体外F-肌动蛋白在早期体的聚合

摘要

早期 endosome 功能依赖于 F-肌动蛋白聚合。在这里, 我们描述了一个 microscopy-based 的体外测定, 每天的核化和聚合的 f-肌动蛋白在早期内涵膜的试管, 从而呈现这一系列复杂的反应, 可生化和遗传操作.

摘要

许多早期的 endosome 功能, 特别是货物蛋白分选和膜变形, 依赖于内涵膜上有核的短的 f-肌动蛋白纤维的补丁。我们已经建立了一个 microscopy-based 的体外检测, 每天的核化和聚合的 f-肌动蛋白在早期内涵膜的试管, 从而呈现这一系列复杂的反应, 可遗传和生物化学操作.从表达早期内涵蛋白 GFP-RAB5 的细胞中浮选蔗糖梯度制备内涵分数。胞浆组分是由分离的细胞分批制备的。如果需要的话, 内涵和胞浆组分都可以在液氮中冷冻保存。在试验中, 内涵和胞浆组分混合, 在适当的条件下 (例如,离子强度, 还原环境) 在37° c 下孵育混合物。在所需的时间, 反应混合物是固定的, 和 f-肌动蛋白是揭示与笔。然后用荧光显微镜对肌动蛋白成核和聚合进行分析。在这里, 我们报告, 这种方法可以用来研究的作用, 涉及的因素, 在膜上的肌动蛋白成核, 或在随后的伸长, 分支, 或交联的 f-肌动蛋白丝。

引言

在更高的真核细胞中, 蛋白质和脂质被内化为早期的体, 在那里进行分类。一些蛋白质和脂质, 这是注定要利用, 被纳入到管状区域的早期体, 然后运到等离子膜或转移到高尔基体网络 (TGN)^1,2。相比之下, 其他的蛋白质和脂质被选择性地包装到早期体的区域, multivesicular 出现。这些地区扩展, 并在脱离早期内涵膜, 最终成熟成自由内涵载体囊泡或 multivesicular 体 (ECV/MVBs), 负责货物运输对晚体^{1, 2}。

肌动蛋白在与内涵分选能力和 endosome 生物相关的膜重塑过程中起着至关重要的作用。蛋白质的分类沿着回收途径的等离子膜或 TGN 取决于 retromer 复合物和相关的蛋白质。这种分拣机械似乎是耦合到回收小管通过相互作用的 retromer 复合体, 与黄蜂和疤痕同系物 (洗涤) 复杂和分支肌动蛋白^3,4,5.相反, 注定要降解的分子, 特别是活化的信号受体, 被分类成腔内囊泡 (ILVs) 的内涵分拣复合物所需的运输 (ESCRT)^{2,6, 7}。尽管肌动蛋白在 ESCRT 依赖性分选过程中可能扮演的角色尚不清楚, 但 F-肌动蛋白在 ECV/MVBs 的生物和早期体的运输中起着重要作用。特别是, 我们发现蛋白 A2 结合胆固醇丰富地区早期 endosome, 并与 spire1, 核 F-肌动蛋白聚合。在体上观察到的分支肌动蛋白网络的形成, 需要蛋白 (ARP) 2/3 复合体的分支活性, 以及蛋白质 moesin 和肌动蛋白结合蛋白 cortactin^8,9。

在这里, 我们描述了一个 microscopy-based 的体外测定, 每天的核化和聚合的 f-肌动蛋白在早期内涵膜的试管。该方法已被用于研究蛋白 A2 在 f-肌动蛋白成核和 moesin 和 cortactin 形成内涵肌动蛋白网络中的作用^8,9。通过这种体外协议, 在肌动蛋白聚合过程中体发生的一系列复杂反应, 可以对过程的顺序步骤进行生物化学和分子分析, 包括肌动蛋白成核、线性聚合、分枝和交联。

研究方案

1. 解决方案和准备工作

注意: 所有的缓冲区和解决方案都应在双 (dd) H ₂ O 中准备。由于蔗糖的水合状态不同, 所有蔗糖溶液的最终浓度必须用折射仪来确定.

1. 准备不含价阳离子的磷酸盐缓冲盐水 (PBS): 137 毫米盐、2.7 毫米氯化钾、1.5 mm ₂ PO ₄ 和 6.5 mm Na ₂ HPO ₄ 。调整 pH 值为7.4。灭菌 (1 循环在121和 #176; C 15 分钟) 和室温下贮存.
2. 准备 300 mM 咪唑的库存解决方案: 0.204 克咪唑在10毫升的 ddH ₂ o. 使用 HCl 将 pH 值调整为7.4 和 #176; c. 使用4和 #956 进行过滤灭菌; m 孔径过滤和存储在0.22 和 #176; c.
3. 准备均匀化缓冲液 (HB; 准备大约100毫升): 250 毫米蔗糖在3毫米咪唑。调整 ph 值为 7.4, 在4和 #176; C 使用 ph 计。使用0.22 和 #956 的过滤器灭菌; m 孔径过滤器和存储在4和 #176; c. 补充 HB 前与鸡尾酒的蛋白酶抑制剂在最后浓度对应于10毫米 leupeptin, 1 毫米 pepstatin a, 和 10 ng/毫升抑肽酶.
4. 为步骤浮选渐变, 准备 62%, 39%, 和35% 蔗糖溶液在3毫米咪唑, pH 7.4, 如下所述。使用折射仪精确确定所有蔗糖溶液的最终浓度.
   1. 在 3 mM 咪唑中制备100毫升62% 蔗糖溶液, pH 值7.4。通过搅拌80.4 克的蔗糖在 ddH ₂ O 5ml 到35和 #176; c. 添加1毫升的 300 mM 咪唑库存溶液, 并填充到100毫升与 ddH ₂ o. 将 pH 值调整为7.4 和 #176; c. 使用4和 #956 进行过滤灭菌; m 孔径过滤和贮存在4和 #176; C.
   2. 准备100毫升35% 蔗糖溶液在3毫米咪唑, pH 7.4。通过搅拌40.6 克的蔗糖在 ddH ₂ o. 添加1毫升的 300 mM 咪唑库存溶液和填充到100毫升与 ddH ₂ o. 将 pH 值调整为7.4 和 #176; c. 使用0.22 和 #956 的过滤器消毒; m 孔径过滤器, 存储在4和 #176; c.
   3. 准备50毫升39% 蔗糖在3毫米咪唑, pH 7.4。用35% 蔗糖溶液稀释62% 蔗糖溶液。存储在4和 #176; C.
5. 将3克甲醛 (粉煤灰) 通过100毫升的 PBS-5ml 搅拌到60和 #176; C 同时加入 1 M 氢氧化钠滴; 使用氢氧化钠将最终 pH 值调整到7.4。采用 0.22 #956; m 孔径过滤器和存储在-20 和 #176 上的过滤器灭菌; C.
   警告: 3% 粉煤灰是一种有毒试剂.
6. 准备1米氯化钾库存解决方案。在50毫升的 ddH 中搅拌3.73 克氯化钾, ₂ o. 使用0.22 和 #956 的过滤器灭菌; m 孔径过滤器和室温下贮存.
7. 准备50X 集中库存解决方案, 包含 0.625 M Hepes 在 pH 7.0 和 75 mM MgOAc ₂ 在 ddH ₂ o 分和存储在-20 和 #176; C.
8. 准备安装介质。混合搅拌2.4 克的聚 (乙烯醇) M _w 〜 3.1万 (PVA) 与6克甘油。添加6毫升的 ddH ₂ O, 并在室温下至少留2小时。添加12毫升0.2 米的三氯 (pH 8.5) 和热到约53和 #176; C 偶尔搅拌, 直到 PVA 溶解.
9. 在室温下用离心法在 5000 x g 中澄清溶液的20分钟。收集上清液, 并加入 2.5% (含/v) 14-环-[2.2. 2] 辛烷 (DABCO), 以防止荧光检测过程中的漂白。漩涡为大约三十年代溶化。分到1.5 毫升塑料管和存储在-20 和 #176; C.

2。单元格区域性

1. Dulbecco 和 #39 中的培养 HeLa 细胞, 补充了10% 胎小牛血清、10% 非必需氨基酸、10% l-谷氨酰胺和1% 青霉素-链霉素。保持在37和 #176; C 在 5% CO ₂ 孵化器中.
2. 染在实验前24小时 GFP-RAB5 ¹⁰ , 根据制造商和 #39 的说明使用商用转染试剂.
3. 当需要时, 准备内涵的分数和胞从一个感兴趣的蛋白质 (, 即, 使用 rna 干扰或 CRISPR/Cas9) 和/或表达野生或突变形式的兴趣蛋白的细胞.

3。内涵分数准备

注意: 本协议描述了包含体和其他光膜的亚细胞分数的直接制备。如果需要, 纯化的 endosome 分数也可以使用 ¹¹ 。准备2个培养皿 (10 厘米外径; 57 厘米 ² ), 将 GFP-RAB5 表达为起始物质的汇合细胞。2种培养皿中的汇合 HeLa 细胞总数大致相当于 2.5 x 10 ⁷ 细胞。当需要时, 体也可以从细胞中消耗的蛋白质的利益 ( 即, 使用 rna 干扰或 CRISPR/Cas9) 和/或表达的野生或突变形式的利益的蛋白质, 总是表达 GFP-RAB5.

警告: 分馏协议的所有步骤都应在冰上执行.

1. 将培养皿放置在一个扁平冰桶中的湿金属板上, 并立即用5毫升的 ice-cold PBS 清洗两次电池.
2. 删除所有 pbs-从最后一次洗涤和添加3毫升的 ice-cold pbs 每道菜。细胞在处理过程中不应干燥: 如有必要, 将冰桶放在摇摆平台上, 以充分地覆盖有液体的细胞.
3. 使用灵活的橡皮警察 ( 即, 自制的细胞刮板机) 从培养皿中机械地去除 PBS 中的细胞。在盘子的外面快速地、圆形的运动中先将这些细胞刮掉, 然后在盘子中间向下移动。轻轻地刮去获得和 #34; 床单和 #34; 附着的细胞。在冰上用一个15毫升的锥形聚丙烯管, 用一个塑料的巴斯德吸管轻轻地转移细胞.
4. 离心5分钟, 在 175 x g 和 4 #176; C.
5. 轻轻移除上清 (SN), 并在颗粒上加入 1-3 毫升的 HB。使用一个广泛的开放的塑料巴斯德吸管, 轻轻吸管向上和向下一次重的细胞.
6. 离心 7-10 分钟在 1355 x g 和4和 #176; c. 轻轻移除 SN.
7. 执行单元格均化.
   注意: 条件应温和, 使细胞膜的细胞被打破, 但体保持完整。
   1. 将已知的血红蛋白体积与蛋白酶抑制剂一起添加到每个细胞颗粒上 (大约100和 #956; 每细胞颗粒)。使用1000和 #181; 我微, 轻轻吸管向上和向下, 直到细胞悬浮。不要引入气泡.
   2. 准备一个1毫升结核菌素注射器与22G 针 pre-rinsed 与 HB 和没有空气或气泡.
   3. 将注射器与电池悬浮液相对缓慢地填充 (避免产生气泡), 将针的斜面尖端放在管壁上, 并迅速排出细胞悬浮液, 以剪切附着细胞的细胞膜.
   4. 取一小分匀浆 (大约3和 #181; l) 并将其稀释为50和 #181; 在玻璃滑梯上的 HB 的 l。用玻璃片。在装有20X 或40X 物镜的相衬显微镜下检查匀浆.
      注意: 在最佳条件下, 大多数单元格都是断开的, 但核 (显示为深灰色和圆形结构) 不是 ( 图 1 ).
   5. 重复步骤3.7.3 和 3.7.4, 直到大多数细胞被破坏; 通常, 3-6 up-and-down 中风通过针是必要的。将匀浆的小分 (10-30 和 #181; L) 用于蛋白质测定.
8. 离心匀浆7分钟在 1355 x g 和4和 #176; C.
   注: 离心后的颗粒 (定义为核颗粒;NP) 包含核和上清 (定义为 postnuclear 上清液;三七皂苷) 包含胞和细胞器释放后均匀化和自由悬浮.
9. 仔细收集期票。保持小等分 (10-30 和 #181; L) 的总皂苷和 np 的蛋白质测定和丢弃的 np.
10. 通过用 1:1. 1 的 PNS:62%sucrose 的比例来稀释62% 的蔗糖溶液, 将三七皂苷调节到40.6% 蔗糖。轻轻而彻底地混合, 不产生气泡。使用折射仪检查蔗糖浓度.
11. 将三七总皂苷放在离心管底部的40.6% 蔗糖中。仔细覆盖2.5 毫升的35% 蔗糖溶液和填充离心管与 HB.
    注: 蔗糖溶液应分层, 以便界面清晰可见.
12. Ultracentrifuge 1 小时 #160 的渐变; #820; 16.5万 x g 和4和 #176; C.
13. 小心地移除渐变顶部的白色层。接下来, 收集的接口含有体, 在 HB 和35% 蔗糖之间, 使用200和 #956; 我微的小费.
    注: 内涵分数可直接用于在 体外 肌动蛋白聚合法或可在冰上 aliquoted, 在液氮中闪光冷冻, 储存在-80 和 #176; C.
14. 确定三七总皂苷和内涵馏分的蛋白质浓度.
    注: 此浓度应至少100和 #181;在2培养皿中生长的大约 2.5 x 10 ⁷ 细胞需要获得至少100和 #181 的三七皂苷; g/毫升 (见上面的说明).

4。胞准备

注意: 准备2个培养皿 (10 厘米直径; 57 厘米 ² ) 以汇合的 HeLa 细胞为起始材料。当需要时, 胞也可以从细胞中消耗的蛋白质的利益 ( 即, 使用 rna 干扰或 CRISPR/Cas9) 和/或表达的野生或突变形式的利益蛋白。至于 endosome 分馏协议, 所有的步骤应该在冰上执行.

1. 重复步骤 3.1-3.8.
2. 将三七皂苷放在离心管中, ultracentrifuge 45 分钟, #820; 25万 x g 和4和 #176; C.
3. 小心移除顶部的白色层, 并收集 SN (胞分数) 而不干扰微粒颗粒。保持分的胞分数的蛋白质测定.
   注: 胞可直接用于 体外 肌动蛋白聚合测定, 或可在冰上 aliquoted, 在液氮中闪光冷冻, 贮存在-80 和 #176; C.
4. 确定胞的蛋白质浓度.
   注: 应至少3毫克/毫升.

5。测定 Endosome 依赖性肌动蛋白聚合的实验研究 在体外

注意: Endosome 依赖性肌动蛋白聚合可以使用两种替代方法进行。在第一种方法中, 将材料混合在试管中, 固定, 并转移到片并进行分析。在这里描述的第二种方法中, 该分析可以直接在成像室进行, 并且可以不受机械扰动 ( 图 2C ) 进行固定和解析。在第二种方法中, 化验混合物不从试管转移到片, 因此保持不动, 减少了在转移过程中身体扰动的 f-肌动蛋白网络的危险。另外, 这种第二种方法与对 F 肌动蛋白聚合的延时分析相一致。值得注意的是, 这两种方法均未观察到 F 型肌动蛋白聚合的分析差异.
注意: 在整个协议中使用剪切提示.

1. 在试管中
   1. 将 ice-cold 纯化的 GFP-RAB5 体 (步骤 3) 与胞 (步骤 4) 在 ice-cold 1.5 毫升锥形试管中的比例为 1:10 (蛋白质浓度).
      注: 一个典型的实验是进行约 40-50 和 #181; L.
   2. 将 ice-cold 反应混合物调整为125毫米氯化钾的最终浓度 (使用1米氯化钾溶液)、12.5 mm Hepes 和 1.5 mm MgOAc ₂ (使用50x 库存解决方案)。然后, 调整与蛋白酶抑制剂的混合物, 最终浓度为10毫米 leupeptin, 1 毫米 pepstatin A, 10 ng/毫升抑肽酶。轻轻地混合所有组件.
   3. 将含有反应混合物的试管放在37和 #176; C, 不摇晃, 并在所需时间内孵育.
      注: 一般情况下, 在体和30分钟内检测肌动蛋白聚合需要大约3分钟, 以形成一个广泛的网络.
   4. 在所需的时间 ( 即, 3 分钟或30分钟), 通过将测试管放置在冰上并添加 1/10 (卷: 卷) 的冷3% 粉煤灰溶液来停止反应.
   5. 添加 0.3:10 (卷: 卷) 200 单位/毫升 (〜6.6 和 #956; M) 笔共轭的红橙色染料染色的聚合肌动蛋白.
   6. 将12和 #956; 将混合物的 l 放到12和 #956 上; 在微玻片上的 PVA 安装介质的 l。将 18 x 18 mm ² 玻璃 coverslipon 顶部.
   7. 用共焦显微镜分析样品.
2. 在成像室
   1. 中制作显微成像室, 使用等离子清洗器1分钟清洁18毫米直径的圆形片和一个直径为 20 mm 玻璃底部 (0.16-0. 19 mm) 的圆形 35 mm 的培养皿.
   2. 用1% 和 #946 孵育清洗过的表面;-酪蛋白为20分钟, 以尽量减少蛋白质与玻璃的结合。用3毫米咪唑洗两次.
   3. 添加 endosome 和胞, 在与步骤5.1.1 和5.1.2 相同的测定混合物中, 在冷 1.5 mL 试管中加入0.1 和 #956 的检测混合物; g/#956;
   4. 使用39% 蔗糖溶液将混合物的最终折射率调整为 1.375 (26.5% 蔗糖).
      注意: 通常, 添加相同的卷;然而, 这必须是经验主义地调整取决于被收集的分数的蔗糖集中, 确定使用 refractomer, 因为蔗糖集中可能轻微地改变从实验到实验.
   5. 将混合物放在经过预处理的 35 mm 盘上 (步骤 5.2.1), 并将其与经过预处理的 18 mm 片 (步骤 5.2.1) 覆盖.
   6. 将会议厅放置在37和 #176; C, 不摇晃.
   7. 使用荧光共聚焦显微镜分析样品.

6。图像交流肌动蛋白网络的 quisition 与分析

1. 图像获取
   在反向扫描共聚焦显微镜上获取图像.
   1. 注: 图像采集设置优化的倒置扫描共聚焦显微镜与 63X 1.25 NA 油目标。调整激光功率 (通常为50% 左右), 以达到良好的信噪比.
   对肌动蛋白网络的
2. 量化
   1. 分析荧光显微。使用开源软件 CellProfiler (v2.1.1) ¹² 来测量每个 endosome 的肌动蛋白量 (可使用替代软件)。
      1. 首先, 使用 GFP-RAB5 信号将体标识为主要对象。然后, 用肌动蛋白信号 (红-橙染料共轭笔) 的传播作为辅助对象, 量化与单个体相关的 f-肌动蛋白.
      2. 将每个对象的关联材料的数量平均和规范化到控件条件.

结果

为了深入了解早期 endosome 膜上的 F 肌动蛋白补丁的形成, 我们遵循了图 2中概述的协议。简单地, 细胞被转染与 GFP-RAB5, 然后早期体是由亚单位分离制备的。这些纯化早期体的培养与胞, 以提供肌动蛋白本身以及其他因素可能涉及的反应。在潜伏期结束时, 通过固定的混合物停止反应。然后采集样品并在显微镜下沉积。最后, 笔 (图 3A

讨论

肌动蛋白在 endosome 膜动力学中起关键作用^4,14。我们以前报道, 肌动蛋白成核和聚合发生在早期体, 形成小的 f-肌动蛋白补丁或网络。这些 f-肌动蛋白网络是绝对需要的膜运输超越早期体沿降解途径。干扰此成核和聚合过程的任何步骤, 防止 endosome 成熟, 从而对后期的体 andlysosomes^9,11,15...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	71380
KCl	Acros Organics	196770010
KH2PO4	AppliChem	A1042
Na2HPO4	Acros Organics	424370025
Hepes	AppliChem	A3724
Magnesiun acetate tetrahydrate	Fluka	63047
Dithiothreitol (DTT)	AppliChem	A2948
Imidazole	Sigma-Aldrich	10125
NaOH	Fluka	71690
Sucrose	Merck Millipore	107687
Leupeptin	Roche	11017101001
Pepstatin	Roche	10253286001
Aprotinin	Roche	10236624001
Paraformaldehide	Polysciences. Inc	380
Alexa Fluor 555 phalloidin	Molecular Probes	A34055
Actin rhodamine	Cytoskeleton. Inc	APHR-A
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich	81381	poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000
DABCO	Sigma-Aldrich	D-2522
Tris-HCl	AppliChem	A1086
β-casein	Sigma-Aldrich	C6905
Filter 0.22 μm	Millex	SL6V033RS
Round 10 cm dishes for cell culture	Thermo Fisher Scientific	150350
Plastic Pasteur pipette	Assistent	569/3 40569003
15-mL polypropylen tube	TPP	91015
Hypodermic Needle 22G Black 30mm	BD Microlance	300900
Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle	BD Plastipak	300013
Micro glass slides	Assistent	2406
18 x 18-mm glass coverslip	Assistent	1000/1818
SW60 centrifuge tube	Beckman coulter	344062
TLS-55 centrifuge tube	Beckman coulter	343778
200-μL yellow tip	Starlab	S1111-0706
1,000-μL Blue Graduated Tip	Starlab	S1111-6801
1.5-mL test tube	Axygen	MCT-175-C 311-04-051
18-mm diameter round coverslip	Assistent	1001/18
35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm)	In vitro Scientific	D35-20-1.5-N
Refractometer	Carl Zeiss	79729
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Sorvall WX80 Ultracentrifuge	Thermo Fisher Scientific	46900
Tabletop ultracentrifuge	Beckman coulter	TL-100
SW60 rotor	Beckman coulter	335649
TLS-55 rotor	Beckman coulter	346936
Confocal microscopy	Carl Zeiss	LSM-780
Fugene HD transfection reagent	Promega	E2311
Protein assay reagent A	Bio-Rad	500-0113
Protein assay reagent B	Bio-Rad	500-0114
Protein assay reagent S	Bio-Rad	500-0115
Cell scraper	Homemade		Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps
Refractometer	Carl Zeiss
Minimum Essential Medium Eagle (MEM)	Sigma-Aldrich	M0643
FCS	Thermo Fisher Scientific	10270-106
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)	Thermo Fisher Scientific	11140-035
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030-024
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
pH Meter 691	Metrohm
ImageJ software			NIH, Bethesda MD