos foram perfundidos para criar modelos tridimensionais da vasculatura, o que permitiu o estudo de organogênese e patogênese ^{1 , 2} . As resinas e as ceras foram coloridas com corantes, tais como a tinta da Índia ou vermelho carmin para permitir a sua fácil visualização ^{1 , 2} . No entanto, essas técnicas causaram muitas questões porque suas altas viscosidades impediram a perfusão total do tecido de interesse ¹ . À medida que o campo se tornou mais sofisticado, o uso de microscópios confocais e eletrônicos entrou em jogo, movendo a tecnologia de perfusão Longe dos moldes de fundição e para as perfusões líquidas da vasculatura, algumas das quais permitiram a perfusão e imagem de vasos sanguíneos sem destruir o tecido inicial ³ . DiI, um corante de carbocyanina fluorescente, é uma mancha que permite a perfusão de animais sem danos no tecido vascular.

Os corantes de carbocyanina são corantes lipofílicos que incorporam nas membranas celulares após contato. Estes corantes permitem uma coloração fácil e instantânea de células endoteliais vasculares, que podem então ser vistas sob um microscópio confocal fluorescente. DiI move-se através da difusão lateral na membrana lipídica das células, como mostrado na rotulagem e rastreamento dos neurônios ⁴ . Quimicamente, as duas cadeias de alquilo de DiI dão ao corante sua alta afinidade para as membranas celulares, enquanto dois anéis conjugados a partir de um fluorochrome que é responsável por emitir um comprimento de onda vermelho quando excitado por filtros de luz verde fluorescente> 4. O DiI tem sido utilizado em muitas capacidades, incluindo rotulagem bem sucedida da membrana plasmática e rotulagem anterógrada e retrógrada nos neurônios ^{5 , 6} . DiI já foi usado em protocolos de perfusão ao visualizar a vasculatura de camundongos ⁷ .

Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) são salamandras que vivem exclusivamente em lagos saloquiais perto da Cidade do México, no México. Esses animais tornaram-se um modelo importante para a compreensão dos processos regenerativos, pois eles podem regenerar membros completos, cauda (incluindo corda nervosa), porções do coração e outros órgãos internos e partes do olho como adultos ^{8 , 9} . Além disso, com a recente aplicação de ferramentas genéticas em axolotls, uma visão sem precedentes das moléculas e células que conduzem esses processos agora é possível ⁸ . O regene de sucessoA ração de um membro inteiro requer um extenso processo de revascularização, que pode desempenhar um papel significativo na regeneração, além das simples funções tradicionais dos vasos sanguíneos no fornecimento de oxigênio e nutrientes. Compreender a revascularização no contexto da regeneração tecidual é imperativo. Os vasos sanguíneos de Axolotl foram previamente visualizados usando a tinta da Índia, e enquanto os resultados eram intrigantes, esse processo não foi revisitado nas décadas subseqüentes ¹⁰ . Buscamos adaptar um protocolo de perfusão DiI desenvolvido para uso em mamíferos para permitir uma perfusão completa e visualização da vasculatura axolotl ⁷ . Este protocolo descreve as etapas tomadas para perfurar com êxito e, posteriormente, visualizar a circulação axolotl com uma técnica de coloração DiI. Este procedimento permitirá uma visualização precisa dos vasos sanguíneos de patentes nos tecidos homeostáticos, bem como nos tecidos regeneradores e fornece um novo método de visualizaçãoN e análise do processo de revascularização no axolotl.

Protocolo

Toda experimentação axolotl foi realizada de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Brigham and Women's Hospital (BWH).

1. Configurar Experiência de Perfusão

1. Coloque um axolotl adulto em um recipiente de plástico preenchido com 0,1% de solução de tricaína (MS222) por 15-20 min ou até completamente anestesiado. Certifique-se de que o recipiente esteja cheio de solução de tricaína suficiente, de modo que o axolotl esteja completamente submerso.
   Nota: Todos os procedimentos devem ser realizados de acordo com as diretrizes institucionais de cuidados com animais. Na BWH, um axolotl é considerado totalmente anestesiado quando falha em um teste de puxar os pés, o que significa que não há movimento reflexivo quando o pé é suavemente espremido.
   Atenção: Embora a tricaína seja um anestésico especificamente utilizado para organismos aquáticos, o contato direto com a pele com a solução de tricaína deve ser evitado.
2. Configure a estação de perfusão axolotl.
   1. Coloque oAlmofada absorvente em uma superfície plana e nivelada com o lado absorvente voltado para cima.
   2. Corte um furo na estrutura de espuma de poliestireno que é o tamanho e a forma apropriados para que o axolotl anestesiado se apresente na posição supina. Coloque o quadro na almofada absorvente.
      Nota: algumas toalhas de papel adicionais podem ser colocadas imediatamente sob o quadro para absorção adicional.
   3. Carregue a bomba peristáltica com o tubo de perfusão. Ajuste a bomba para um caudal de 0,7 ml / min, fluindo no sentido horário.
   4. Faça a solução diluída com 0,7x de PBS e 5% de glicose numa mistura de 1: 4.
   5. Misture 10 mL de solução diluente com 200 μL da solução de reserva DiI em um tubo cônico de 50 mL. Cap e misture por inversão. Cubra este tubo com papel de alumínio para proteger a solução de trabalho da exposição à luz.
      Nota: Os volumes devem ser alterados de acordo com o tamanho do axolotl proporcionalmente. Estes valores são para um axolotl de aproximadamente 15 cm (comprimento do focinho até a cauda). UMANimais deste tamanho podem não ter atingido a maturidade sexual completa, de modo que o sexo animal não pode ser determinado no momento.
   6. Encha um tubo cônico de 50 mL com PBS 0,7x.
      Nota: PBS será usado para iniciar o loop e a exsanguinação axolotl.
   7. Anexe a agulha de borboleta de calibre 27 até a extremidade de saída da tubulação de perfusão. Dobre as asas de borboleta uma sobre a outra e coloque no suporte de braçadeira.
   8. Coloque a extremidade livre do tubo de perfusão no tubo cônico de 50 mL preenchido com 0,7x PBS e execute a bomba de perfusão até que a tubagem inteira seja preenchida com solução. Pausar a bomba uma vez que a tubagem inteira é preenchida com PBS.
      Nota: Certifique-se de que a tubagem está livre de bolhas de ar em todos os momentos, pois isso irá causar embolia de ar no axolotl e evitar a perfusão total.
   9. Coloque uma toalha de papel no molde em forma de axolotl na armação de espuma de poliestireno. Usando uma pipeta de transferência, remova a toalha com solução tricaína.
      Nota: Corte um pequeno quadrado no meio do reboque de papelPara permitir a drenagem de fluidos durante o procedimento de perfusão.
   10. Coloque o axolotl anestesiado supino sobre a toalha de papel dentro do quadro de espuma de poliestireno.

2. Abertura do Cofre Axolotl

1. Use fórceps cirúrgicos para beliscar a pele ao longo do eixo central do cofre do axolotl, logo abaixo da linha dos ombros. Puxar para cima.
2. Use um bisturi para fazer uma pequena incisão onde a pele foi puxada.
3. Remova um remendo quadrado de pele sobre o tórax para revelar duas placas de cartilagem.
   1. Remova a pele para abrir uma janela sobre a cavidade torácica grande o suficiente para ver claramente o coração e aproximadamente 5 mm da aorta se ramificando do coração.
4. Rasgue cuidadosamente o tecido conjuntivo usando fórceps ou tesoura fechada para evitar o corte de vasos sanguíneos maiores.
5. Levar cada placa de cartilagem individualmente usando a pinça e consumá-lasCom as tesouras cirúrgicas.
6. Aperte cuidadosamente o pericárdio com a pinça, puxe-o e perfure-o usando as tesouras cirúrgicas; Esta incisão deve ser apenas profunda o suficiente para perfurar o pericárdio muito fino e deve ser grande o suficiente para permitir a remoção do pericárdio. Tenha cuidado para não cortar o coração.
7. Retire delicadamente o pericárdio para expor o coração e a aorta.
   Nota: Usando uma pipeta de transferência, escove periodicamente a cavidade torácica e as brânquias com solução tricaína para manter a área limpa e mantenha o axolotl anestesiado.

3. Perfusão do Axolotl

1. Coloque o suporte de braçadeira com a agulha de borboleta carregada ao lado do quadro de espuma de poliestireno, de modo que o braço da braçadeira possa ser facilmente manipulado para inserir a agulha na aorta axolotl. Aponte a ponta da agulha em direção ao aspecto rostral do animal durante a inserção e mantenha a agulha paralela à aorta para evitar perfurá-la através da opLado positivo.
2. Ligue a bomba peristáltica. 0.7x PBS deve continuar a fluir através da tubulação.
3. Insira a agulha na aorta.
   1. Deslize a pinça sob o arco aórtico e puxe ligeiramente para permitir um fácil acesso.
   2. Manobra a combinação da agulha-agulha de modo que a agulha percorre o comprimento da aorta, apontando para a cabeça. Insira a agulha enquanto usa a pinça para apoio por trás da aorta.
      Nota: A agulha deve ser inserida profundamente o suficiente na aorta para garantir que ela não escorregue durante a perfusão. Isso pode ser de cerca de 5 mm para um axolotl de 15 cm. Certifique-se de que a agulha esteja perfeitamente em linha com a aorta para evitar a perfuração completa do vaso. As perfurações através e passagem podem causar hemorragia maciça e diminuir as taxas de sucesso de perfusão. A inserção bem sucedida pode ser confirmada pelo aumento visível das auroras do coração.
4. Rapidamente lacerar um átrio com a ciênciaSsors e deixe o sangue escorrer.
   1. Lavar com solução de tricaína para prevenir o acúmulo de sangue e formação de coágulos na cavidade torácica.
5. Perfogue o axolotl com cerca de 20-30 mL de PBS. O animal deve mudar de cor rosa claro para branco em uma perfusão bem sucedida.
6. Pausar a bomba peristáltica e mover a extremidade livre da tubulação para o tubo de 15 ml da solução DiI. Reinicie a bomba, tome cuidado para evitar a criação de bolhas de ar na tubulação.
7. Perfogue o axolotl com todo o estoque de trabalho da DiI.
   Nota: Em uma perfusão bem sucedida, o axolotl com cor de mudança para o rosa brilhante do DiI. Isso será mais notável nas brânquias.
8. Pausar a bomba após a perfusão com DiI é completa e colocar a extremidade livre da tubulação em solução de Paraformaldeído a 4% (PFA) para consertar o tecido. Reinicie a bomba e perfuse pelo menos 10 mL de PFA.
   Atenção: o PFA é tóxico e deve ser tratado e dispoSed de forma apropriada. Devem ser usadas luvas e óculos de segurança, e as soluções devem ser feitas dentro de uma exaustão. A perfusão do axolotl com PFA para consertar o tecido resulta na morte do animal.

4. Finalização da Preparação de Perfusão e Visualização

1. Pare a bomba peristáltica e remova a agulha da aorta axolotl.
2. Coloque o axolotl em uma placa de plástico.
   Nota: usar uma metade de uma grande placa de Petri funciona bem e permite derramar uma pequena quantidade de Tricaine ou PBS no axolotl para manter sua pele molhada e melhorar a qualidade da visualização.
3. Descarte todos os materiais usados ​​nas lixeiras apropriadas. Limpe as ferramentas cirúrgicas com etanol a 70%, desinfeteie usando um esterilizador de grânulos de vidro entre animais e esterilize-se por autoclave seguindo o procedimento. Elimine a tubulação com a solução PBS e, em seguida, drene, seque completamente e guarde para uso posterior.

5. Visualização do Axolotl Perfido

1. Coloque o axolotl sob um microscópio confocal fluorescente.
2. Desligue as luzes quando a visualização dos vasos manchados com DiI é impedida pela luz.
3. Use um cubo verde de filtro de emissão de fluorescência ( eg ET-CY3) com o microscópio confocal para visualizar a vasculatura do axolotl. Use a luz de excitação do comprimento de onda 545 nm.
   Nota: Para obter uma imagem de alta qualidade, os seguintes parâmetros podem ser usados: exposição para 1.1 s, ganho de 1x, saturação de 1.0, ampliação de 2X.

Resultados

Com a coloração DiI, a vasculatura do axolotl pode ser facilmente visualizada. Os vasos sanguíneos de animais perfundidos com o corante lipofílico são imediatamente visíveis sob um microscópio confocal fluorescente. A Figura 1 .1-1.5 é uma representação esquemática do protocolo de perfusão. Após a perfusão com o corante rosa brilhante, um axolotl perfundido com sucesso aparecerá rosa. Usando um filtro fluorescente verde ...

Discussão

A visualização da vasculatura do axolotl pode ser realizada com sucesso através da perfusão com o corante de carbocyanina lipofílico, DiI. Neste estudo, descrevemos um novo protocolo para a perfusão do axolotl com DiI usando uma bomba peristáltica. Mostramos também a subsequente visualização da vasculatura axolotl utilizando um microscópio confocal fluorescente. Este protocolo foi uma adaptação do protocolo de perfusão Dii de roedores visto em Li et al. ⁷ , no entanto, as p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic Pump	Marshall Scientific	RD-RP1
Perfusion tubing	Excelon Lab & Vacuum Tubing	436901705	size S1A
27g butterfly needle	EXELint Medical Products	26709
NaCl	AmericanBio	7647-14-5
KCl	AmericanBio	7747-40-7
Na2HPO4	AmericanBio	7558-79-4
NaH2PO4	AmericanBio	10049-21-5
Distilled water
HCl	AmericanBio	7647-01-0
Glucose	ThermoFischer	A2494001
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	468495
Ethanol (100% vol/vol)	Sigma Aldrich	64-17-5
Surgical foreceps	Medline	MDG0748741
Polystyrene foam frame			any polystyrene foam square with an axolotl-shaped  cut out
Surgical scissors	Medline	DYND04025
Scalpel	Medline	MDS15210
Absorbent underpad	Avacare Medical	PKUFSx
Paper towels
Standard disposable transfer pipette	Fisherbrand	50216954
Clamp stand	Adafruit	291
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma Aldrich	E10521	Tricaine powder
Adult axolotl
MgSO4	AmericanBio	10034-99-8
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016-100G
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761-500G
Plastic tanks			Varying size appropriate for the axolotl
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	30525-89-4
Axolotl
Leica Microscope	Leica	M165 FC
ET-CY3 Fluorescent Filter	Leica	M205FA/M165FC
MS-222