خلية يعيش "قياس الرائحة مستقبلات التنشيط باستخدام" مقايسة مخيم في الوقت الحقيقي

Summary

وصف وظيفة مستقبلات الرائحة يخدم جزءا لا غنى عنه في عملية ديورفانيزيشن. يصف لنا طريقة لقياس تنشيط مستقبلات الرائحة في الوقت الحقيقي باستخدام مقايسة مخيم.

Abstract

أحجام ضخمة من الأسر (أو) مستقبلات الرائحة الثدييات صعوبات للعثور على يغاندس المشابهة بين العديد من المواد الكيميائية المتطايرة. بكفاءة ودقة ديورفانيزي أملاح الإماهة الفموية، ونحن الجمع بين استخدام خط الخلية مغايرة للتعبير عن الثدييات أملاح الإماهة الفموية وبلازميد biosensor معدلة وراثيا لقياس إنتاج المخيم المصب أو التنشيط في الوقت الحقيقي. يمكن استخدام هذا التحليل للشاشة odorants ضد أملاح الإماهة الفموية، و العكس بالعكس. يمكن تأكيد التفاعلات مستقبلات الرائحة من على شاشات في وقت لاحق عن طريق اختبار ضد مختلف رائحة تركيزات، توليد منحنيات التركيز-استجابة إيجابية. هنا استخدمنا هذا الأسلوب لإجراء فرز الفائق مجمع معطر ضد بشرية أو مكتبة المعرب عنها في الخلايا Hana3A وأكدت أن مستقبلات ردا إيجابيا من مستقبلات المشابهة لمجمع الفائدة. وجدنا هذا الأسلوب الكشف عن الفائق لتكون فعالة وموثوق بها في تقييم أو التنشيط وتقديم البيانات المتوفرة لدينا مثال على إمكانية استخدامها في الدراسات الفنية أو.

Introduction

حاسة الشم دوراً هاما في بقاء الحيوانات كما أنهم يعتمدون على قدراتهم حاسة الشم للحصول على الغذاء وتجنب الحيوانات المفترسة وخطر، والتمييز بين الأنواع وحدد ماتي^1،2. ويتوقف تحقيق هذه المهام على مستقبلات الرائحة (أملاح الإماهة الفموية)، التي يتم التعبير عنها على حدة على السطح الهدبية الخلايا العصبية الحسية حاسة الشم (أوسنس) الواقعة في ظهارة حاسة الشم (عمر الفاروق). أملاح الإماهة الفموية تشكل أكبر عائلة من فوق مستقبلات (GPCR) ز-البروتين إلى جانب عائلة مع حوالي 400 و 1200 الجينات أو متنوعة في الإنسان والفأر، على التوالي^3،4،5. تؤدي إلى زيادة مستويات المخيمات داخل الخلايا عن طريق تنشيط حاسة الشم ز-البروتين (ز_{جبهة تحرير أورومو}) متسلسلة أملاح الإماهة الفموية تفعيلها من خلال أودورانتس واكتب الثالث adenylyl cyclase (أسييي). زيادة مستوى الناتج من مخيم داخل الخلايا يمكن أن تعمل كثاني رسول، الذي يفتح بوابات النوكليوتيدات القناة على سطح الخلية، أدى تدفق الاتصالات بما في ذلك Ca^{2 +} وإمكانات العمل، والشروع في نهاية المطاف الإرسال العصبية ذات الإمكانات وتصور حاسة الشم. ويعتبر عملية كشف وتمييز عدد كبير من أودورانتس من أملاح الإماهة الفموية كخطوة أولى لتصور حاسة الشم^6،7.

منذ أكسل وباك⁸ أولاً بنجاح استنساخ مستقبلات الرائحة وتوضيح الآلية التي تصور حاسة الشم التي بدأتها أملاح الإماهة الفموية، ديورفانيزيشن الأسرة أو أصبحت واحدة من النقاط الفعالة في هذا المجال. وكانت أساليب مختلفة في فيفو فيفو السابقين و في المختبر لقياس التنشيط أو المبلغ عنها^9،10،،من¹¹¹². طريقة تقليدية التي تستخدم Ca^{2 +} تصوير تليها RT-PCR خلية واحدة في أوسنس تمكين تحديد مختلف أملاح الإماهة الفموية إلى odorants الاليفاتيه^13،،من¹⁴¹⁵. في الآونة الأخيرة، ظهور تحليلات واسعة النطاق الترنسكربيتوم تشجع على تطوير أساليب أكثر الفائق في فيفو . وحددت المقايسة كنتاكي الماوس استجابة الاوجينول ومسكون أملاح الإماهة الفموية باستخدام S100a5-تاوجفب مراسل الماوس ميكرواري والإجهاد تحليل⁹. استناداً إلى انخفاض مستويات مرناً أو بعد التعرض الرائحة، توظيف التكنولوجيا حلم نهج ترانسكريبتوميك لتحديد ملامح التنشيط أو في كلا الأنواع الفقارية وغير فقاريات¹⁶. وبالمثل، ونظرا الفسفرة S6 في تفعيل الخلايا العصبية، ماتسونامي المجموعة مرناس متسلسلة من الريبوسوم فوسفوريلاتيد إيمونوبريسيبيتيشنز لتحديد استجابة أملاح الإماهة الفموية¹². وأخيراً، أفاد فريق اينشتاين الشم سوبر الفئران التي يمكن أن تخدم كمنصة لدراسة رائحة الترميز في فيفو، المعروفة باسم التكنولوجيا موسينسور¹⁷.

في عالم في المختبر ، يجعل التحدي المتمثل في استزراع أوسنس تعبير مغايرة نظام يحاكي أو التعبير الوظيفي في فيفو حلاً مثاليا لإجراء الفرز على نطاق واسع من المواد الكيميائية معطر لأملاح الإماهة الفموية. على الرغم من ذلك، نظراً لخطوط الخلايا المستزرعة من أصول غير حاسة الشم تختلف عن أوسنس الأصلي، أو يتم الاحتفاظ بالبروتينات في هيولى وغير قادر على الحركة إلى غشاء البلازما، مما أدى إلى تدهور أو وفقدان وظيفة مستقبلات^{18 , 19}-قد بذلت لحل هذه المشكلة، يعمل واسعة النطاق لتكرار التعبير الوظيفي أو على غشاء الخلية في خطوط الخلايا مغايرة. كراوتوورست et al. أولاً يعلق الأحماض الأمينية أول 20 من رهودوبسن (رو--علامة) إلى N--المحطة الطرفية أو البروتين وهذا تشجيع التعبير سطح الخلية لبعض أملاح الإماهة الفموية في خلايا الكلي الجنينية البشرية (HEK)²⁰. بإجراء تحليل الجينات التعبير (سيج) مكتبة التحليل من أوسنس واحدة، لمسلسل سايتو وآخرون. أولاً استنساخ أفراد الأسرة تنقل مستقبلات البروتين (RTP) RTP1 و RTP2 والتعبير مستقبلات البروتين محسن 1 (REEP1) التي سهلت أو الاتجار بغشاء الخلية وتعزيز الاستجابات الرائحة بوساطة من أملاح الإماهة الفموية في الخلايا HEK293T ²¹. وبناء على هذه النتائج، ماتسونامي مجموعة نجحت في إنشاء خط الخلية Hana3A، ستابلي transfected مع RTP1، RTP2، REEP1، و Gα_{جبهة تحرير أورومو} في HEK293T، وعابر transfected مع أملاح الإماهة الفموية معلم رو، لكفاءة أو الوظيفية التعبير. اللاحقة كشفت الدراسات 1) نموذج أقصر من RTP1، RTP1S، التي يمكن أن تعزز أكثر قوة أو تعمل من البروتين RTP1 الأصلي و 2) مستقبلات أستيل المسكارينيه النوع 3 (M3R) التي يمكن أن تعزز النشاط أو عن طريق تثبيط β-أرريستين-2 التوظيف، التي أدخلت إلى نظام تعبير مغايرة لتحسين التجريبية إخراج^22،23.

وقد استخدمت عدة أساليب الكشف التحديد الكمي لتنشيط مستقبلات في أنظمة مغايرة. يعمل الإنزيم يفرز الفوسفاتيز القلوية المشيمية (السكرتارية) مع مراسل إنزيم ترانسكريبتيونالي وينظم المخيم استجابة العناصر (كريس)، يجعلها خياراً جذاباً لتقييم أو التنشيط. يتم الكشف عن الأسفار سهولة في عينة من المتوسط الثقافة بعد الحضانة مع السكرتارية الكشف عن الكاشف²⁴. باستخدام هذا الأسلوب، تتسم المهام لأملاح الإماهة الفموية، فضلا عن فئة ثانوية من مستقبلات تشيموسينسوري في تتبع عمر الفاروق، كانت المستقبلات المرتبطة بأمين (تارس) وأعرب عن^25،،من²⁶²⁷. يستخدم أسلوب مشترك آخر، الإنزيم لوسيفراس، جينات مراسل لوسيفراس اليراع تحت سيطرة عنصر الاستجابة المخيم (CRE). قياس التﻷلؤ المتولدة عن إنتاج لوسيفراس يوفر وسيلة فعالة وقوية للتحديد الكمي أو التنشيط^10،،من¹¹²⁸.

فحوصات المخيم في الوقت الحقيقي كما تستخدم على نطاق واسع في رصد وظيفة جبكرس مغايرة أو الذاتية بشكل حيوي. مثال واحد من هذه فحوصات متقدمة يستفيد من متغير بيوسينسور المشفرة جينياً، التي تمتلك مجال ملزم مخيم تنصهر بشكل المسخ من لوسيفراس. عندما تربط المخيم، يؤدي تغيير كونفورماشونال لتنشيط لوسيفراس، التﻷلؤ من الذي يمكن أن يقاس ثم مع^29،تشيميلومينيسسينسي قارئ³⁰. ذكر مناسبة تيتم الرفع من مستقبلات الرائحة البشرية في الخلايا 108CC15 HEK293 ونكسج التكنولوجيا المخيم في الوقت الحقيقيالحمار = "xref" > 31^،،من³²³³، كما جيدا كما هو الحال في Hana3A المستمدة من HEK293T الخلايا^34،35. كما وصف الفريق كراوتوورست بالتفصيل التكنولوجيا المخيم في الوقت الحقيقي لتكون مناسبة للنهج على نطاق واسع أو الفحص ثنائي^32،33.

هنا يمكننا وصف بروتوكول لقياس التنشيط أو استخدام مقايسة مخيم في الوقت الحقيقي في الخلايا Hana3A. في هذا البروتوكول، يقاس التﻷلؤ خلايا حية قبل متوازن كينيتيكالي لمدة 30 دقيقة عقب العلاج بالمركبات المتطايرة محددة، ويمثل إجراء تحليل أكثر كفاءة ودقة للتنشيط أو التي أقل عرضه القطع الأثرية التي تحدث في البيئة الخلوية مع الوقت الطويل والسمية الناجمة عن رائحة الخلية. يسمح هذا القياس في الوقت الحقيقي لغربلة واسعة النطاق من أملاح الإماهة الفموية ويغاندس على حد سواء، فضلا عن توصيف أزواج أو يجند معينة من الفائدة. باستخدام هذا الأسلوب، بنجاح حددنا OR5AN1 المستقبلات مسكون مجمع المسك قبل إجراء فحص ضد 379 من أملاح الإماهة الفموية البشرية ويؤكد فيما بعد نتيجة الفحص إيجابية.

Protocol

1-كولتورينج وصيانة الخلايا Hana3A

1. المحافظة على الخلايا في 10 مل متوسطة الأساسية الدنيا (MEM) مع 10% الجنيني البقري المصل (FBS)، 100 ميكروغرام/مل البنسلين-ستربتوميسين، و 1.25 ميكروغرام/مل الامفوتريسين ب في 100 ملم خلية ثقافة طبق في حاضنة ثقافة خلية 37 درجة مئوية مع 5% CO ₂. مع كل مرور أخرى، أضف 1 ميكروغرام/مل بوروميسين للحفاظ على تعداء مستقرة من البلازميدات (انظر المقدمة).
   ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على زراعة الخلايا في الصف الثاني السلامة البيولوجية مجلس الوزراء لضمان بيئة معقمة.
2. ثقافة فرعية بنسبة 10-20% في 100 ملم الأطباق كل 2-3 أيام-

2. طلاء الخلايا تعداء

1. مراقبة الخلايا Hana3A تحت مجهر تباين مرحلة لضمان بقاء الخلية وتقدير التقاء.
2. نضح المتوسطة كل من طبق ثقافة الخلية.
3. غسل الخلايا بإضافة 10 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) على اللوحة ويحوم الطبق يسفط في برنامج تلفزيوني.
أضف 3 مل من حمض 0.05% الإثيلين التربسين ديامينى tetraacetic (أدتا) على اللوحة
4. . المزيج لمدة 1 دقيقة أو حتى كافة الخلايا طافية.
   ملاحظة: مراقبة التقدم المحرز في الخلايا فصل من الجزء السفلي من لوحة تحت المجهر حسب الاقتضاء.
5. التربسين إيناكتيفاتي بإضافة 5 مل MEM مع 10% FBS وماصة صعودا وهبوطاً لتفريق أجزاء من الخلية ماساشوستس
   ملاحظة: للطلاء قبل تعداء، لا ينبغي أن يتضمن المتوسطة استخدام المضادات الحيوية. بالإضافة للمضادات الحيوية قد يقلل من كفاءة تعداء.
6. نقل مبلغ مناسب من الخلايا إلى أنبوب 15-mLl اعتماداً على عدد اللوحات تكون ترانسفيكتيد. لكل لوحة 96، حسنا، لوحة 2 × 10 ⁶ خلايا، أو حوالي 1/5 من طبق المتلاقية 100 مم 100%، إعطاء عدد خلايا 2 × 10 ⁴ خلايا كل بئر أو بكثافة من حوالي 15-30% التقاء كل بئر. الطرد المركزي أنابيب في 200 غ س لمدة 5 دقائق ونضح المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية.
   ملاحظة: حساب المبلغ الصحيح للخلايا تكون مطلية على لوحات 96-جيدا لتجنب أوفيرجرووينج أو أونديرجرووينج الخلايا قبل التحفيز.
7. إضافة مبلغ مناسب من MEM مع 10% FBS في 15 مل أنبوب و "الماصة؛" صعودا وهبوطاً لتفريق أجزاء من الخلية الجماعية. لكل لوحة 96، حسنا، ريسوسبيند الخلايا مع 6 مل MEM مع 10% FBS.
   ملاحظة: كن حذراً لا لتوليد فقاعات الهواء في الأنبوب.
إضافة
8. الخلايا مع وقف التنفيذ في المكمن. استخدام ماصة متعددة القنوات، "الماصة؛" 50 ميليلتر من الخلايا على كل بئر من صفيحة 96-جيدا. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5% CO ₂-

3. تعداء البلازميدات

1. قبل تعداء، مراقبة الخلايا مطلي لضمان التقاء سليم حوالي 30-50 في المائة البئر تحت مجهر تباين مرحلة والعودة إلى الحاضنة.
2. تحضير مقدما أو معلم رو بناء ^{11 ، 21 ، ،} من ^{22 28}، عامل ملحق بنيات (RTP1S ^{22 ، 36} و M3R ²³)، وبناء البديل بيوسينسور ^{29 ، 30} من مينيبريب. قياس تركيز الحمض النووي بجهاز المطياف الضوئي وضبط تركيزات الحمض النووي بلازميد (مثلاً، إلى 100 نانوغرام/ميليلتر) مع الماء المقطر عند الاقتضاء.
3. إعداد "الخلائط تعداء"
   1. إعداد خليط تعداء بلازميد في 500 ميليلتر من MEM لكل لوحة 96-جيدا وفقا الجدول 1-
      ملاحظة: عندما يتم اختبار أملاح مختلفة على نفس اللوحة 96، حسنا، يجب تكييف حجم الخليط تعداء ومقدار بلازميد الحمض النووي وأضاف في الدالة عدد من الآبار transfected مع أو معين.
   2. تحضير خليط تعداء في أنبوب مع 18 ميليلتر من تعداء الدهن بوساطة كاشف في 500 ميليلتر من MEM.
4. مزيج الخليط بلازميد مع خليط تعداء من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. احتضان في درجة حرارة الغرفة ل 15 دقيقة
5. وقف رد الفعل بإضافة 5 مل MEM مع 10% FBS.
6. انتشرت طبقة سميكة من مناشف ورقية معقمة في هود ثقافة الخلية. خذ صفيحة 96-جيدا مع الخلايا من الحاضنة. بلطف ومرارا وتكرارا حنفية لوحة رأسا على كومة منشفة ورقية حيث أن المتوسط يمتص تماما بمنشفة ورقية.
   ملاحظة: لا قوة أو فجأة اضغط على اللوحة واحدة يمكن أن نفقد خلايا.
7. نقل 50 ميليلتر من خليط تعداء المجمعة لكل بئر من لوحة 96-جيدا واحتضان بين عشية وضحاها على ح 18-24 في 37 درجة مئوية مع 5% CO ₂-
   ملاحظة: جدول تعداء وتحفيز إدارة الوقت ينبغي أن تسبق القياس عند أكثر من 96-جيدا لوحة يتم اختبارها في تجربة واحدة كي يكون جميع لوحات تقاس بعد نفس تعداء الوقت ووقت التعرض التحفيز.

4. التحفيز وقياس أو نشاط "الإنزيم المخيم في الوقت الحقيقي" باستخدام

1. مراقبة transfected الخلايا تحت مجهر مرحلة عالي تباين لضمان التقاء سليم من 50-80% لكل بئر والعودة إلى الحاضنة.
2. إعداد متوسطة التحفيز بإضافة 10 مم هيدروكسيثيل بيبيرازينيثانيسولفونيك حمض (حبيس) و 5 ملم الجلوكوز إلى هانك ' s حل متوازن الملح (حبس)-
3. ذوبان مختبرين كاشف الركازة المقايسة المخيم في الوقت الحقيقي على الجليد. تخزين كاشف الركيزة في-80 درجة مئوية في ميليلتر 55 كل أنبوب في أنابيب PCR. استخدام أنبوب 1 للوحة الواحدة.
4. إعداد الحل الموازنة 2% بخلط ميليلتر 55 من الكاشف الركيزة والحل حبس/حبيس/الجلوكوز ميليلتر 2750.
5. انتشرت طبقة سميكة من المناشف الورقية على مقاعد البدلاء. اضغط برفق مرارا وتكرارا لوحة رأسا على منشفة ورقية حيث أن المتوسط تعداء يمتص تماما بمنشفة ورقية.
6. تغسل الخلايا من بيبيتينج ميليلتر 50 حبس/حبيس/الجلوكوز إلى حل لكل بئر.
7. برفق مرارا وتكرارا الاستفادة من الحل هبس/هيبيس/الجلوكوز من لوحة 96-جيدا-
8. ماصة 25 ميليلتر من حل الموازنة 2% لكل منهما جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة في الظلام ل 2 حاء
9. إعداد مقدما 1 م الحلول الرائحة الأسهم في [دمس] ومخزن في-20 درجة مئوية إلى حين استخدامها.
10. قبل نهاية فترة الحضانة، تخفف الرائحة والحلول الأسهم لتركيزات العامل في هبس/هيبيس/الجلوكوز التحفيز المتوسطة-
    ملاحظة: ينبغي مضاعفة تركيزات تخفيف الرائحة التي أعدت في هذا الخطوة تسفر التركيزات النهائية الصحيحة في كل بئر-
11. تشيميلومينيسسينسي باستخدام لوحة قارئ وقبل إضافة الرائحة، قياس مستوى التﻷلؤ القاعدية لصفيحة 2 مرات متتالية بمعدل 1000 مللي ثانية كل جيدا ³⁴.
12. بسرعة إزالة اللوحة من قارئ اللوحة وإضافة تخفيف الرائحة ميليلتر 25 لكل بئر والبدء فورا في قياس التﻷلؤ المستمر لجميع الآبار لدورات 20 ضمن الحد الأدنى 30
    ملاحظة: ماصة بعناية لتجنب تلويث المجاورة الآبار عند استخدام أودورانتس مختلفة و/أو تركيزات مختلفة من أودورانتس نفسه في اللوحة نفسها.

5. تحليل بيانات

1. تصدير البيانات من برنامج قارئ لوحة تشيميلومينيسسينسي.
2. حساب تطبيع أو استجابة لكل مرة استخدام الصيغة
   (التﻷلؤ _N – التﻷلؤ _{القاعدية})/(التﻷلؤ _أعلى – التﻷلؤ _{القاعدية})
   حيث N = قيمة التﻷلؤ من معين جيدا؛ والقاعدية = التﻷلؤ متوسط قيمة اثنين القاعدية ضيائية القيم؛ أعلى = أعلى قيمة التﻷلؤ للوحة أو مجموعة لوحات.
   ملاحظة: اعتماداً على غرض التجربة، يمكن اعتماد تمثيلات رسومية بديلة. على سبيل المثال، لفرز فحوصات (انظر الشكل 1) ومن أجل توليد استجابة تركيز المنحنيات، قيمة التﻷلؤ بئر معينة عند نقطة وقت المطلوب أثناء قياس الحركية، مثل الحد الأقصى للقيمة أو يمكن استخدام القيمة النهائية،.

النتائج

مسكون هو العنصر الرئيسي العطرية من المسك الطبيعي. الدراسات الأخيرة OR5AN1 التي تم تحديدها كمستقبل بشرية مسكون وغيرها من المركبات المسك ماكروسيكليك استناداً إلى التماثل بالماوس، أو MOR215-1، مستنسخ من glomeruli مسكون المراعية في التصرف الفئران^37،38. ?...

Discussion

دقة قياس التنشيط أو عند التعرض للرائحة معينة هو الخطوة الأولى في فك ترميز المعلومات حاسة الشم. أظهرت التجارب في هذه الدراسة تمثل مثالاً لأحد كيف يمكن تحديد، باستخدام في المختبر أو تعبير النظام، استجابة أملاح الإماهة الفموية بين مرجع أو البشرية للمادة الكيميائية معطر للفائدة وتميز ف?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Sigma	A2942
DMSO	Sigma	D2650
FBS	Gibco	10099-141
GloSensor cAMP reagent	Promega	E1290
pGloSensor-20F cAMP plasmid	Promega	E1171
Hana3A cells			available from authors upon request
HBSS, without calcium or magnesium	GIBCO	14175095
HEPES	Hyclone	SH30237
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-019
M3R plasmid			cloned into a mammalian expression vector such as pCI
MEM, with EBSS and L-glutamine	Hyclone	SH30024
Muscone	Santa Cruz	sc-200528
Musk tibetene	Sigma-Aldrich	S359165
OR plasmids			cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI
PBS, without calcium or magnesium	Cellgro	21-040-CV
Penicillin-streptomycin	Hyclone	SV30010
Plasmid miniprep kit	Tiangen	DP103-03
Puromycin	Sigma	P8833
RTP1S plasmid			cloned into a mammalian expression vector such as pCI
Trypsin-EDTA	Hyclone	SH30236
0.2-mL PCR tube	Axygen	PCR-02-C
1.5-mL Eppendorf tube	Eppendorf
15-mL 17 mm x 120 mm conical tube	BD Falcon	352096
8-well and/or 12-well multichannel pipetman	Eppendorf
96-well flat-bottomed white cell culture plate	Greiner	655098
100 mm x 20 mm cell culture dish	BD Falcon	353003
Class II biological safety cabinet with laminar flow
Cell culture incubator, with 5% CO2
Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes
Infinite F200 plate reader	Tecan
Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives
Spectrophotometer
Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution
Sterile paper towel