في المختبر بلمرة الأكتين و في وقت مبكر اندوسوميس

Summary

مهام دخلول المبكر تعتمد على بلمرة الأكتين و. هنا، يمكننا وصف القائم على الفحص المجهري في المختبر مقايسة التي ريكونستيتوتيس على التنو وبلمره الأكتين و على الأغشية اندوسومال المبكر في أنابيب الاختبار، مما يجعل هذه سلسلة معقدة من التفاعلات قابلة للكيمياء الحيوية والوراثية التلاعب.

Abstract

العديد من الدالات دخلول المبكر، لا سيما البضائع البروتين الفرز والغشاء تشوه، تعتمد على بقع من خيوط الأكتين و القصيرة المنبسطة على الغشاء اندوسومال. وقد أنشأنا المستندة إلى الفحص المجهري في المختبر مقايسة التي ريكونستيتوتيس على التنو وبلمره الأكتين و على الأغشية اندوسومال المبكر في أنابيب الاختبار، مما يجعل هذه سلسلة معقدة من التفاعلات قابلة الوراثية والبيوكيميائية التلاعب. الكسور اندوسومال يعدها التعويم في التدرجات السكروز من الخلايا معربا عن البروتين اندوسومال المبكر RAB5 التجارة والنقل. وتعد كسور سيتوسوليك من مجموعات منفصلة من الخلايا. اندوسومال والكسور سيتوسوليك يمكن تخزينها مجمدة في النتروجين السائل، إذا لزم الأمر. في التحليل، تختلط اندوسومال والكسور سيتوسوليك، وهي المحتضنة المخلوط في 37 درجة مئوية تحت الظروف الملائمة (مثلاً، الأيونية القوام، الحد من البيئة). في الوقت المطلوب، الخليط رد الفعل هو ثابت، وهو كشف والاكتين مع فالويدين. ثم يتم تحليل التنو أكتين والبلمره بالفحص المجهري الأسفار. هنا، نحن التقرير أنه يمكن استخدام هذا الفحص للتحقيق في دور العوامل التي تشارك أما في نويات أكتين على الغشاء، أو في استطالة اللاحقة، التفريع، أو كروسلينكينج من خيوط الأكتين و.

Introduction

في الخلايا حقيقية النواة أعلى، يتم استيعاب البروتينات والدهون في اندوسوميس المبكرة التي يحدث فيها الفرز. بعض البروتينات والدهون، التي تتجه إلى أن تكون تستخدم، يتم دمج المناطق أنبوبي من اندوسوميس المبكر وثم تنقل إلى غشاء البلازما أو غولجي عبر الشبكة (TGN)^1،2. على النقيض من ذلك، البروتينات والدهون الأخرى يتم تعبئتها بشكل انتقائي في مناطق اندوسوميس المبكر الذي يحمل مظهر مولتيفيسيكولار. توسيع هذه المناطق، ولدى مفرزة من أوائل اندوسومال الأغشية، ناضجة في نهاية المطاف إلى حويصلات الناقل اندوسومال الحرة أو الهيئات مولتيفيسيكولار (التحويل الرأسي الخارجي/مفبس)، التي هي المسؤولة عن نقل البضائع نحو أواخر اندوسوميس^{1، 2}.

أكتين يلعب دوراً حاسما في عملية يعيد غشاء المرتبطة بقدرة الفرز اندوسومال ونشوء حيوي دخلول. الفرز على طول مسارات إعادة التدوير لغشاء البلازما أو TGN البروتين يعتمد على ريترومير المعقدة والبروتينات المرتبطة بها. هذه الآلية الفرز ويبدو أن تكون مقترنة بتشكيل الأنابيب إعادة التدوير عن طريق تفاعلات ريترومير المعقدة، مع دبور وندبة المناظرة (غسل) أكتين المعقدة وتشعبت^3،4،5 . على النقيض من ذلك، جزيئات متجهة إلى التدهور، لا سيما تنشيط مستقبلات الإشارات، يتم فرز في الحويصلات intraluminal (إيلفس) من اندوسومال الفرز مجمعات المطلوبة للنقل (اسكرت)^{2،6، 7}. واو-أكتين بينما لا يعرف الدور المحتمل أكتين في عملية الفرز المعتمدة على اسكرت، يلعب دوراً مهما في نشوء حيوي للتحويل الرأسي الخارجي/مفبس والنقل خارج اندوسوميس المبكر. على وجه الخصوص، وجدنا أن أنيكسين A2 يربط المناطق الغنية بالكوليسترول دخلول المبكر، وجنبا إلى جنب مع spire1، نوكليتيس بلمرة الأكتين و. ويتطلب تشكيل شبكة أكتين تشعبت يحتفل في اندوسوميس النشاط المتفرعة من البروتين المتصلة أكتين (ARP) 2/3 معقدة، فضلا عن موسين البروتين ERM والبروتين ملزمة أكتين كورتاكتين^8،9.

هنا، يمكننا وصف القائم على الفحص المجهري في المختبر مقايسة التي ريكونستيتوتيس التنو وبلمره الأكتين و على الأغشية اندوسومال المبكر في أنابيب الاختبار. وقد استخدمت هذه المقايسة سابقا للتحقيق في دور أنيكسين A2 في نويات واكتين وموسين وكورتاكتين في تشكيل اندوسومال أكتين شبكات^8،9. بهذا البروتوكول في المختبر ، سلسلة معقدة من التفاعلات التي تحدث في اندوسوميس أثناء بلمرة الأكتين تصبح قابلة لتحليل الكيمياء الحيوية والجزيئية لخطوات متسلسلة من هذه العملية، بما في ذلك التنو أكتين، الخطي بلمرة والمتفرعة، وكروسلينكينج.

Protocol

1-الحلول والأعمال التحضيرية

ملاحظة: ينبغي إعداد كافة المخازن المؤقتة والحلول في المقطر مزدوجة (دد) H ₂ o. نظراً لحالة ترطيب السكروز ويختلف تركيز جميع السكروز الحلول النهائية يجب أن تحدد استخدام إنكسار.

1. تحضير فوسفات مخزنة المالحة دون divalent الكاتيونات (برنامج تلفزيوني-): 137 مم ناجي، 2.7 مم بوكل، 1.5 مم خ ₂ ص ₄، ومم 6.5 غ ₂ هبو ₄. قم بضبط ال pH إلى 7.4. تعقيم بالتعقيم (1 دورة في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة) وتخزينها في درجة حرارة الغرفة-
2. إعداد الأوراق المالية حل ايميدازول 300 ملم: 0.204 ز ايميدازول في 10 مل من O.Adjust pH إلى 7.4 في 4 درجات مئوية باستخدام تعقيم HCl. تصفية باستخدام 0.22 ميكرومتر المسامية تصفية الحجم وتخزينها في 4 ddH ₂ درجة مئوية.
3. التجانس إعداد المخزن المؤقت (غبطة؛ إعداد حوالي 100 مل): السكروز 250 ملم في ايميدازول 3 مم. قم بضبط ال pH إلى 7.4 في 4 درجات مئوية باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. تعقيم عامل تصفية باستخدام عامل تصفية حجم 0.22 ميكرومتر المسامية وتخزينها في 4 ° تكملة جيم غبطة فقط قبل الاستخدام مع مزيج مثبطات البروتياز في تركيزات النهائي الموافق 10 مم ليوبيبتين وألف بيبستاتين 1 ملم 10 نانوغرام/مل أبروتينين.
4. للتدرجات التعويم خطوة، تعد 62%، 39%، وحلول السكروز 35% في ايميدازول 3 مم، الرقم الهيدروجيني 7.4، كما هو موضح أدناه. تحدد دقة تركيز جميع حلول السكروز باستخدام إنكسار النهائية-
   1. إعداد 100 مل من محلول السكروز 62% في ايميدازول 3 مم، الرقم الهيدروجيني 7.4. تذوب بإثارة ز 80.4 السكروز في ddH ₂ س قبل تسخينها إلى 35 ° جيم إضافة 1 مل من 300 ملم ايميدازول حل الأسهم والتعبئة إلى 100 مل مع ضبط O. ddH ₂ pH إلى 7.4 في 4 ° تعقيم جيم عامل تصفية باستخدام تصفية حجم المسام ميكرومتر ومخزن 0.22 في 4 درجات مئوية.
   إعداد
   2. 100 مل محلول السكروز 35% في ايميدازول 3 مم، الرقم الهيدروجيني 7.4. حل من خلال إثارة ز 40.6 السكروز في ddH ₂ o. أضف 1 مل من محلول الأسهم ايميدازول 300 ملم وملء إلى 100 مل مع ضبط O. ddH ₂ pH إلى 7.4 في استخدام درجة تعقيم تصفية جيم 4 0.22 ميكرومتر المسامية تصفية الحجم وتخزينها في 4 ° C.
   3. إعداد 50 مل سكروز 39% في ايميدازول 3 مم، الرقم الهيدروجيني 7.4. تمييع محلول السكروز 62% مع محلول السكروز 35%. مخزن في 4 درجات مئوية.
5. حل الجيل الثالث 3g بارافورمالدهيد (PFA) بالتحريك في 100 مل من برنامج تلفزيوني-قبل وارميد إلى 60 درجة مئوية مع إضافة 1 م هيدروكسيد الصوديوم dropwise؛ وضبط الأس الهيدروجيني النهائي إلى 7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. تعقيم عامل تصفية باستخدام عامل تصفية حجم 0.22 ميكرومتر المسامية وتخزينها في-20 درجة مئوية.
   تنبيه: 3% منهاج عمل بيجين كاشف سامة.
6. حل "بوكل م 1 إعداد" المخزون. حل ز 3.73 من بوكل بالتحريك في 50 مل من ddH ₂ تعقيم O. عامل تصفية باستخدام عامل تصفية حجم 0.22 ميكرومتر المسامية وتخزينها في درجة حرارة الغرفة-
7. تحضير 50 س تتركز الأسهم محلول يحتوي على 0.625 "حبيس م" على درجة الحموضة 7.0 و 75 مم مجواك ₂ في ddH ₂ قاسمة سين ومخزن في-20 درجة مئوية.
8. إعداد متزايدة المتوسطة. مزيج من إثارة ز 2.4 من poly(vinyl alcohol) م _ث ~ 31,000 (PVA) مع ز 6 من الجلسرين. إضافة 6 مل من ddH ₂ س وترك على الأقل 2 ح في درجة حرارة الغرفة. إضافة 12 مل 0.2 M تريس-Cl (pH 8.5) والحرارة إلى حوالي 53 درجة مئوية مع إثارة العرضية حتى قد حلت بولي-
9. توضيح الحل باستخدام الطرد المركزي في 5,000 س ز لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. جمع المادة طافية وإضافة 2.5% (w/v) 1، 4--ديازابيسيكلو--[2.2.2] أوكتان (دابكو) لمنع فوتوبليتشينج أثناء الكشف عن الأسفار. دوامة لحوالي 30 ثانية حل. اليكووت إلى 1.5 مل أنابيب بلاستيكية ومخزن في-20 درجة مئوية.

2. خلية ثقافة

1. خلايا "هيلا الثقافة" في دولبيكو ' s التعديل النسر المتوسطة وتستكمل مع مصل العجل الجنين 10 ٪، 10 ٪ الأحماض الأمينية غير الضرورية، 10% ل الجلوتامين، والبنسلين-ستربتوميسين 1%. الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية في 5% CO ₂ حاضنة.
2. ترانسفيكت الخلايا 24 ساعة قبل التجربة مع بروتينات فلورية خضراء-RAB5 ¹⁰، استخدام كاشف تعداء التجارية وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s-
3. عند الحاجة إليها، إعداد الكسور اندوسومال وسيتوسول من الخلايا المنضب بروتين الفائدة (أي، باستخدام [رني] أو كريسبر/Cas9) و/أو overexpressing نموذج wildtype أو المسخ من بروتين الفائدة.

3. إعداد جزء اندوسومال

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول مباشرة إعداد سوبسيلولار الكسور التي تحتوي على اندوسوميس والأغشية الخفيفة الأخرى. دخلول المنقي الكسور إذا لزم الأمر، يمكن أيضا أن تستخدم ¹¹. إعداد أطباق بيتري 2 (10-سم القطر الخارجي؛ 57 سم ²) خلايا المتلاقية معربا عن التجارة والنقل-RAB5 كابتداء من المواد. العدد الإجمالي لخلايا هيلا المتلاقية في أطباق بيتري 2 يقابل تقريبا 2.5 × 10 ⁷ الخلايا. عند الحاجة، اندوسوميس يمكن أيضا إعداد من الخلايا التي استنفدت من البروتين الفائدة (أي، باستخدام [رني] أو كريسبر/Cas9) و/أو overexpressing نموذج wildtype أو المسخ من بروتين الفائدة، ودائما الإعراب عن التجارة والنقل-RAB5-

تنبيه: ينبغي إجراء جميع الخطوات للبروتوكول تجزئة على مدت

1. وضع أطباق بيتري على لوحة معدنية رطب في دلو الجليد شقة ويغسل فورا الخلايا مرتين مع 5 مل من المثلج برنامج تلفزيوني--
إزالة كل برنامج تلفزيوني-من الغسيل آخر
2. وأضف 3 مل من برنامج تلفزيوني المثلج-كل طبق. لا ينبغي أن تجف الخلايا أثناء التعامل مع: إذا لزم الأمر، بوضع دلو الجليد على منصة هزاز تكون كافية لتغطية الخلايا بالسائل-
3. ميكانيكيا إزالة الخلايا في برنامج تلفزيوني من أطباق بيتري استخدام شرطي مطاطية مرنة (أي، مكشطة خلية محلية الصنع). كشط الخلايا خارج الأطباق أولاً في حركة دائرية، سريعة حول خارج الطبق، متبوعة حركة نحو انخفاض في منتصف الطبق. كشط برفق للحصول على " أوراق " الخلايا المرفقة. نقل الخلايا باستخدام ماصة باستور بلاستيك مع فتحه واسعة لأنبوب 15 مل البوليبروبيلين مخروطية في مدت بلطف
4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في العاشر 175 غ و 4 درجة مئوية.
5. برفق إزالة المادة طافية (SN) وإضافة 1-3 مل من خضاب الدم لبيليه. استخدام ماصة باستور بلاستيك مع فتح على نطاق واسع، بلطف "الماصة؛" صعودا وهبوطاً مرة واحدة ريسوسبيند الخلايا.
6. الطرد المركزي لمدة 7-10 دقيقة في 1,355 x ز و 4 ° "جيم بلطف" إزالة التعطيل.
7. إجراء تجانس الخلية.
   ملاحظة: شروط ينبغي لطيف حيث أن الأغشية البلازمية للخلايا مكسورة ولكن اندوسوميس تبقى على حالها.
   1. إضافة وحدة تخزين معروفة غبطة مع مثبطات البروتياز على كل خلية بيليه (حوالي 100 ميكروليتر كل خلية بيليه). استخدام ميكروبيبيتي 1,000-ميليلتر، بلطف "الماصة؛" صعودا وهبوطاً حتى يتم حراكه الخلايا. لا إدخال فقاعات الهواء-
   2. إعداد حقنه السلين 1 مل بإبرة ز 22 مشطوف مسبقاً بغبطة وخالية من الهواء أو الفقاعات.
   3. ملء المحاقن مع تعليق خلية ببطء نسبيا (لتجنب خلق فقاعات الهواء)، ووضع طرف مشطوف من الإبرة ضد جدار الأنبوبة، وطرد تعليق خلية سريعاً لقص إيقاف الأغشية البلازمية للخلايا المرفقة.
   4. قاسمة صغيرة من هوموجيناتي (حوالي 3 ميليلتر) وتمييع في 50 ميليلتر من خضاب الدم على شريحة زجاجية. مزيج، وتغطي مع ساترة زجاج. تفقد هوموجيناتي تحت مجهر على النقيض مرحلة مجهزة X 20 أو 40 س الهدف.
      ملاحظة: تحت الظروف المثلى، معظم خلايا مكسورة، لكن نوى، التي تظهر رمادي داكن وجولة الهياكل، ليست ( الشكل 1).
   5. تكرار الخطوة 3.7.3 و 3.7.4 حتى معظم خلايا مكسورة؛ وعادة، 3-6 ضربات صعودا ونزولاً عن طريق الإبرة ضرورية. الاحتفاظ قاسمة صغيرة (10-30 ميليلتر) من هوموجيناتي لتحديد البروتين.
8. هوموجيناتي الطرد المركزي لمدة 7 دقائق في 1,355 س ز و 4 درجة مئوية.
   ملاحظة: بعد الطرد المركزي، بيليه (يعرف بيليه النووية؛ NP) يحتوي على النواة والمادة طافية (ويعرف المادة طافية بوستنوكليار؛ السندات الإذنية) يتضمن في سيتوسول والعضيات الإفراج عند تجانس وفي تعليق مجاناً-
9. بعناية جمع السندات الإذنية. تبقى مختبرين الصغيرة (10-30 ميليلتر) سندات أذنيه والحزب الوطني لتحديد البروتين وتجاهل أرستها.
ضبط
10. السندات الإذنية إلى 40.6 في المائة السكروز بتمييع محلول السكروز 62 في المائة مع نسبة السكروز % PNS:62 1:1.1 باستخدام السندات الإذنية. المزيج بلطف ولكن دقة، دون خلق فقاعات الهواء. تحقق من تركيز السكروز باستخدام مقياس الانكسار.
11. وضع السندات الإذنية في السكروز 40.6 في المائة في الجزء السفلي من أنبوب تنبيذ فائق. تراكب بعناية مع 2.5 مل محلول السكروز 35% وملء الأنبوب الطرد المركزي بغبطة.
    ملاحظة: يجب أن تكون الطبقات حلول السكروز حيث تكون واجهات مرئية بوضوح-
12. Ultracentrifuge التدرجات ح 1 في فور وان سيكس فايف، 000 x ز و 4 درجة مئوية.
13. بعناية إزالة طبقة بيضاء من الدهون أعلى التدرج. بعد ذلك، جمع الواجهة التي تحتوي على اندوسوميس، بين غبطة والسكروز 35%، باستخدام ميكروبيبيتي 200 ميكروليتر مع تلميح قص.
    ملاحظة: الكسور اندوسومال يمكن استخدامها مباشرة في مقايسة بلمرة الأكتين في المختبر أو يمكن أن اليكووتيد على الجليد، فلاش المجمدة في النتروجين السائل، والمخزنة في-80 درجة مئوية.
14. تحديد تركيز البروتين الكسور السندات الإذنية واندوسومال-
    ملاحظة: هذا التركيز يجب أن يكون على الأقل 100 ميكروغرام/مل. ما يقرب من 2.5 × 10 ⁷ خلايا تزرع في أطباق بيتري 2 مطلوبة للحصول السندات أذنيه مع مالا يقل عن 100 ميكروغرام/مل (راجع ملاحظة أعلاه)-

4. إعداد سيتوسول

ملاحظة: أطباق "بيتري 2 إعداد" (قطرها 10 سم؛ 57 سم ²) خلايا هيلا المتلاقية كابتداء من المواد. عند الحاجة، يمكن أيضا إعداد في سيتوسول من الخلايا المنضب بروتين الفائدة (أي، باستخدام [رني] أو كريسبر/Cas9) و/أو أوفيريكسبريسينج wildtype أو النموذج المسخ من بروتين الفائدة. أما بالنسبة للبروتوكول تجزئة دخلول، ينبغي تنفيذ كافة الخطوات في مدت

1. كرر الخطوتين 3، 1-3، 8-
2. وضع السندات الإذنية في أنبوب الطرد المركزي وأولتراسينتريفوجي لمدة 45 دقيقة في فور تو فايف زيرو، 000 x ز و 4 درجة مئوية.
3. بعناية إزالة طبقة بيضاء في الأعلى وجمع SN (كسر سيتوسول) دون إزعاج بيليه ميكروسومي. الاحتفاظ قاسمة الكسر سيتوسول لتحديد البروتين.
   ملاحظة: يمكن استخدامها مباشرة في مقايسة بلمرة الأكتين في المختبر سيتوسول أو يمكن أن الكوتيد على الجليد، فلاش المجمدة في النتروجين السائل، والمخزنة في-80 درجة مئوية.
4. تحديد تركيز البروتين سيتوسول-
   ملاحظة: ينبغي أن يكون على الأقل 3 مغ/مل.

5. الاعتداء قياس دخلول-تعتمد على "بلمرة الأكتين" في المختبر

ملاحظة: يمكن أن يؤديها بلمرة الأكتين دخلول-تعتمد على استخدام النهج البديلة اثنين. في النهج الأول، المواد هي مختلطة في أنبوب اختبار وثابتة، ونقل إلى ساترة وتحليلها. في النهج الثاني، الموصوفة هنا، التحليل يمكن أن تنفذ مباشرة في دائرة التصوير ويمكن ثابتة وتحليلها دون اضطراب ميكانيكي ( الشكل 2). في هذا النهج الثاني، لا يتم نقل من أنبوب اختبار إلى ساترة الخليط المقايسة وهكذا يظل دونما قلاقل، تناقص خطر شبكات أكتين و يجري فعلياً بالقلق أثناء النقل. وبالإضافة إلى ذلك، هذا النهج الثاني متوافق مع تحليل الوقت الفاصل بين بلمرة الأكتين و. تجدر الإشارة إلى أنه لا يوجد فرق في تحليل البلمرة واكتين لوحظ مع أما النهج.
ملاحظة: استخدام قطع النصائح طوال البروتوكول.

1. في أنبوب اختبار
   1. بلطف المزيج المثلج المنقي بروتينات فلورية خضراء-RAB5 اندوسوميس (الخطوة 3) مع سيتوسول (الخطوة 4) بنسبة 01:10 (تركيز البروتين) في أنبوبة الاختبار مخروطية المثلج 1.5 مل.
      ملاحظة: تجربة نموذجية يتم الاضطلاع بحوالي 40-50 ميليلتر.
   2. ضبط الخليط المثلج الرد النهائي بتركيزات 125 ملم بوكل (باستخدام الحل الأسهم بوكل م 1) و 12.5 مم حبيس 1.5 مم مجواك ₂ (باستخدام 50 س الحل الأسهم). ثم، قم بضبط الخليط مع مثبطات البروتياز النهائي بتركيزات من 10 مم ليوبيبتين وبيبستاتين 1 مم أ 10 نانوغرام/مل أبروتينين. مزيج جميع المكونات بلطف.
   3. وضع أنبوبة الاختبار المحتوية على خليط رد فعل على 37 درجة مئوية، دون تهتز، واحتضان للوقت المطلوب-
      ملاحظة: بشكل عام، وسوف يستغرق حوالي 3 دقيقة للكشف عن بلمرة الأكتين على اندوسوميس و 30 دقيقة لتشكيل شبكة واسعة.
   4. في الوقت المطلوب (أي، 3 دقيقة أو 30 دقيقة)، ووقف رد الفعل بوضع أنبوبة الاختبار على الجليد وإضافة 1/10 (vol:vol) الحل منهاج العمل 3% بريكوليد-
   5. إضافة 0.3:10 (vol:vol) من 200 وحدة/مل (ميكرو ~6.6) فالويدين مترافق بالصبغ الأحمر-البرتقالي وصمة عار أكتين مبلمرة.
   6. ميكروليتر 12 مكان الخليط على 12 ميكروليتر من بولي تصاعد المتوسطة على شريحة زجاج الصغير. وضع كبار كوفيرسليبون زجاج ² مم 18 × 18-
   7. تحليل العينة مع [كنفوكل] مجهرية.
2. في قاعة التصوير
   1. لجعل الدوائر التصوير المجهري، استخدام البلازما أنظف لمدة 1 دقيقة لتنظيف ساترة جولة 18 مم وقطرها جولة 35 ملم طبق بيتري مجهزة من أسفل زجاج عيار 20 ملم (0.16-0.19 ملم)-
   2. احتضان السطوح تنظيفها مع 1% β-الكازين لمدة 20 دقيقة للتقليل من البروتين ملزمة للزجاج. أغسل مرتين مع ايميدازول 3 مم-
   3. دخلول إضافة سيتوسول، في نفس الاعتداء الخليط كما هو الحال في الخطوات 5.1.1 و 5.1.2، إلى أنبوب اختبار بريكوليد 1.5 مل وتكمل الخليط المقايسة مع 0.1 ميكروغرام/ميكروليتر والرودامين-أكتين-
   ضبط النهائي الانكسار المخلوط إلى 1.375 (26.5 في المائة السكروز) باستخدام محلول السكروز 39% من
   4. -
      ملاحظة: عادة، على نفس وحدة التخزين هو إضافة؛ ولكن هذا قد يكون تجريبيا إعادة تعديلها تبعاً لتركيز السكروز الكسر المجمعة، تحدد باستخدام مقياس، نظراً لتركيز السكروز قد تتغير قليلاً من التجربة إلى التجربة-
   5. وضع الخليط على الطبق pretreated 35 ملم (الخطوة 5.2.1) وتغطية ذلك مع ساترة 18 ملم pretreated (الخطوة 5.2.1)-
   6. ضع الدائرة على 37 درجة مئوية، دون الهز.
   7. تحليل العينة باستخدام مجهر الأسفار [كنفوكل]-

6. ميلان الصورةكويسيتيون و "تحليل لشبكة أكتين"

1. 1. من الحصول على الصور الحصول على الصور مجهر [كنفوكل] مسح مقلوب.
      ملاحظة: تم الأمثل إعدادات اقتناء الصورة مجهر [كنفوكل] مسح مقلوب مع هدف نفط نا 63 X 1.25. ضبط السلطة الليزر (عادة حوالي 50 ٪) إلى تحقيق نسبة الإشارة إلى الضوضاء جيدة.
2. القياس الكمي لشبكة أكتين
   1. تحليل ميكروجرافس نيون. استخدام البرامج مفتوحة المصدر سيلبروفيلير (v2.1.1) ¹² لقياس كمية أكتين الواحد دخلول (يمكن استخدام برامج بديلة).
      1. أولاً، تحديد اندوسوميس كالكائن الأساسي باستخدام الإشارات RAB5 التجارة والنقل. ثم تحديدها كمياً واكتين المرتبطة اندوسوميس الفردية باستخدام نشر إشارة أكتين (الصبغ الأحمر والبرتقال مترافق فالويدين) ككائن ثانوي-
      2. متوسط وتطبيع عدد المواد المرتبطة بها لكل كائن إلى حالة التحكم-

النتائج

لاكتساب نظرة ثاقبة تشكيل بقع واكتين في وقت مبكر دخلول الأغشية، تابعنا البروتوكول المبينة في الشكل 2. باختصار، تم transfected الخلايا مع التجارة والنقل RAB5 وثم أعدت اندوسوميس المبكر بوجود سوبسيلولار. كانت المحتضنة هذه اندوسوميس المبكر المنقي مع سيتوسول بغية تو?...

Discussion

أكتين يلعب دوراً حاسما في دخلول غشاء ديناميات^4،14. نحن أفاد سابقا أن التنو أكتين والبلمره تحدث في وقت مبكر اندوسوميس، تشكيل بقع واكتين أو الشبكات الصغيرة. وتشكل هذه الشبكات واكتين المطلوبة على الإطلاق للنقل الغشاء خارج اندوسوميس المبكر على طول مسار التدهور....

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	71380
KCl	Acros Organics	196770010
KH2PO4	AppliChem	A1042
Na2HPO4	Acros Organics	424370025
Hepes	AppliChem	A3724
Magnesiun acetate tetrahydrate	Fluka	63047
Dithiothreitol (DTT)	AppliChem	A2948
Imidazole	Sigma-Aldrich	10125
NaOH	Fluka	71690
Sucrose	Merck Millipore	107687
Leupeptin	Roche	11017101001
Pepstatin	Roche	10253286001
Aprotinin	Roche	10236624001
Paraformaldehide	Polysciences. Inc	380
Alexa Fluor 555 phalloidin	Molecular Probes	A34055
Actin rhodamine	Cytoskeleton. Inc	APHR-A
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich	81381	poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000
DABCO	Sigma-Aldrich	D-2522
Tris-HCl	AppliChem	A1086
β-casein	Sigma-Aldrich	C6905
Filter 0.22 μm	Millex	SL6V033RS
Round 10 cm dishes for cell culture	Thermo Fisher Scientific	150350
Plastic Pasteur pipette	Assistent	569/3 40569003
15-mL polypropylen tube	TPP	91015
Hypodermic Needle 22G Black 30mm	BD Microlance	300900
Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle	BD Plastipak	300013
Micro glass slides	Assistent	2406
18 x 18-mm glass coverslip	Assistent	1000/1818
SW60 centrifuge tube	Beckman coulter	344062
TLS-55 centrifuge tube	Beckman coulter	343778
200-μL yellow tip	Starlab	S1111-0706
1,000-μL Blue Graduated Tip	Starlab	S1111-6801
1.5-mL test tube	Axygen	MCT-175-C 311-04-051
18-mm diameter round coverslip	Assistent	1001/18
35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm)	In vitro Scientific	D35-20-1.5-N
Refractometer	Carl Zeiss	79729
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Sorvall WX80 Ultracentrifuge	Thermo Fisher Scientific	46900
Tabletop ultracentrifuge	Beckman coulter	TL-100
SW60 rotor	Beckman coulter	335649
TLS-55 rotor	Beckman coulter	346936
Confocal microscopy	Carl Zeiss	LSM-780
Fugene HD transfection reagent	Promega	E2311
Protein assay reagent A	Bio-Rad	500-0113
Protein assay reagent B	Bio-Rad	500-0114
Protein assay reagent S	Bio-Rad	500-0115
Cell scraper	Homemade		Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps
Refractometer	Carl Zeiss
Minimum Essential Medium Eagle (MEM)	Sigma-Aldrich	M0643
FCS	Thermo Fisher Scientific	10270-106
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)	Thermo Fisher Scientific	11140-035
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030-024
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
pH Meter 691	Metrohm
ImageJ software			NIH, Bethesda MD