体外初期エンドソームの F-アクチンの重合

要約

初期エンドソーム機能 F アクチンの重合によって決まります。ここで、この複雑な一連の反応の生化学的・遺伝的影響を受けやすいレンダリング核生成と、試験管の初期エンドソーム膜に F-アクチンの重合を再構成培養顕微鏡ベースのアッセイを説明します。操作。

要約

多機能初期エンドソーム、特に貨物蛋白質を並べ替えると膜変形、エンドソームの膜の上に核形成した短い F アクチンのパッチに依存します。この複雑な一連の反応の遺伝学的および生化学的影響を受けやすいレンダリング核生成と、試験管の初期エンドソーム膜に F-アクチンの重合を再構成培養顕微鏡ベースのアッセイを設けています。操作。エンドソーム分数は初期エンドソーム タンパク質 RAB5 GFP を発現する細胞からのサッカロースの勾配の浮上によって準備されます。細胞質画分は、細胞の別のバッチから用意しています。エンドソームと細胞質画分格納できます液体窒素で凍結に必要な場合。アッセイのエンドソームと細胞質画分を混合、および混合物は、適切な条件 (例えば、イオン強度、環境を削減) の 37 ° C で培養しました。希望の時間に反応混合物を固定すると、および F-アクチン ファロイジンで明らかにされます。アクチン核形成と重合は、蛍光顕微鏡で分析しています。ここで、アクチン核形成膜、またはそれ以降の伸び、分岐、または F アクチン繊維の架橋のどちらかに関与している因子の役割を調査するこのアッセイを使用ことができることを報告します。

概要

高等真核生物の細胞のタンパク質や脂質は並べ替えが発生する初期エンドソームを内面化します。いくつかのタンパク質や脂質は、住宅がする運命にあるは初期エンドソームの管状地域に組み込むし、トランスゴルジ ネットワーク (TGN)^1、2細胞膜に輸送。対照的に、他のタンパク質や脂質は、多胞性の外観を示す初期エンドソームの領域に選択的にパッケージ化されます。これらの領域を展開し、初期エンドソーム膜から剥離時に無料エンドソーム キャリア小胞または多胞体 (ECV/MVBs) に最終的に成熟したから責任がある後期エンドソーム^1,に向かって貨物輸送²。

アクチンは、エンドソーム並べ替え容量とエンドソームの形成と関連付けられる膜改造プロセスで重要な役割を果たしています。タンパク質のリサイクルの経路に沿って、TGN の細胞膜には、レトロマー複合体と関連付けられているタンパク質に依存します。この仕分けの機械リサイクル尿細管を介しての相互作用レトロマー複合体、ハチと傷跡相同 (洗浄) 複雑で分岐したアクチン^{3,4,5 の形成を結合するようであります。}.対照的に、分子分解運命、特にシグナル受容体を活性化、エンドソーム選別輸送 (ESCRT)^{2,6、複合体によって管腔内小胞 (ILVs) に分類されます。 7}。アクチン ESCRT 依存ソート処理の可能な役割は知られていない、F アクチンは ECV/MVBs の生合成におけるや早期エンドソームを超えて輸送に重要な役割を果たしています。特に、アネキシン A2 初期エンドソームと spire1 と共にコレステロール濃縮の領域にバインド、nucleates F アクチンの重合がわかった。エンドソームに観察される分岐アクチン ネットワークの形成がアクチン関連タンパク質 (ARP) 2/3 の分岐のアクティビティを必要とする複雑でと同様、ERM タンパク質モエシン、アクチン結合タンパク質 cortactin^8,9。

ここでは、核生成と試験管内初期エンドソーム膜に F-アクチンの重合を再構成培養顕微鏡ベースのアッセイをについて説明します。この試金は、A2 を F-アクチン核形成におけるアネキシンとモエシンとエンドソーム アクチン ネットワーク^8,9の形成の役割を調べるため以前使用されています。この体外プロトコルで複雑な一連のエンドソームでアクチンの重合時に発生する反応なるアクチン核形成、線形を含むプロセスの一連のステップの生化学的および分子の分析に従う義務があります。重合、分岐、および架橋。

プロトコル

1 ですソリューションおよび準備

注: すべてのバッファーおよび解決は、ダブル蒸留 (dd) H ₂ o. で準備する必要が。糖度計を使用してすべてのスクロース溶液の最終濃度を決定する必要がありますショ糖の水和状態によって異なりますので、.

1. 準備リン酸緩衝生理食塩水 (PBS-) の二価陽イオンなし: 137 mM よる、2.7 mM KCl、1.5 mM KH ₂ PO ₄、および 6.5 mM ナ ₂ HPO ₄。7.4 に pH を調整します。オートクレーブ滅菌 (121 ° C で 15 分間 1 サイクル) で殺菌し、常温で保存します
。
2. 300 mM のイミダゾールの貯蔵液の準備: ddH ₂ O.Adjust 塩酸フィルター滅菌 0.22 μ m を使用してを使用して 4 ° C、7.4 に pH サイズ フィルターの細孔し、4 デパートの 10 mL のイミダゾールの 0.204 g ° C
3. 準備均質化バッファー (HB; 約 100 mL を準備): 3 mM のイミダゾールの 250 mM ショ糖。PH 計を用いた 4 ° C、7.4 に pH を調整します。0.22 μ m 孔サイズ フィルターを使用してフィルター滅菌し、4 で保存 ° C. 補完 HB 使用直前最終濃度 10 mM leupeptin、1 mM ペプスタチン A、および 10 ng/mL アプロチニンに対応するプロテアーゼ阻害剤のカクテルと
。
4. ステップ浮上グラデーションの準備 62%、39%、35% スクロース溶液で 3 mM のイミダゾール、pH 7.4 では、下記のとおりです。糖度計を使用してすべてのスクロース溶液の最終濃度を正確に決定します。
   1. 3 mM のイミダゾール、pH 7.4 で 62% ショ糖溶液の準備 100 mL。DdH ₂ O でショ糖の 80.4 g を攪拌して溶解加温 300 mM イミダゾール原液と ddH ₂ O. 調整と 100 mL に塗りの 35 ° c. を追加 1 mL pH 7.4 に 4 ° c. フィルター滅菌 0.22 μ m 孔サイズ フィルターとストアを使用して4 ° C で
   2. は、3 mM のイミダゾール、pH 7.4 で 35% ショ糖溶液 100 mL を準備します。300 mM のイミダゾール原液の ddH ₂ O. 追加 1 mL 中のスクロースの 40.6 g を攪拌して溶解し、ddH ₂ O. 調整と 100 mL に 4 ° c. フィルター滅菌使用 0.22 μ m 孔サイズのフィルターと 4 デパートで 7.4 に pH を埋める ° C
   3. は、3 mM のイミダゾール、pH 7.4 で 39% ショ糖の 50 mL を準備します。35% ショ糖液で 62% ショ糖溶液を希釈します。4 ° C でストア
5. 1 M 水酸化ナトリウムを滴下し追加しながら 100 mL の PBS-前 warmed 60 ° c で攪拌によるパラホルムアルデヒド (PFA) の 3 g を溶かす; NaOH を使用して 7.4 に最終の pH を調整します。0.22 μ m 孔サイズ フィルターを使用してフィルター滅菌し、-20、保管 ° C
   注意: 3 %pfa は有毒な試薬
。
6. 準備 1 M 塩化カリウム原液。50 ml の ddH ₂ o. フィルター滅菌 0.22 μ m 孔サイズ フィルターを使用しての攪拌による KCl の 3.73 g を溶解し、常温で保存します
。
7. PH 7.0 と 75 ミリメートル MgOAc ₂ ddH ₂ O を因数とストアで-20 で 0.625 M Hepes を含む準備 50 倍濃縮原液 ° C
8. 準備は、メディアをマウントします。グリセロールの 6 g poly(vinyl alcohol) M _w 〜 31,000 (PVA) の 2.4 g を攪拌して混ぜます。DdH ₂ O の 6 mL を追加し、室温で少なくとも 2 h のまま。12 0.2 mL を加える M トリス Cl (Ph8.5) と時折かくはん PVA が溶けるまでで約 53 ° C に熱します
。
9. 室温で 20 分間 5,000 × g で遠心分離によって解決策を明らかにします。上清を収集し、追加 2.5% (w/v) 1, 4 - diazabicyclo-[2.2.2] オクタン (鎖置換 DABCO) 蛍光検出時に退色を防ぐために。約 30 のための渦を溶解する s。1.5 mL プラスチック チューブと-20 で店に割り切れる ° C

2。細胞培養

1. ダルベッコの培養 HeLa 細胞 ' s 10% 非本質的なアミノ酸、10% ウシ胎仔血清で修正イーグル培 10 %l-グルタミンと 1% ペニシリン-ストレプトマイシン。37 ° c 5% CO ₂ インキュベーターでそれらを維持します
。
2. GFP RAB5 ¹⁰ 製造元によると商業のトランスフェクション試薬を用いた実験の前に 24 時間のセルを transfect ' s 指示します
。
3. 必要に応じて、エンドソーム分数と利率 (すなわち RNAi や CRISPR/Cas9 を使用して) や興味の蛋白質の形式を野生型または突然変異体を過剰発現タンパク質を消耗した細胞から細胞質を準備します
。

3。エンドソーム分数準備

注: このプロトコルは、エンドソームと他の光の膜を含む細胞下分画の簡単な準備をについて説明します。必要な場合精製エンドソーム分数に使用 ¹¹ することができます。開始材料として GFP RAB5 を発現するコンフルエントの細胞の 2 つのペトリ皿 (10 cm 外径; 57 cm ²) を準備します。2 枚のペトリ皿に合流の HeLa 細胞の総数は約 2.5 倍の 10 の ⁷ セルに対応します。とき、必要に応じて、エンドソームも用意できます GFP RAB5 を常に表現する、(すなわち RNAi や CRISPR/Cas9 を使用して) の興味および興味の蛋白質の形式を野生型または突然変異体を過剰発現タンパク質を消耗したセルから

。

注意: 氷の分別のプロトコルのすべての手順を実行します

1. フラット氷バケットに濡れた鉄板の上にペトリ皿を置くし、すぐに氷冷 PBS-5 mL で 2 回細胞を洗っています
。
2. 削除すべての PBS - 最後の洗浄から、氷冷 PBS の皿あたり 3 mL を加えます。細胞が乾燥しないと処理中に: 必要に応じて、液で細胞を十分にカバーするロッキング プラットフォームに氷バケツを配置します
。
3. は、機械的に柔軟なゴム製の警官 (自家製細胞スクレーパー など) を使用してシャーレから PBS のセルを削除します。皿の真ん中に下向きの動き続く、皿の外側にクイック、円形を描くように皿からセルを最初に擦る。取得する優しくこすり " シート " 接続されている細胞。軽く氷に 15 mL の円錐形ポリプロピレン チューブに広い開口部とプラスチックのパスツール ピペットを使用してセルを転送
4. 175 x g で 5 分間遠心分離し 4 ° C
5. はそっと上澄み (SN) を除去し、ペレットに HB の 1-3 mL を追加します。広い開口部とプラスチックのパスツール ピペットを使用して穏やかに、また上下一度細胞を再懸濁します
。
6. X g と 4 ° c. そっと削除 SN 1,355 で 7 ~ 10 分間遠心します
。
7. セル均質化を実行します
   。 注: 条件は、細胞の細胞膜が壊れているが、エンドソームのままに穏やかなする必要があります。
   1. (細胞ペレットあたり約 100 μ L) 細胞ペレットにプロテアーゼ阻害剤と HB の知られているボリュームを追加します。1,000 μ L マイクロ ピペットを使用して、優しくピペット上下セル再停止されるまで。できません空気の泡を紹介します
   。
   2. HB に中古リンスや空気や気泡の自由 22 G 針で 1 mL ツベルクリン注射器を準備します
   。
   3. (空気の泡の作成を避けるため) に比較的ゆっくりと細胞懸濁液と注射器を埋める、管の壁に針の斜めのヒントを配置し、せん断オフ添付の細胞の原形質膜に急速に細胞懸濁液を追放します
   。
   4. 磨砕液 (約 3 μ L) の小さい因数とスライド ガラスに HB の 50 μ L に希釈します。ミックスし、ガラス基板でカバー。20 X、40 X 目的を搭載した位相差顕微鏡下で磨砕液を検査します
      。 注: 最適な条件の下で、ほとんどの細胞は壊れているが、暗い灰色として表示され、構造のラウンド、核はない ( 図 1).
   5. 3.7.3 とほとんどの細胞まで 3.7.4 手順を繰り返しますが壊れている; 通常、針を 3-6 上下ストロークが必要。タンパク質の定量ホモジネートの小さい因数 (10-30 μ L) を維持します
   。
8. G x 1,355 と 4 で 7 分間遠心分離機ホモジネート ° C
   注: 後遠心分離、(核ペレット; として定義されているペレットNP) は、核と上清 (postnuclear 清; として定義されている含まれています。PNS) には、細胞質と細胞小器官の均質化と無料の懸濁液のリリースが含まれています
。
9. は、慎重に PNS を収集します。タンパク質の定量 PNS と NP の小さい因数 (10-30 μ L) を維持し、NP を破棄します
。
10. は、1:1.1 率 PNS:62% ショ糖を用いた PNS で 62% ショ糖液を薄めて 40.6% ショ糖に PNS を調整します。空気泡を作成せず優しくが、徹底的をミックスします。屈折を用いたショ糖濃度を確認してください
。
11. は、40.6% ショ糖遠心管の下部に PNS を配置します。35% ショ糖溶液 2.5 mL を慎重にオーバーレイ、HB と遠心管を埋める
    。 メモ: インターフェイスが明確に表示されるようにスクロース溶液が層状必要があります
。
12. 超遠心機 ̴165, 000 x g と 4 で 1 時間勾配 ° C
13. は、グラデーション上に脂質の白い層を慎重に取り外します。次に、エンドソーム、HB とカット チップ 200 μ L ピペットを使用して、35% ショ糖を含むインターフェイスを収集します
    。 注: エンドソーム分数アクチンの重合 の in vitro アッセイ内で直接使用することができますまたはフラッシュ凍結液体窒素で氷の上避けようと-80 に格納されてすることができます ° C
14. は、PNS とエンドソーム分数のタンパク質濃度を測定します
    。 注: この濃度は、少なくとも 100 μ g/mL をする必要があります。少なくとも 100 μ g/mL と PNS を取得するための約 2.5 倍の 10 ⁷ セル 2 枚のペトリ皿の成長 (上記のメモを参照してください).

4。細胞質準備

注: 準備 2 シャーレ (直径 10 cm; 57 cm ²) 開始材料として合流の HeLa 細胞の。必要に応じて、細胞質は細胞 (すなわち RNAi や CRISPR/Cas9 を使用して) 利率や野生型または興味の蛋白質の突然変異体のフォームを過剰発現タンパク質の枯渇からも用意できます。氷にエンドソーム分別のプロトコルはすべての手順を実行します

1. 3.1 3.8、手順を繰り返します
。
2. 遠心管と ̴250, 000 x g と 4 の 45 分の超遠心機に PNS ° C
3. は、慎重に上に白い層を除去し、微粒体ペレットを乱すことがなく SN (細胞質分画) を収集します。タンパク質の定量細胞質分画の因数を維持します
   。 注: 細胞質のアクチンの重合 の in vitro アッセイ内で直接使用することができますまたはフラッシュ凍結液体窒素で氷の上避けようと-80 に格納されてすることができます ° C
4. は細胞質のタンパク質濃度を測定します
   。 メモ: それは、少なくとも 3 mg/mL をする必要があります
。

5。アッセイの測定エンドソーム依存性のアクチン重合 体外

注: エンドソーム依存性のアクチン重合は、2 つの代替方法を使用して実行できます。最初のアプローチでは、材料がテスト チューブに混合、固定と観察に転送、分析します。2 番目のアプローチは、ここで説明アッセイ イメージング室で直接実施されるとすることができます固定および分析できる力学的摂動 ( 図 2) なし。この 2 番目の方法でアッセイ混合物を観察するテスト チューブからは転送されませんし従って残物動じない、F-アクチン ネットワークが物理的に転送中に摂動の危険性を減少させます。さらに、この 2 番目の方法は、F アクチン重合の時系列解析と互換性が。どちらのアプローチに F アクチンの重合における差は認められなかったことに注意してください
。 注: 使用カット、プロトコル全体のヒント

。

試験管内
1. 優しくミックス冷たい精製 GFP-RAB5 エンドソーム (ステップ 3) 1:10 (タンパク) 冷たい 1.5 mL コニカル テスト チューブ内の比率で (ステップ 4) 細胞質と
2. です
   。 注: 典型的な実験を用いて実施される約 40-50 μ L.
3. は、1.5 mM MgOAc ₂ (x 貯蔵液 50 を使用して)、12.5 mM Hepes、125 mM (1 M KCl 原液を使用して) KCl の最終濃度に冷たい反応混合物を調整します。Leupeptin 10 mM、1 mM ペプスタチン A、および 10 ng/mL アプロチニンの最終濃度にプロテアーゼ阻害剤との混合物を調整します。優しくすべてのコンポーネントをミックスします
。
4. 振盪せずに 37 ° C で反応混合物を含むテスト チューブを置き、目的の時間インキュベートします
   。 注: 通常、それはエンドソームと広範なネットワークの形成のための 30 分でのアクチン重合を検出する約 3 分になります
。
5. 希望の時間に (すなわち、 3 分または 30 分)、氷上テスト チューブを配置することによって反作用を停止し、冷却の 3 %pfa 溶液 (vol:vol) の 1/10 を追加します
。
6. 共役重合のアクチンを染色する赤オレンジ色の色素に 200 単位/ml (~6.6 μ M) ファロイジンの 0.3:10 (vol:vol) を追加します
。
7. 12 の上に混合物の場所 12 μ μ PVA マイクロ ガラス スライドでメディアをマウント。18 x 18 mm ² ガラスの coverslipon トップを配置します
。
8. 共焦点顕微鏡によるサンプルを分析します
。
1. イメージングのチャンバー内
   1. 顕微鏡イメージング室使用、プラズマ クリーナー 1 分のラウンド 18 mm 径 coverslip とラウンド 35 φ 20 mm ガラス底装備ペトリ皿をきれいに (0.16 0.19 mm).
   2. では、ガラスに結合する蛋白質を最小限に抑えるために 20 分間の 1% の β-カゼインをきれいにされた表面を孵化させなさい。3 mM のイミダゾールで二回洗って
   。
   3. 追加エンドソームと細胞質、同じ冷却 1.5 mL の試験管に 5.1.1、5.1.2 の手順のように混合物を試金し、0.1 μ g/μ L ローダミン-アクチンとアッセイの混合物を補完します
   。
   4. 調整、最終的な屈折 1.375 (26.5% ショ糖) に混合物の 39% ショ糖液を使用しています
      。 メモ: 通常は、同じボリュームが追加されます。ただし、ショ糖濃度を若干変更実験から実験するので、糖度を使用して決定、フラクションのショ糖濃度に応じて経験的再調整する必要があります
   。
   5. 前処理 35 mm ディッシュ (ステップ 5.2.1) の混合物を置き、前処理 18 mm coverslip (ステップ 5.2.1) でそれをカバーします
   。
   6. を振ることがなく 37 ° C でチャンバーを配置します
   。
   7. 蛍光共焦点顕微鏡を用いたサンプルを分析します
   。

6。画像 Acシミュレーショ アクチン ネットワークの解析と

1. 画像
   1. は逆の走査型共焦点顕微鏡の画像を取得します
      。 注: 63 × 1.25 NA 石油目的と逆走査型共焦点顕微鏡の画像集録設定が最適化されました。良い信号対雑音比を達成するためにレーザー パワー (通常およそ 50%) を調整します
   。
2. アクチン ネットワークの定量化
   1. 蛍光顕微鏡を分析します。オープン ソース ソフトウェア CellProfiler (v2.1.1) ¹² を使用してアクチン エンドソームあたりの量を測定 (代替ソフトウェアを使用することができます)。
      1. は、最初に、GFP RAB5 信号を使用して、プライマリ オブジェクトとしてエンドソームを特定します。F-アクチン アクチン信号の伝搬を用いた個々 のエンドソームに関連付けられたを定量化 (赤オレンジ色素標識ファロイジン) セカンダリ オブジェクトとして
      。
      2. 平均条件を制御する各オブジェクトの関連するマテリアルの数を正規化と
      。

結果

F-アクチンのパッチを初期エンドソーム膜形成についての洞察を得るためには、図 2に示すプロトコルを追った簡単に言えば、細胞が GFP RAB5 を導入させたし、し、初期エンドソームは細胞レベル下の分別により作製しました。これらの精製された初期エンドソーム自体だけでなく、他の反応に関与の可能性の要因は、アクチンを提供するために?...

ディスカッション

アクチンは、エンドソーム膜ダイナミクス^4,14の重要な役割を果たしています。我々 はアクチン核形成と重合では、初期エンドソーム小 F アクチン パッチやネットワーク形成を報告しました。これら F アクチン ネットワークがを超えて分解経路に沿って早期エンドソーム膜輸送のため絶対に必要です。この核と重合プロセスのすべてのステップに?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	71380
KCl	Acros Organics	196770010
KH2PO4	AppliChem	A1042
Na2HPO4	Acros Organics	424370025
Hepes	AppliChem	A3724
Magnesiun acetate tetrahydrate	Fluka	63047
Dithiothreitol (DTT)	AppliChem	A2948
Imidazole	Sigma-Aldrich	10125
NaOH	Fluka	71690
Sucrose	Merck Millipore	107687
Leupeptin	Roche	11017101001
Pepstatin	Roche	10253286001
Aprotinin	Roche	10236624001
Paraformaldehide	Polysciences. Inc	380
Alexa Fluor 555 phalloidin	Molecular Probes	A34055
Actin rhodamine	Cytoskeleton. Inc	APHR-A
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich	81381	poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000
DABCO	Sigma-Aldrich	D-2522
Tris-HCl	AppliChem	A1086
β-casein	Sigma-Aldrich	C6905
Filter 0.22um	Millex	SL6V033RS
Round 10cm dishes for cell culture	Thermo Fisher Scientific	150350
Plastic Pasteur pipette	Assistent	569/3 40569003
15-ml polypropylen tube	TPP	91015
Hypodermic Needle 22G Black 30mm	BD Microlance	300900
Sterile Luer-slip 1ml Syringes without needle	BD Plastipak	300013
Micro glass slides	Assistent	2406
18X18-mm glass coverslip	Assistent	1000/1818
SW60 centrifuge tube	Beckman coulter	344062
TLS-55 centrifuge tube	Beckman coulter	343778
200-μl yellow tip	Starlab	S1111-0706
1000-μl Blue Graduated Tip	Starlab	S1111-6801
1.5-ml test tube	Axygen	MCT-175-C 311-04-051
18-mm diameter round coverslip	Assistent	1001/18
35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16-0.19 mm)	In vitro Scientific	D35-20-1.5-N
Refractometer	Carl Zeiss	79729
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Sorvall WX80 Ultracentrifuge	Thermo Fisher Scientific	46900
Tabletop ultracentrifuge	Beckman coulter	TL-100
SW60 rotor	Beckman coulter	335649
TLS-55 rotor	Beckman coulter	346936
Confocal microscopy	Carl Zeiss	LSM-780
Fugene HD transfection reagent	Promega	E2311
Protein assay reagent A	Bio-Rad	500-0113
Protein assay reagent B	Bio-Rad	500-0114
Protein assay reagent S	Bio-Rad	500-0115
Cell scraper	Homemade		Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps
Refractometer	Carl Zeiss
Minimum Essential Medium Eagle (MEM)	Sigma-Aldrich	M0643
FCS	Thermo Fisher Scientific	10270-106
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)	Thermo Fisher Scientific	11140-035
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030-024
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
pH Meter 691	Metrohm
ImageJ software			NIH, Bethesda MD