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요약

초기 endosome 함수 F 말라 합에 따라 달라 집니다. 여기, 우리가 설명 체 외에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 테스트 튜브에서 초기 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 따라서 반응의 복잡 한 시리즈가 생화학 및 유전 의무가 렌더링 조작입니다.

초록

많은 초기 endosome 기능, 특히 화물 단백질 정렬 및 막 변형, endosomal 막에 nucleated 짧은 F 걸 필 라 멘 트의 따라 달라 집니다. 우리는 설립 체 외에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 테스트 튜브에서 초기 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 따라서 의무가 유전 그리고 생 화 확 적인 반응의이 복잡 한 시리즈를 렌더링 조작입니다. Endosomal 분수 부양 초기 endosomal 단백질 GFP RAB5을 표현 하는 세포에서 자당 기온 변화도에 의해 준비 된다. Cytosolic 분수 셀의 별도 일괄 처리에서 준비 된다. Endosomal와 cytosolic 분수 저장할 수 있습니다 액체 질소에서 냉동 필요한 경우. 분석 결과, endosomal와 cytosolic 분수, 혼합 한 혼합물은 적절 한 조건 (예를 들어, 이온 강도, 감소 환경)에서 37 ° C에서 알을 품을. 원하는 시간에 반응 혼합물을 고정 하 고 F 걸 phalloidin로 드러났습니다. 말라 nucleation와 중 합 후 형광 현미경 검사 법에 의해 분석 된다. 여기, 우리는이 분석 결과 말라 nucleation 막, 또는 후속 신장, 분기, 또는 F 걸 필 라 멘 트의 가교에 관련 된 요인의 역할을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다 보고 합니다.

서문

높은 진 핵 세포, 단백질 및 지질 초기 endosomes 정렬이 발생 하는 위치에 내 면 됩니다. 일부 단백질과 지질, reutilized 될 운명, 초기 endosomes의 관 지역에 통합은 그리고 그 때 수송 된다 원형질 막 또는 trans Golgi 네트워크 (TGN)1,2. 대조적으로, 다른 단백질과 지질 선택적으로 multivesicular 모양을 전시 초기 endosomes의 지역에 포장 됩니다. 이 지역 확장 하 고, 초기 endosomal 막에서 분리, 시 무료 endosomal 캐리어 소포 또는 multivesicular 시체 (ECV/MVBs), 결국 성숙한는 늦은 endosomes1, 으로 화물 운송에 대 한 책임 2.

말라는 endosomal 정렬 용량과 endosome 속과 관련 된 막 개장 과정에서 중요 한 역할을 한다. 원형질 막 또는 TGN 재활용 경로 따라 정렬 단백질 복잡 한 retromer와 관련 된 단백질에 따라 달라 집니다. 이 정렬 기계 재활용 tubules 통해 상호 작용의 복잡 한, retromer의 말 벌 및 흉터 homologue (세척) 복잡 하 고 분기 말라3,4,5 형성에 결합 될 것 . 반면, 분자 저하에 대 한 운명, 특히 신호 수용 체 활성화, endosomal 단지 전송 (ESCRT)2,6,에 필요한 정렬 정렬할 intraluminal 소포 (ILVs)으로 7. ESCRT-종속 정렬 과정에서 말라의 가능한 역할을 알 수 없습니다 하는 동안 F-걸 ECV/MVBs의 속에 그리고 이른 endosomes 넘어 전송에 중요 한 역할을 재생 합니다. 특히, 우리 콜레스테롤 풍부한 지역 초기 endosome의 spire1 함께 바인딩합니다 annexin A2, F-말라 합 nucleates 발견. Endosomes에서 분기 말라 네트워크의 형성 필요 걸 관련 단백질 (ARP) 2/3의 분기 활동, 복합 음 단백질 moesin 고 말라-바인딩 단백질 cortactin8,9.

여기, 우리가 시험관에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 시험관에서 이른 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 설명 합니다. 이 분석 결과 이전 F-말라 nucleation에서 A2 annexin의 moesin 및 cortactin endosomal 걸 네트워크8,9의 형성에의 역할을 조사 하기 위해 사용 되었습니다. 이 생체 외에서 프로토콜 말라 합 동안 endosomes에 발생 하는 반응의 복잡 한 시리즈 될 걸 nucleation, 선형을 포함 하 여 과정의 순차적 단계의 생 화 학적 및 분자 분석에 순종 중 합, 분기, 고 가교입니다.

프로토콜

1. 솔루션 및

참고: 모든 버퍼 및 솔루션 이중 증 류 (dd) H 2 o.에에서 준비 되어야 한다 자당의 수 분 상태가 다르기 때문에 모든 자당 솔루션의 최종 농도 결정 되어야 합니다은 굴절 계를 사용 하 여.

Divalent 양이온 (PBS-) 없이
  1. 준비 인산 염 버퍼 염 분: 137 m NaCI m, 2.7 m KCl m, 1.5 m m KH 2 포 4 및 6.5 m m 나 2 HPO 4. PH 7.4에 조정 합니다. 압력가 마로 소독 (1 개 주기 121 ° C에서 15 분)으로 소독 하 고 상 온에서 저장.
  2. 이미 300 mM의 재고 솔루션을 준비: ddH 2 O.Adjust HCl. 여과기 소독 0.22 μ m를 사용 하 여 사용 하 여 4 ° C에서 7.4에 pH 크기 필터 기 공 및 4에서 저장의 10 mL에 이미의 0.204 g ° c.
  3. 준비 균질 버퍼 (HB; 준비 약 100 mL): 250 m m 3 m m 이미에 자당. PH 미터를 사용 하 여 4 ° C에서 7.4에 pH를 조정 합니다. 필터-0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 소독 하 고 4에서 저장 protease 억제제 10 m m leupeptin, 1 mM pepstatin A, 및 10 ng/mL aprotinin에 해당 하는 최종 농도에서 칵테일 ° C. 보수는 HB 사용 직전.
  4. 단계 부양 그라디언트에 대 한 준비 62%, 39%, 및 35% 자당 해결책 3mm 이미, pH 7.4, 아래 설명 된 대로. 굴절 계를 사용 하 여 모든 자당 솔루션의 최종 농도 정확 하 게 결정.
  5. 준비 100 mL 3 m m 이미, pH 7.4에에서 62% 자당 해결책의
      . DdH 2 O 80.4 g 자당의 감동에 의해 해산 사전 예 열 300mm 이미 재고 솔루션 및 ddH 2 O. 조정 100 mL를 채우기의 35 ° C. 추가 1 mL에 pH 7.4 4 ° C. 필터 소독 0.22 μ m 기 공 크기 필터 및 저장소를 사용 하 여 4 ° c.에
    1. 이미 3 m m, pH 7.4에에서 35% 자당 해결책의 100ml 준비합니다. 40.6 g 300 밀리미터 이미 재고 솔루션의 ddH 2 오 추가 1 mL에 자당의 감동에 의해 해산 하 고 ddH 2 O. 조정 100 mL에 pH 7.4 4 ° C. 필터를 소독을 사용 하 여 0.22 μ m 기 공 크기 필터와 4에 저장를 채우기 ° c.
    2. 이미 3 m m, pH 7.4에에서 39% 자당의 50 mL를 준비합니다. 35% 자당 해결책으로 62% 자당 해결책을 희석. 4 ° c.에 게
  6. Paraformaldehyde (PFA)의 3 세대 dropwise 1 M NaOH를 추가 하는 동안 60 ° C에 100 ml의 PBS-사전 warmed 감동에 의해 해산, NaOH를 사용 하 여 7.4에 최종 pH를 조정. 필터 소독 0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 및 저장-20 ° c.
    주의: 3 %PFA 독성 시 약.
  7. 1 M KCl 준비 재고 솔루션입니다. DdH 2 O. 필터 소독 0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 50 mL에 감동 하 여 KCl의 3.73 g을 녹이 고 상 온에서 저장.
  8. 준비 50 X 집중 재고 솔루션-20에서 ddH 2 오 약 수 및 저장소에 pH 7.0과 75 mM MgOAc 2에 0.625 M Hepes 포함 ° c.
  9. 준비 설치 미디어입니다. 글리세롤의 6 g 2.4 g poly(vinyl alcohol) M w ~ 31000 (PVA)의 교 반에 의해 혼합. DdH 2 O 6 mL을 추가 하 고 실 온에서 2 h 이상 떠나. 추가 12 mL 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5)와 약 53 ° c는 PVA 해산 했다 때까지 가끔 저 어 열.
  10. 실 온에서 20 분 동안 5000 x g에서 원심 분리 하 여 솔루션을 명확히합니다. 상쾌한을 수집 하 고 2.5% (w/v) 1, 4 추가-diazabicyclo-[2.2.2] 옥 탄 (DABCO) 형광 탐지 동안 photobleaching를 방지 하기 위해. 약 30 소용돌이 해산 s. Aliquot 1.5 mL 플라스틱 튜브와 스토어-20 ° c.

2. 세포 배양

  1. 문화 헬러 셀 Dulbecco ' s 10% 태아 종 아리 혈 청, 10% 비 본질적인 아미노산, 보완 수정이 글 중간 10 %L-글루타민, 및 1% 페니실린-스. 37 ° c 5% CO 2 배양 기에서 그들을 유지 하는 것.
  2. Transfect 세포 GFP RAB5 10, 제조 업체에 따라 상업 transfection 시 약을 사용 하 여 실험 하기 전에 24 시간 ' s 지침.
  3. 필요할 때, 준비 endosomal 분수와 셀 (즉, RNAi 또는 CRISPR/Cas9를 사용 하 여) 관심의 관심사의 단백질의 돌연변이 또는 wildtype 형태 overexpressing 단백질의 고갈에서 cytosol.

3. Endosomal 분수 준비

참고: endosomes 및 다른 가벼운 막 subcellular 분수의 간단한 준비가이 프로토콜에 설명 합니다. 필요한 경우, 순화 된 endosome 분수는 사용된 11 수 있습니다. GFP RAB5 시작 물자로 표현 confluent 셀 2 접시 (10 cm 외경; 57 c m 2)를 준비 합니다. 2 접시에 confluent HeLa 세포의 총 수는 대략 2.5 x 10 7 셀에 해당합니다. 때, 필요는 endosomes 또한 준비 될 수 있다 세포 관심 (즉, RNAi 또는 CRISPR/Cas9를 사용 하 여) 그리고/또한 관심사의 단백질의 돌연변이 또는 wildtype 형태 overexpressing, 항상 표현 GFP-RAB5의 단백질의 고갈에서.

주의: 얼음에 분별 법 프로토콜의 모든 단계를 수행 해야

  1. 평평한 얼음 양동이에 젖은 금속 접시에 배양 접시를 놓고 즉시 두 번의 얼음 처럼 차가운 PBS-5 mL로 세포 세척.
  2. 모든 PBS-마지막 세척에서 제거 하 고의 얼음 처럼 차가운 PBS-접시 당 3 mL를 추가 합니다. 셀 처리 동안 건조 하지 한다: 필요한 경우 적절 하 게 커버 액체와 셀 락 플랫폼에 얼음 양동이 놓습니다.
  3. 는 기계적으로 유연한 고무 경찰관 (즉, 직접 만든 셀 긁는 도구)를 사용 하 여 배양 접시에서 PBS에서 셀을 제거 합니다. 빠르고, 원형 모션 접시, 접시 중간 하강 운동 뒤의 외부 주위에 먼저 요리에서 세포를 다쳤어요. 부드럽게 긁어 " 시트 " 연결 된 세포의. 부드럽게 얼음에 15 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 넓은 개방으로 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 셀을 전송
  4. 175 x g에 5 분 동안 원심 분리기와 4 ° C
  5. 부드럽게 상쾌한 (SN)을 제거 하 고 펠 릿에 HB의 1-3 mL를 추가 합니다. 넓은 개방으로 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 플라스틱 아래로 한 번 셀 resuspend 하.
  6. X g와 4 ° C. 부드럽게 제거 SN 1,355에서 7-10 분 동안 원심 분리기.
  7. 셀 균질 수행.
    참고: 조건 해야 부드러운 셀의 플라즈마 막 끊어집니다는 endosomes 그대로 남아 있도록 합니다.
  8. 추가 각 셀 펠 릿 (약 100 μ 셀 펠 릿 당)에 protease 억제제와 HB의 알려진된 볼륨
      . 사용 하 여 1000 µ L micropipette, 부드럽게 플라스틱 아래로 셀 resuspended 때까지. 안 함 공기 방울을 소개.
    1. 1 mL 투베르쿨린 주사기 22 G 바늘 HB와 미리 씻어 서와 공기 또는 거품의 무료 준비.
    2. 주사기 셀 서 스 펜 션 상대적으로 천천히 ()을 피하기 위해 공기 방울을 만드는, 튜브의 벽에 바늘의 경사진된 끝 배치를 신속 하 게 연결 된 셀의 플라즈마 막에서 전단에 세포 현 탁 액을 추방.
    3. 는 Homogenate (약 3 µ L)의 작은 약 수를가지고 고 유리 슬라이드에 HB의 50 µ L로 희석. 혼합 그리고 덮개 유리 coverslip로. Homogenate X 20 또는 40 X 목표 단계 대조 현미경 검사.
      참고: 최적의 조건에서 대부분의 세포는 고장, 하지만 핵, 어두운 회색으로 표시 하 고 라운드 구조, ( 그림 1).
    4. 반복 단계 3.7.3 대부분 셀까지 3.7.4 깨집니다; 일반적으로 3-6는 바늘을 통해 위아래 선 필요 하다. 단백질 결정에 대 한 homogenate의 작은 약 수 (10-30 µ L) 유지.
  9. 1,355 g x 4에서 7 분 동안 원심 분리기 homogenate ° c.
    참고: 후 원심 분리, 펠 릿 (핵 펠 릿;로 정의 핵 및 (postnuclear 상쾌한;으로 정의 하는 상쾌한 NP) 포함 PNS)는 cytosol와 균질 그리고 무료에 출시 세포 포함.
  10. 신중 하 게 PNS를 수집합니다. 단백질을 위한 PNS와 NP의 작은 aliquots (10-30 µ L)를 유지 하 고 삭제는 NP.
  11. 는 PNS PNS:62% 자당의 1:1.1 비율을 사용 하 여 함께 62% 자당 해결책을 diluting 하 여 40.6% 자당을 PNS를 조정 합니다. 공기 거품을 만들지 않고 부드럽게 하지만, 철저 하 게 혼합. 자당 농도 굴절 계를 사용 하 여 확인 하십시오.
  12. 는 Ultracentrifugation 튜브의 하단에 40.6% 자당에서 PNS를 놓습니다. 신중 하 게 35% 자당 해결책의 2.5 mL와 오버레이 및 HB 원심 분리기 튜브 채울.
    참고: 인터페이스는 명확 하 게 볼 수 있도록 계층 되어야 한다 자당 솔루션.
  13. Ultracentrifuge ̴165, 000 x g 4에서 1 시간에 대 한 그라디언트 ° c.
  14. 신중 하 게 지질 그라데이션 위에 흰색 레이어를 제거합니다. 다음, HB와 200 μ micropipette 컷된 팁을 사용 하 여 35% 자당 사이 endosomes를 포함 하는 인터페이스를 수집.
    참고: endosomal 분수 체 외에서 말라 합 시험에서 직접 사용할 수 있습니다 또는 얼음, 액체 질소, 플래시 동결에 aliquoted 그리고-80에 저장 될 수 있습니다 ° c.
  15. PNS와 endosomal 분수의 단백질 농도 결정.
    참고:이 농도 적어도 100 µ g/mL 해야 합니다. 적어도 100 µ g/mL와 PNS를 약 2.5 x 10 7 셀 2 페 트리 접시에 성장 필요 (위의 참고 참조).

4. Cytosol 준비

참고: 준비 2 접시 (10 cm 직경; 57 cm 2) 시작 물자로 confluent HeLa 세포의. 필요할 때는 cytosol 셀 (즉, RNAi 또는 CRISPR/Cas9를 사용 하 여) 관심 wildtype 또는 관심사의 단백질의 돌연변이 형태를 overexpressing의 단백질의 고갈에서 준비 또한 수 있습니다. Endosome 분별 프로토콜에 관해서는 얼음에 모든 단계를 수행

  1. 반복 단계 3.1-3.8.
  2. PNS는 원심 분리기와 ultracentrifuge ̴250, 000 x g, 4 시 45 분에 대 한 배치 ° c.
  3. 신중 하 게 위에 흰색 레이어를 제거 하 고 microsome 펠 렛을 방해 하지 않고 SN (cytosol 분수)를 수집 합니다. 단백질을 위한 cytosol 분수의 약 수를 유지.
    참고:는 cytosol 생체 외에서 말라 합 시험에서 직접 사용할 수 있습니다 또는 얼음, 액체 질소, 플래시 동결에 aliquoted 그리고-80에 저장 될 수 있습니다 ° c.
  4. 는 cytosol의 단백질 농도 결정.
    참고: 3 mg/mL 이상 이어야 한다.

5. 시험 측정 Endosome 종속 말라 합 체 외에서

참고: Endosome 종속 말라 합 두 가지 대체 방법을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 첫 번째 접근 방법에서 자료는 테스트 튜브에 혼합, 고정 및는 coverslip로 전송 하며 분석 여기서 설명 하는 두 번째 방법은에서 분석 결과 수 이미징 챔버에 직접 실시 하 고 고정 고 기계적 섭 동 ( 그림 2C) 없이 분석. 이 두 번째 방법에서는, 분석 결과 혼합 하는 coverslip 테스트 튜브에서 전송 되지 않습니다 그리고 이렇게 교란, F-말라 네트워크 전송 하는 동안 물리적으로 교란 되 고의 위험을 감소 남아 있습니다. 또한,이 두 번째 방법은 F 걸 중의 시간 경과 분석와 호환 됩니다. 어느 방식으로 F-말라 합 분석에 차이가 관찰 했다에 주목 한다.
참고: 사용 하 여 잘라 프로토콜에 걸쳐 팁.

    에 테스트 튜브에
    1. 부드럽게 혼합 차가운 순화 GFP RAB5 endosomes (3 단계)는 얼음 처럼 차가운 1.5 mL 원뿔 테스트 튜브에 (단백질 농도)를 1시 10분의 비율로 cytosol (4 단계)와
    2. .
      참고: 일반적인 실험은 실시 약 40-50 µ L.
    3. 125 m m KCl (1 개 M KCl 재고 솔루션을 사용 하 여), 12.5 mM Hepes, 및 1.5 m m MgOAc 2 (재고 솔루션 x 50를 사용 하 여)의 최종 농도에 얼음 처럼 차가운 반응 혼합물을 조정 합니다. 다음, 10 m m leupeptin, 1 m m pepstatin, 그리고 10 ng/mL aprotinin의 최종 농도 protease 억제제와 혼합을 조정 합니다. 모든 구성 요소를 부드럽게 혼합.
    4. 테스트 튜브 없이 떨고, 37 ° C에서 반응 혼합물을 포함 하 고 원하는 시간에 품 어.
      참고: 일반적으로, 그것을 감지 말라 합 endosomes와 광범위 한 네트워크의 형성에 대 일 분에 약 3 분.
    5. 원하는 시간에 (즉, 3 분 또는 30 분), 얼음에 테스트 튜브를 배치 하 여 반응을 중지 하 고 precooled 3 %PFA 솔루션의 1/10 (vol:vol) 추가.
    6. Polymerized 말라 얼룩 레드 오렌지 염색에 활용 된 200 단위/mL (~6.6 μ M) phalloidin의 0.3:10 (vol:vol) 추가.
    7. 12에 혼합물의 장소 12 μ μ 마이크로 유리 슬라이드에 PVA 장착 매체의. 18 x 18 m m 2 유리 coverslipon 상단에 넣어.
    8. Confocal 현미경 검사 법으로 샘플 분석.
  1. 이미징 챔버에
    1. 현미경 이미징 챔버를 사용 플라즈마 청소기 1 분 라운드 18 m m 직경 coverslip 및 라운드 35 m m 직경 20 m m 유리 바닥을 갖춘 페 트리 접시를 청소 (0.16 0.19 m m).
    2. 1% β-카 세 인 단백질 바인딩 유리를 최소화 하기 위해 20 분에 있는 청소 표면 품 어. 3mm 이미와 두 번 세척.
    3. 추가 endosome 고 cytosol, 같은 단계 5.1.1, 5.1.2, precooled 1.5 mL 테스트 튜브에서 혼합물 분석 결과 분석 결과 혼합물 0.1 μ g/μ rhodamine-걸을 보완.
    4. 최종 굴절률 1.375 (26.5% 자당) 혼합물의 39% 자당 해결책을 사용 하 여 조정.
      참고: 일반적으로, 동일한 볼륨 추가 됩니다; 그러나, 이것은 경험적으로 다시 자당 농도 약간 실험에서 실험을 변경 될 수 있습니다 이후는 refractomer를 사용 하 여 결정 하는 수집 된 분수의 자당 농도에 따라 조정 되어야 합니다.
    5. 청소용된 35 m m 접시 (5.2.1 단계)에 혼합물을 놓고 청소용된 18 m m coverslip (5.2.1 단계)으로 커버.
    6. 동요 없이 37 ° C에서 챔버 장소.
    7. 형광 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 샘플 분석.

6. 이미지 Acquisition 및 분석의 말라 네트워크

  1. 이미지 수집
    1. 거꾸로 스캔 confocal 현미경에서 이미지를 수집.
      참고: 이미지 수집 설정 63 X 1.25 나 오일 목적으로 거꾸로 스캔 confocal 현미경에 최적화 했다. 좋은 신호 대 잡음 비율을 달성 하기 위해 레이저 전원 (일반적으로 약 50%)을 조정.
  2. 말라 네트워크의 정량화
    1. 형광 현미경 분석. Endosome 당 걸의 양을 측정 하는 opensource 소프트웨어 CellProfiler (v2.1.1) 12를 사용 하 여 (대체 소프트웨어를 사용할 수 있습니다).
      1. 먼저, GFP RAB5 신호를 사용 하 여 기본 개체 endosomes 식별. 그런 다음 F-말라 말라 신호 전파를 사용 하 여 개별 endosomes와 관련 된 계량 (레드 오렌지 염색 활용 Phalloidin) 보조 개체로.
      2. 평균 제어 조건에 각 개체에 대 한 관련된 자료의 수를 정규화.

결과

초기 endosome 막에 F 걸 패치의 형성에 대 한 통찰력을 얻으려면, 우리 그림 2에 설명 된 프로토콜을 따 랐 다. 간단히, 셀 GFP RAB5와 페 했다 고 초기 endosomes subcellular 분류에 의해 준비 되었다. 이러한 정화 초기 endosomes 자체 뿐만 아니라 다른 요인 가능성이 반응에 관련 된 걸 수 있도록 cytosol와 인 큐베이 팅 했다. 잠복기의 끝에, 반응 혼합물의 고정에 ?...

토론

말라는 endosome 막 역학4,14에서 중요 한 역할을 한다. 우리 이전 보고 말라 nucleation 및 중 합 초기 endosomes에 발생 작은 F 걸 패치 또는 네트워크 형성. 이러한 F-말라 네트워크는 초기 endosomes 저하 통로 넘어 막 전송 절대적으로 필요 합니다. 이 nucleation 및 중 합 프로세스의 어떤 단계에서 방해 endosome 성숙 및 따라서 늦은 endosomes andlysosomes9...

공개

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 말

스위스 국립 과학 재단;에서 지원 받은 스위스 Sinergia 프로그램; 폴란드어-스위스 연구 프로그램 (PSPB-094/2010); 화학 생물학; NCCR 그리고 스위스 SystemsX.ch 이니셔티브에서 LipidX (J. G.)에 스위스 국립 과학 재단에 의해 평가. O. M. EMBO 장기 친교 (ALTF-516-2012)에 의해 지원 되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
NaClSigma-Aldrich71380
KClAcros Organics196770010
KH2PO4AppliChemA1042
Na2HPO4Acros Organics424370025
HepesAppliChemA3724
Magnesiun acetate tetrahydrateFluka63047
Dithiothreitol (DTT)AppliChemA2948
ImidazoleSigma-Aldrich10125
NaOHFluka71690
SucroseMerck Millipore107687
LeupeptinRoche11017101001
PepstatinRoche10253286001
AprotininRoche10236624001
ParaformaldehidePolysciences. Inc380
Alexa Fluor 555 phalloidinMolecular ProbesA34055
Actin rhodamineCytoskeleton. IncAPHR-A
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich81381poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 
DABCOSigma-AldrichD-2522
Tris-HClAppliChemA1086
β-caseinSigma-AldrichC6905
Filter 0.22umMillex SL6V033RS
Round 10cm dishes for cell cultureThermo Fisher Scientific150350
Plastic Pasteur pipetteAssistent569/3 40569003
15-ml polypropylen tube TPP91015
Hypodermic Needle 22G Black 30mm BD Microlance300900
Sterile Luer-slip 1ml Syringes without needleBD Plastipak300013
Micro glass slides Assistent2406
18X18-mm glass coverslipAssistent1000/1818
SW60 centrifuge tubeBeckman coulter344062
TLS-55 centrifuge tubeBeckman coulter343778
200-μl yellow tipStarlabS1111-0706
1000-μl Blue Graduated TipStarlabS1111-6801
1.5-ml test tubeAxygenMCT-175-C 311-04-051
18-mm diameter round coverslip Assistent1001/18
35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16-0.19 mm) In vitro ScientificD35-20-1.5-N
RefractometerCarl Zeiss79729
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-32G
Sorvall WX80 UltracentrifugeThermo Fisher Scientific46900
Tabletop ultracentrifugeBeckman coulterTL-100
SW60 rotorBeckman coulter335649
TLS-55 rotorBeckman coulter346936
Confocal microscopyCarl ZeissLSM-780
Fugene HD transfection reagentPromegaE2311
Protein assay reagent ABio-Rad500-0113
Protein assay reagent BBio-Rad500-0114
Protein assay reagent SBio-Rad500-0115
Cell scraperHomemadeSilicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps
RefractometerCarl Zeiss
Minimum Essential Medium Eagle (MEM)Sigma-AldrichM0643
FCSThermo Fisher Scientific10270-106
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)Thermo Fisher Scientific11140-035
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific25030-024
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140-122
pH Meter 691Metrohm
ImageJ softwareNIH, Bethesda MD

참고문헌

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