במבחנה פלמור של F-אקטין-Endosomes מוקדם

Summary

פונקציות אנדוזום מוקדם תלויים פלמור אקטין-F. כאן, אנו מתארים מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות, ובכך הפך את סדרת תגובות מורכבת זו נוטה הביוכימי ותעשיה מניפולציות.

Abstract

פונקציות רבות אנדוזום מוקדם, במיוחד מטען החלבון ומיון ממברנה דפורמציה, תלויים כתמים של חוטים F-אקטין קצרים nucleated על גבי קרום endosomal. הקמנו מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות, ובכך הפך את סדרת תגובות מורכבת זו נוטה גנטי וביוכימי מניפולציות. שברים Endosomal מוכנות על ידי ציפה במעברי צבע סוכרוז מתאי לבטא את החלבון endosomal מוקדם GFP-RAB5. שברים cytosolic מוכנות של קבוצות נפרדות של תאים. הן endosomal והן cytosolic שברים ניתן לאחסן קפוא חנקן נוזלי, במידת הצורך. ב וזמינותו, endosomal ואת cytosolic שברים מעורבים, התערובת מודגרת ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים המתאימים (למשל, יונית כוח, להפחית את הסביבה). בזמן הנסיעה, תערובת התגובה הוא קבוע, F-אקטין מתגלה עם phalloidin. התגרענות אקטין, הפילמור מכן נותחו על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. כאן, אנחנו מדווחים כי assay זה יכול לשמש כדי לחקור את התפקיד של הגורמים המעורבים או אקטין התגרענות על הקרום, או התארכות עוקבות, מ., או crosslinking של F-אקטין חוטים.

Introduction

התאים האיקריוטים גבוה יותר, חלבונים ושומנים הם הפנימו לתוך מוקדם endosomes איפה המיון מתבצע. כמה חלבונים ושומנים, שנועד להיות reutilized, שולבו צינורי מחוזות endosomes מוקדמת, ואז מועברים קרום פלזמה או טרנס-גולג'י רשת (TGN)^1,2. לעומת זאת, חלבונים ושומנים אחרים ארוזים באופן סלקטיבי לתוך מחוזות endosomes מוקדמת כי התערוכה מראה multivesicular. אזורים אלה הרחב, על ניתוק ממברנות endosomal מוקדם, בסופו של דבר בוגרת לתוך שלפוחית המוביל endosomal חינם או גופים multivesicular (ECV/MVBs), אשר אחראים על תובלת המטענים לעבר המנוח endosomes^{1, 2}.

אקטין ממלא תפקיד מכריע בתהליך שיפוץ ממברנה המשויכים להן אנדוזום והיכולת מיון endosomal. חלבון מיון לאורך המסלולים מיחזור קרום פלזמה או את TGN תלוי את retromer קומפלקס החלבונים הקשורים. מכונות מיון זה נראה להיות מצמידים את היווצרות של מיחזור בקוריאנית באמצעות האינטראקציות של retromer מתחם עם צרעה והצלקת homologue (שטיפה) מורכב, מסועף אקטין^3,4,5 . לעומת זאת, מולקולות המיועדים השפלה, במיוחד הפעלת קולטנים איתות, מסודרים לתוך שלפוחית intraluminal (ILVs) על ידי endosomal מיון מתחמי הדרושים עבור תחבורה (ESCRT)^{2,6, 7}. בעוד תפקיד אפשרי של אקטין בתהליך מיון תלוי-ESCRT אינו ידוע, F-אקטין ממלא תפקיד חשוב להן של ECV/MVBs, תחבורה מעבר endosomes המוקדמות. בפרט, מצאנו כי annexin A2 נקשר מועשרת כולסטרול אזורים של אנדוזום מוקדם, ויחד עם spire1, nucleates פלמור אקטין-F. היווצרות של הרשת אקטין מסועף מובחנים endosomes דורשת את הפעילות הסתעפות של החלבון אקטין הקשורות (ARP) 2/3 מורכבים, כמו גם את moesin חלבון ERM ו-^8,9cortactin חלבון מחייב אקטין.

כאן, אנו מתארים מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות. Assay הזה שימש בעבר כדי לחקור את התפקיד של annexin A2 ב- F-אקטין התגרענות ואת moesin ואת cortactin על היווצרות endosomal אקטין רשתות^8,9. עם זה פרוטוקול במבחנה , הסדרה מורכבת של התגובות המתרחשות על endosomes במהלך פלמור אקטין הופכים לבצע ניתוח הביוכימי והמולקולרי של השלבים רציפים של התהליך, לרבות התגרענות אקטין, ליניארי פלמור, מסעף ו crosslinking.

Protocol

1-פתרונות, ההכנות

הערה: כל מאגרי ופתרונות צריכה להיות מוכנה מזוקק פעמיים (dd) H ₂ O. מכיוון המדינה הידרציה של סוכרוז משתנה, הריכוז הסופי של כל הפתרונות סוכרוז להיקבע באמצעות משאבות-מעבדות של.

1. הכן באגירה פוספט תמיסת מלח ללא קטיונים דו ערכיים (נולד ב- PBS): 137 מ מ נז'י, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, 1.5 מ מ ח' ₂ PO ₄ ו- 6.5 מ מ נה ₂ HPO ₄. להתאים את ה-pH ל 7.4. לחטא מאת autoclaving (1 מחזור ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות) ולאחסן בטמפרטורת החדר.
2. להכין פתרון מניות של 300 מ"מ imidazole: 0.204 גר' imidazole ב- 10 מ"ל של ddH ₂ O.Adjust ה-pH ל 7.4 ב 4 ° C באמצעות שימוש של μm 0.22 לחטא HCl. מסנן מסנן גודל הנקבוביות ולאחסן ב-4 מעלות צלזיוס
מאגר
3. הכן המגון (HB; להכין כ 100 מ ל): 250 מ מ סוכרוז ב- 3 מ מ imidazole. להתאים את ה-pH ל 7.4 ב 4 ° C באמצעות מד pH. מסנן-לעקר באמצעות מסנן גודל הנקבוביות 0.22 μm ולאחסן ב-4 ° ג המשלים HB לפני השימוש עם קוקטייל של מעכבי פרוטאז בריכוזים הסופית המתאימה 10 מ מ leupeptin, A pepstatin 1 מ"מ ו- 10 ננוגרם למ"ל aprotinin.
4. למעברי ציפה שלב ', להכין את 62%, 39% ו- 35% סוכרוז פתרונות ב- 3 מ מ imidazole, pH 7.4, כמתואר להלן. לקבוע במדויק את הריכוז הסופי של כל הפתרונות סוכרוז באמצעות משאבות-מעבדות של.
   1. להכין 100 מ של 62% סוכרוז פתרון 3 מ מ imidazole, pH 7.4. להמיס על ידי ערבוב 80.4 גרם סוכרוז ddH ₂ O מראש חימם עד 35 ° C. להוסיף 1 מ"ל של 300 מ"מ imidazole פתרון מלאי ומילוי 100 מ ב- ddH ₂ O. התאם את ה-pH ל 7.4 ב-4 ° C. מסנן לחטא באמצעות מסנן גודל הנקבוביות μm 0.22 חנות ב 4 º C
   2. להכין 100 מ של 35% סוכרוז פתרון 3 מ מ imidazole, pH 7.4. לפזר על ידי ערבוב 40.6 גר' סוכרוז ב- ddH ₂ O. להוסיף 1 מ"ל של 300 מ"מ imidazole מניות פתרון ולמלא עד 100 מ"ל עם ddH ₂ O. התאם את ה-pH ל 7.4-4 ° C. מסנן לחטא בעזרת μm 0.22 הנקבוביות גודל מסנן ולאחסן ב-4 מעלות צלזיוס
   3. להכין 50 מ של 39% סוכרוז ב- 3 מ מ imidazole, pH 7.4. לדלל את הפתרון סוכרוז 62% עם הפתרון 35% סוכרוז. חנות ב 4 º C
5. לפזר דור 3 של paraformaldehyde (PFA) על ידי ערבוב ב- 100 מ של PBS-טרום-warmed עד 60 ° צלזיוס תוך הוספת 1 M NaOH dropwise; להתאים את רמת ה-pH הסופי כדי 7.4 באמצעות NaOH. מסנן-לעקר באמצעות מסנן גודל הנקבוביות 0.22-μm ולאחסן ב-20 מעלות צלזיוס
   התראה: 3% כדורגלן הוא ריאגנט רעיל.
6. פתרון מניות להכין 1 מ' אשלגן כלורי. להמיס 3.73 g של אשלגן כלורי על ידי ערבוב ב 50 מ של ddH ₂ באמצעות מסנן גודל הנקבוביות 0.22-μm לחטא או מסנן ולאחסן בטמפרטורת החדר.
7. פתרון מניות הכן 50 X מרוכז המכיל 0.625 Hepes M ב- pH 7.0 ו- 75 מ מ MgOAc ₂ ב- ddH ₂ O. Aliquot וחנות ב-20 מעלות צלזיוס
8. הכן הרכבה בינונית. מערבבים על ידי ערבוב 2.4 g של poly(vinyl alcohol) M _w ~ 31,000 (PVA) עם 6 גרם של גליצרול. להוסיף 6 מ של ddH ₂ O והשאר כבר לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר. להוסיף 12 מ של 0.2 מ' טריס-קלרנית (pH 8.5) ומחממים עד כ 53 ° C עם תוך ערבוב מדי פעם עד PVA יש התפרקה.
9. להבהיר את הפתרון על ידי צנטריפוגה ב x 5,000 g למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאסוף את תגובת שיקוע והוסף 2.5% (w/v) 1, 4 - diazabicyclo-[2.2.2] אוקטן (DABCO) כדי למנוע photobleaching במהלך זיהוי קרינה פלואורסצנטית. מערבולת כ 30 s להתמוסס. Aliquot לתוך צינורות פלסטיק 1.5-mL, חנות ב-20 מעלות צלזיוס

2. תרבית תאים

1. תרבות הלה בתאים Dulbecco ' s השתנה נשר בינוני עם סרום עגל עוברית 10%, 10% שאינם חיוניים חומצות אמינו, 10%-גלוטמין ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. לשמור אותם ב- 37 מעלות צלזיוס ב חממה ₂ 5% CO.
2. Transfect התאים 24 שעות לפני הניסוי עם GFP-RAB5 ¹⁰, שימוש מסחרי תרביות תאים מגיב לדברי היצרן ' הוראות s.
3. בעת הצורך, להכין endosomal שברים ומספרים ציטוזול מתאי מדולדל של חלבון של הריבית (כלומר, שימוש RNAi או CRISPR/Cas9) ו/או overexpressing טופס wildtype או מוטציה של החלבון עניין.

3. הכנה שבר Endosomal

הערה: פרוטוקול זה מתאר ההכנה פשוטה של שברים subcellular המכיל endosomes וממברנות אור אחרים. אם יש צורך, שברים אנדוזום מטוהרים ניתן גם בשימוש ¹¹. להכין 2 צלחות פטרי (הקוטר החיצוני ס מ-10; 57 ס מ ²) של תאים confluent לבטא GFP-RAB5 כמתחילה חומר. המספר הכולל של הלה confluent, בתאים 2 צלחות פטרי מקביל בערך 2.5 x 10 ⁷ תאים. בעת הצורך, endosomes וניתן גם להכין מתאי מדולדל של חלבון של הריבית (כלומר, שימוש RNAi או CRISPR/Cas9) ו/או overexpressing טופס wildtype או מוטציה של החלבון עניין, תמיד ביטוי GFP-RAB5.

שים לב: כל השלבים של פרוטוקול fractionation צריכה להתבצע על קרח

1. למקם את צלחות פטרי על צלחת מתכת רטובה בתוך דלי קרח שטוחים, מיד לשטוף את התאים פעמיים עם 5 מ של PBS קר כקרח-.
2. PBS כל - להסיר בכביסה האחרונה ולהוסיף 3 מ"ל של PBS קר כקרח-לכל תבשיל. תאים לא צריך לייבש במהלך הטיפול: אם יש צורך, במקום דלי קרח על פלטפורמה נדנדה לכסות שלמאחה תאים עם נוזל.
3. להסיר באופן מכני התאים ב- PBS צלחות פטרי באמצעות שוטר גומי גמיש (קרי, המגרד תא תוצרת בית). לגרד את התאים את הכלים קודם בתנועה מהירה, מעגלית סביב החלק החיצוני של המנה, ולאחריו תנועה כלפי מטה באמצע המנה. מגרדים בעדינות כדי לקבל " גליונות " של תאים המצורפת. להעביר בעדינות את התאים באמצעות פיפטה פסטר פלסטיק עם פתח רחב כדי צינור חרוטי 15-mL פוליפרופילן על קרח
4. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 175 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
5. בעדינות להסיר את תגובת שיקוע (SN) ולהוסיף 1-3 מ"ל של HB בגדר. באמצעות פיפטה פסטר פלסטיק עם פתח רחב, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה פעם אחת כדי resuspend את התאים.
6. צנטריפוגה למשך 7-10 דקות ב 1,355 x g ו- 4 ° C. בעדינות הסרה SN.
7. לבצע המגון תא.
   הערה: תנאים צריך להיות עדין כך פלזמה הממברנות של התאים שבורות אבל endosomes נשארים בעינם.
   1. הוסף נפח ידוע של HB עם מעכבי פרוטאז על גבי כל גלולה תא (כ-100 μL לכל תא גלולה). שימוש של micropipette 1,000-µL, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה עד התאים הם resuspended. אל להציג את בועות האוויר.
   2. להכין מזרק טוברקולין 1-mL עם מחט 22 גרם שטופים מראש עם HB, ללא אוויר או בועות.
   3. למלא את המזרק עם התליה תא יחסית לאט (כדי למנוע יצירת בועות אוויר), המקום משופע קצה המחט הקיר של הצינור, לגרש את המתלים תא במהירות כדי להטות את הממברנות פלזמה של התאים המצורפת.
   4. Aliquot קטן של homogenate (כ 3 µL) ואין למהול אותו לתוך µL 50 של HB על משטח זכוכית. לערבב, לכסות עם coverslip זכוכית. בדוק את homogenate במיקרוסקופ ניגוד שלב מצויד 20 X או המטרה X 40.
      הערה: בתנאים אופטימליים, רוב התאים שבור, אבל גרעינים, אשר מופיעים אפור כהה סביב מבנים, אינם ( איור 1).
   5. שלב חוזר 3.7.3 3.7.4 עד רוב התאים שבורות; בדרך כלל, 3-6 קווים שיהיה דרך המחט נחוצים. שמור של aliquot קטנים (10-30 µL) של homogenate לקביעת חלבון.
8. Homogenate צנטריפוגה במשך 7 דקות ב 1,355 x g ו- 4 מעלות צלזיוס
   הערה: לאחר צנטריפוגה, בגדר (כהגדרתו בגדר גרעינית; NP) מכיל הגרעינים, את תגובת שיקוע (כהגדרתו של תגובת שיקוע postnuclear; מערכת העצבים ההיקפית) מכיל את ציטוזול והן את organelles שוחרר על המגון, ההשעיה חינם.
9. בזהירות לאסוף את מערכת העצבים ההיקפית. לשמור aliquots קטנים (10-30 µL) של מערכת העצבים ההיקפית, NP לקביעת חלבון ולמחוק את NP.
10. להתאים את מערכת העצבים ההיקפית כדי 40.6% סוכרוז באמצעות דילול הפתרון סוכרוז 62% עם מערכת העצבים ההיקפית באמצעות יחס 1:1.1 של PNS:62% סוכרוז. מערבבים בעדינות אך ביסודיות, ללא יצירת בועות אוויר. בדוק את הריכוז סוכרוז באמצעות משאבות-מעבדות את.
11. למקם את מערכת העצבים ההיקפית 40.6% סוכרוז בתחתית התחתית ultracentrifugation. כיסוי בזהירות עם 2.5 מ של הפתרון 35% סוכרוז ולמלא את הצינור צנטריפוגה HB.
    הערה: הפתרונות סוכרוז צריך להיות שכבות כך ממשקים הם נראים בבירור.
12. Ultracentrifuge מעברי הצבע עבור h 1 ̴165, 000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס
13. הסר בזהירות את השכבה הלבנה של שומנים על גבי המילוי ההדרגתי. בשלב הבא, לאסוף את הממשק המכיל endosomes, בין HB 35% סוכרוז, באמצעות micropipette 200-μL עם טיפ לחתוך.
    הערה: שברים endosomal יכול לשמש ישירות בבמבחנה אקטין הפילמור וזמינותו או יכול להיות aliquoted בקרח, קפואה של חנקן נוזלי, ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס
14. לקבוע ריכוז חלבון של שברים מערכת העצבים ההיקפית, endosomal.
    הערה: במכלול זה צריך להיות לפחות 100 µg/mL. כ 2.5 x 10 ⁷ תאים גדלו ב 2 צלחות פטרי נדרשים להשיג את מערכת העצבים ההיקפית לפחות 100 µg/mL (ראה לעיל בהערה).

4. ציטוזול הכנה

הערה: להכין 2 פטרי (בקוטר 10 ס מ; 57 ס מ ²) של תאים confluent הלה כמתחילה חומר. בעת הצורך, ניתן ציטוזול גם להכין מתאי מדולדל של חלבון של הריבית (כלומר, שימוש RNAi או CRISPR/Cas9) ו/או overexpressing של wildtype או הטופס mutant של החלבון עניין. לגבי פרוטוקול fractionation אנדוזום, כל הצעדים צריכה להתבצע על קרח

1. חזור על השלבים 3.1-3.8.
2. למקם את מערכת העצבים ההיקפית צנטריפוגה שפופרת ultracentrifuge למשך 45 דקות ב̴250, 000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס
3. בזהירות להסיר את שכבת לבן על גבי ולאסוף את SN (ציטוזול שבר) מבלי להפריע בגדר microsome. לשמור על aliquot של השבר ציטוזול לקביעת חלבון.
   הערה: ציטוזול יכול לשמש ישירות בבמבחנה אקטין הפילמור וזמינותו או יכול להיות aliquoted בקרח, קפואה של חנקן נוזלי, ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס
4. לקבוע ריכוז חלבון ציטוזול.
   הערה: זה צריך להיות לפחות 3 מ"ג/מ"ל.

5. שיטת מדידה אנדוזום תלוית פלמור אקטין ב חוץ גופית

הערה: פלמור אקטין אנדוזום תלוית יכול להתבצע באמצעות שתי גישות אלטרנטיביות. בגישה הראשונה, החומרים הם מעורבים במבחנה, קבוע, הועבר coverslip, ניתח. בגישה השנייה, המתוארים כאן, וזמינותו יכולה להתבצע ישירות בבית הבליעה הדמיה, יכול להיות קבוע וניתח ללא ההפרעות מכני ( איור 2C). בגישה זו השנייה, התערובת assay לא מועבר ממבחנות coverslip, וכך נשאר בשלוות נפש, הפחתת הסכנה של רשתות F-אקטין להיות מוטרד פיזית במהלך ההעברה. בנוסף, גישה זו השנייה היא תואמת לניתוח בצילום מואץ של F-אקטין הפילמור. יצוין כי אין הבדל בניתוח פלמור אקטין-F נצפתה גם גישה.
הערה: השתמש לחתוך טיפים לאורך כל הפרוטוקול.

1. במבחנה
   1. בעדינות לערבב כקרח מטוהרים GFP-RAB5 endosomes (שלב 3) עם ציטוזול (שלב 4) ביחס של 1:10 (ריכוז חלבון) הקר 1.5-mL חרוט מבחן צינור.
      הערה: ניסוי טיפוסי מתבצע עם 40-50 µL.
   2. להתאים את תערובת התגובה כקרח ריכוזי הסופי של 125 מ מ אשלגן כלורי (באמצעות הפתרון מניות של אשלגן כלורי 1 מ'), 12.5 מ מ Hepes ו- 1.5 מ מ MgOAc ₂ (באמצעות 50 x פתרון מניות). לאחר מכן, התאם את התערובת עם מעכבי פרוטאז ריכוזי הסופי של 10 מ מ leupeptin, pepstatin 1 מ א 10 ננוגרם למ"ל aprotinin. מערבבים בעדינות את כל הרכיבים.
   3. המקום בו מום המכיל תערובת התגובה ב 37 ° C, ללא רועד, ואת תקופת דגירה של הזמן המבוקש.
      הערה: בדרך כלל, זה ייקח בערך 3 דקות כדי לזהות פלמור אקטין endosomes ו 30 דקות של הקמת רשת נרחבת.
   4. הזמן הרצוי (קרי, 3 דקות או 30 דקות), לעצור את התגובה על ידי הצבת את מבחנה על קרח ולהוסיף 1/10 (vol:vol) של הפתרון מחברים 3% precooled.
   5. להוסיף 0.3:10 (vol:vol) של 200 יחידות/mL (~6.6 μM) phalloidin מצומדת כדי צבען אדום כתום כתם של אקטין polymerized.
   ΜL
   6. μL מקום 12 של התערובת על 12 PVA בינוני גובר על משטח זכוכית מיקרו. לשים על 18 פרק 18 מ מ ² זכוכית למעלה coverslipon.
   7. לנתח את הדגימה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית-
2. בבית הבליעה הדמיה
   1. כדי להפוך צ'יימברס הדמיה מיקרוסקופיים, השתמש פלזמה מנקה עבור 1 דקות כדי לנקות coverslip עגול קוטר 18 מ מ, קוטר 35 מ מ עגול פטרי מצויד עם חלק תחתון זכוכית 20 מ מ (0.16-0.19 מ מ)-
   2. תדגור על משטחים נקי עם 1% β-קזאין במשך 20 דקות למזער את חלבון מחייב אל הזכוכית תשטוף פעמיים עם 3 מ מ imidazole.
   3. הוסף אנדוזום, ציטוזול, באותו assay תערובת כמו שלבים 5.1.1 ו- 5.1.2, כדי precooled 1.5 mL מבחנה, משלימים את התערובת assay עם 0.1 μg/μL rhodamine-אקטין.
   4. להתאים את הסופי מקדם שבירה של התערובת כדי 1.375 (26.5% סוכרוז) באמצעות 39% סוכרוז פתרון.
      הערה: בדרך כלל, באותו אמצעי אחסון נוסף; עם זאת, זה חייב להיות מדעית מחדש שהותאם בהתאם ריכוז סוכרוז של השבר שנאספו, נקבע באמצעות של refractomer, שכן ריכוז סוכרוז עשוי להשתנות מעט ניסוי כדי ניסוי.
   5. מניחים את התערובת על המנה pretreated 35 מ מ (שלב 5.2.1) ומכסים אותו עם coverslip 18 מ מ pretreated (שלב 5.2.1).
   6. במקום התא בגיל 37 ° C, מבלי לרעוד.
   7. לנתח את הדגימה באמצעות קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה קונפוקלית-

6. התמונה Acquisition, ניתוח של אקטין ברשת

1. ייבוא תמונות
   1. לרכוש את התמונות במיקרוסקופ קונפוקלי סריקה הפוך.
      הערה: הגדרות רכישת תמונה אופטימציה להצגה מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה הפוך עם יעד שמן נה 63 X 1.25. התאם את עוצמת הלייזר (בדרך כלל סביב 50%) כדי להשיג יחס אות לרעש טוב.
2. כימות של הרשת אקטין
   1. לנתח את micrographs פלורסנט. להשתמש בתוכנה בקוד פתוח CellProfiler (v2.1.1) ¹² כדי למדוד את כמות אקטין לכל אנדוזום (תוכנה חלופית יכולה לשמש).
      1. ראשית, עליך לזהות endosomes כמו של האובייקט העיקרי באמצעות האות ה-GFP-RAB5. לאחר מכן, לכמת את F-אקטין המשויך endosomes בודדים באמצעות התפשטות של האות אקטין (צבען אדום כתום מצומדת Phalloidin) כאובייקט משני.
      2. הממוצע, לנרמל את המספר של חומר המשויך עבור כל אובייקט למצב שליטה.

תוצאות

כדי לקבל תובנות לגבי היווצרות של F-אקטין תיקונים הקרומים אנדוזום מוקדם, עקבנו פרוטוקול המתוארים באיור2. בקצרה, התאים היו transfected עם GFP-RAB5, ואז endosomes מוקדם הוכנו על ידי subcellular fractionation. אלה endosomes מוקדם מטוהרים היו מודגרות עם ציטוזול על מנת לספק אקטין עצמה, כמו גם ?...

Discussion

אקטין ממלא תפקיד מכריע אנדוזום ממברנה dynamics^4,14. בעבר דיווחנו כי אקטין התגרענות הפילמור מתרחשים על endosomes מוקדם, ויוצרים F-אקטין תיקונים קטנים או רשתות. רשתות אלה F-אקטין נדרשים לחלוטין להעברה ממברנה מעבר endosomes מוקדמת לאורך השביל השפלה. הפרעה בשלב כלשהו של תהליך ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	71380
KCl	Acros Organics	196770010
KH2PO4	AppliChem	A1042
Na2HPO4	Acros Organics	424370025
Hepes	AppliChem	A3724
Magnesiun acetate tetrahydrate	Fluka	63047
Dithiothreitol (DTT)	AppliChem	A2948
Imidazole	Sigma-Aldrich	10125
NaOH	Fluka	71690
Sucrose	Merck Millipore	107687
Leupeptin	Roche	11017101001
Pepstatin	Roche	10253286001
Aprotinin	Roche	10236624001
Paraformaldehide	Polysciences. Inc	380
Alexa Fluor 555 phalloidin	Molecular Probes	A34055
Actin rhodamine	Cytoskeleton. Inc	APHR-A
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich	81381	poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000
DABCO	Sigma-Aldrich	D-2522
Tris-HCl	AppliChem	A1086
β-casein	Sigma-Aldrich	C6905
Filter 0.22 μm	Millex	SL6V033RS
Round 10 cm dishes for cell culture	Thermo Fisher Scientific	150350
Plastic Pasteur pipette	Assistent	569/3 40569003
15-mL polypropylen tube	TPP	91015
Hypodermic Needle 22G Black 30mm	BD Microlance	300900
Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle	BD Plastipak	300013
Micro glass slides	Assistent	2406
18 x 18-mm glass coverslip	Assistent	1000/1818
SW60 centrifuge tube	Beckman coulter	344062
TLS-55 centrifuge tube	Beckman coulter	343778
200-μL yellow tip	Starlab	S1111-0706
1,000-μL Blue Graduated Tip	Starlab	S1111-6801
1.5-mL test tube	Axygen	MCT-175-C 311-04-051
18-mm diameter round coverslip	Assistent	1001/18
35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm)	In vitro Scientific	D35-20-1.5-N
Refractometer	Carl Zeiss	79729
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Sorvall WX80 Ultracentrifuge	Thermo Fisher Scientific	46900
Tabletop ultracentrifuge	Beckman coulter	TL-100
SW60 rotor	Beckman coulter	335649
TLS-55 rotor	Beckman coulter	346936
Confocal microscopy	Carl Zeiss	LSM-780
Fugene HD transfection reagent	Promega	E2311
Protein assay reagent A	Bio-Rad	500-0113
Protein assay reagent B	Bio-Rad	500-0114
Protein assay reagent S	Bio-Rad	500-0115
Cell scraper	Homemade		Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps
Refractometer	Carl Zeiss
Minimum Essential Medium Eagle (MEM)	Sigma-Aldrich	M0643
FCS	Thermo Fisher Scientific	10270-106
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)	Thermo Fisher Scientific	11140-035
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030-024
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
pH Meter 691	Metrohm
ImageJ software			NIH, Bethesda MD