Leben-Zelle Messung der Geruchsstoff Rezeptor Aktivierung mit einem Echtzeit-cAMP-Assay

Zusammenfassung

Charakterisierung der Funktion der Geruchsstoff Rezeptoren dient einen unverzichtbaren Bestandteil in der Deorphanization-Prozess. Wir beschreiben eine Methode zur Messung der Aktivierung des Duftstoff-Rezeptoren in Echtzeit über einen cAMP-Assay.

Zusammenfassung

Die enorme Größe der Säugetier-Geruchsstoff Rezeptor (OR) Familien Schwierigkeiten, ihre Verwandten Liganden unter zahlreichen flüchtigen Chemikalien zu finden. Um effizient und präzise ORs deorphanize, kombinieren wir die Verwendung einer heterologen Zelllinie Säugetier-ORs und ein genetisch veränderter Biosensor-Plasmid Lager Produktion flussabwärts von OR Aktivierung in Echtzeit zu messen zum Ausdruck bringen. Dieser Test kann auf Bildschirm Geruchsstoffe gegen ORs und umgekehrtverwendet werden. Duftstoff-Rezeptor-positiven Interaktionen von den Bildschirmen können anschließend durch Tests mit verschiedenen Konzentrationen von Geruch, Generierung von Konzentration-Wirkungs-Kurven bestätigt werden. Hier haben wir diese Methode durchführen eine Hochdurchsatz-Screening eine duftende Substanz gegen eine menschliche OR-Bibliothek in Hana3A Zellen exprimiert und bestätigt, dass der Rezeptor reagiert positiv cognate Rezeptor für die Verbindung von Interesse ist. Wir fanden diese Hochdurchsatz-Erkennungsmethode effizient und zuverlässig bei der Beurteilung der OR-Aktivierung und unsere Daten liefern ein Beispiel für den möglichen Einsatz in OR funktionelle Studien.

Einleitung

Der Geruchssinn spielt eine wichtige Rolle in der Tiere überleben, da sie verlassen sich auf ihre olfaktorischen Fähigkeiten erhalten Nahrung, Raubtiere und Gefahr zu vermeiden, Arten zu unterscheiden, und wählen Mate^1,2. Die Realisierung dieser Funktionen hängt von der Duftstoff-Rezeptoren (ORs), die individuell an die ciliary Oberfläche des olfaktorischen sensorischen Neuronen (Korrelationsmöglichkeiten) befindet sich in der olfaktorischen Epithel (OE) ausgedrückt werden. Regionen in äußerster Randlage bilden die größte Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-Superfamilie mit ungefähr 400 und 1200 verschiedene OR Gene im menschlichen und Maus, bzw.^3,4,5. Regionen in äußerster Randlage aktiviert durch Geruchsstoffe führen zu erhöhten intrazellulären cAMP-Spiegel über die sequentielle Aktivierung des olfaktorischen G-Protein (G_Olf) und Typ III Adenylyl Cyclase (ACIII). Die daraus resultierende erhöhte intrazelluläre cAMP könnte funktionieren als zweiter Bote, der Nucleotide-gated Kanal auf der Zelloberfläche öffnet, Auslösung Zustrom von kationen einschließlich Ca^{2 +} und Aktionspotentiale, und letztlich zu initiieren Neuro-Potenzial Übertragungs- und olfaktorischen Wahrnehmung. Der Prozess der Erkennung und Unterscheidung eine große Anzahl von Riechstoffen von Regionen in äußerster Randlage gilt als der erste Schritt der olfaktorischen Wahrnehmung^6,7.

Da Buck und Axel⁸ zuerst erfolgreich Geruchsstoff Rezeptoren geklont und den Mechanismus der olfaktorischen Wahrnehmung von Regionen in äußerster Randlage initiiert erläutert, wurde Deorphanization der OR-Familie einer der Hotspots in diesem Bereich. Verschiedenen in Vivo, Ex Vivo und in Vitro Methoden, OR Aktivierung zu messen gewesen gemeldeten^9,10,11,12. Eine traditionelle Methode, Ca^{2 +} Bildgebung von einzelligen RT-PCR auf Korrelationsmöglichkeiten gefolgt ermöglicht die Identifizierung der verschiedenen Regionen in äußerster Randlage aliphatischen Geruchsstoffe^13,14,15. In jüngerer Zeit, das Aufkommen der großen Transkriptom-Analysen förderte die Entwicklung des mehr Hochdurchsatz- in-Vivo -Methoden. Der Kentucky-Test identifiziert Eugenol und Muscone-reagierende Maus ORs mit dem Einsatz der S100a5-TauGFP-Reporter Maus Belastung und Microarray Analyse⁹. Basierend auf den Rückgang der OR-mRNA-Niveaus nach Geruchsstoff Exposition, beschäftigt die Traum-Technologie ein transkriptomischen Konzept zur Bestimmung des OR Aktivierung Profile in beide Wirbeltiere und nicht-Wirbeltier-Arten-¹⁶. In ähnlicher Weise angesichts der Phosphorylierung des S6 in neuronalen Aktivierungen, die Matsunami Gruppe sequenzierten mRNAs aus phosphorylierten Ribosom Immunperoxidase, reaktionsschnelle ORs¹²zu identifizieren. Schließlich berichtet Feinstein Gruppe super Sniffer-Mäuse, die als Plattform, um Geruch Codierung in Vivo, bekannt als die MouSensor-Technologie-¹⁷Studie dienen könnten.

Im Bereich in-vitro- macht die Herausforderung der Kultivierung Korrelationsmöglichkeiten heterologen Expressionssystem, die imitiert, OR funktionelle Expression in Vivo eine ideale Lösung für große Screening von wohlriechenden Chemikalien für Regionen in äußerster Randlage führen. Jedoch da kultivierten Zelllinien nicht olfaktorische Herkunft unterscheiden sich von einheimischen Korrelationsmöglichkeiten oder Proteine werden in dem endoplasmatischen Retikulum und nicht in der Lage, um die Plasmamembran Verkehr beibehalten, was in OR Abbau und Verlust von Rezeptor-Funktion^{18 , 19}. um dieses Problem zu lösen, umfangreiche Werke vorgenommen wurden, OR funktionelle Expression auf der Zellmembran in heterologen Zelllinien zu replizieren. Krautwurst Et Al. zuerst die ersten 20 Aminosäuren von Rhodopsin (Rho-Tag) an die N-terminale OR Protein und dies förderte die Zelloberfläche Ausdruck von einigen ORs in menschlichen embryonalen Niere (HEK) Zellen²⁰. Durch eine serielle Analyse der Genanalyse Ausdruck (Salbei) Bibliothek aus einzelnen Korrelationsmöglichkeiten Saito Et Al. zuerst geklont, die Rezeptor-der Transport von Protein (RTP) Familienmitglieder, RTP1 und RTP2 und der Rezeptor Ausdruck Enhancer Protein 1 (REEP1), das or Menschenhandel an der Zellmembran erleichtert und verbessert Duftstoff-vermittelten Reaktionen der ORs in HEK293T Zellen ²¹. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen, Matsunami Gruppe erfolgreich etabliert die Hana3A-Zell-Linie mit RTP1 und RTP2, REEP1 sowie Gα_Olf in HEK293T stabil transfiziert und vorübergehend mit Rho-Tags ORs für effiziente oder funktionale transfiziert Ausdruck. Nachfolgende Studien zeigte (1) eine kürzere Form der RTP1, RTP1S, die stärker zu fördern oder funktionieren als das ursprüngliche RTP1 Protein und (2) der Typ 3 Muskarin Acetylcholin-Rezeptor (M3R), die OR-Aktivität über Hemmung der β-arrestin-2 verbessern könnte Rekrutierung, beide auf der heterologen Expressionssystem experimentelle Optimierung eingeführt wurden Ausgabe^22,23.

Verschiedene Nachweismethoden wurden zur Aktivierung des Rezeptors in heterologen Systemen zu quantifizieren. Die sekretierten plazentare alkalische Phosphatase (SEAP) Assay arbeitet mit einem Reporter Enzym transcriptionally geregelt cAMP Response-Elemente (CREs), so dass es eine attraktive Option für die Beurteilung der OR-Aktivierung. Die Fluoreszenz wird leicht in einer Probe des Kulturmediums nach der Inkubation mit SEAP Erkennung Reagenz²⁴erkannt. Mit dieser Methode charakterisiert die Funktionen der Regionen in äußerster Randlage sowie eine sekundäre Klasse chemosensorische Rezeptoren, ausgedrückt in der OE-die Spur Amin-assoziierte Rezeptoren (TAARs) wurden^25,26,27. Eine weitere gängige Methode, die Luciferase Assay verwendet ein Glühwürmchen Luciferase Reporter-gen unter der Kontrolle des cAMP Response-Element (CRE). Messung der Lumineszenz von Luciferase Produktion erzeugt stellt eine effiziente und robuste Möglichkeit zur Quantifizierung OR Aktivierung^10,11,28.

Echtzeit-cAMP Assays haben auch verbreitet in dynamisch die Überwachungsfunktion der heterologen oder endogene GPCRs. Ein Beispiel für solche erweiterten Tests nutzt eine genetisch codierte Biosensor-Variante, die eine cAMP-bindende Domäne verschmolzen zu einer mutierten Form der Luciferase besitzt. Wenn Lager bindet, führt die Konformationsänderung zur Aktivierung der Luciferase, Lumineszenz von denen dann mit einem Chemilumineszenz Leser^29,30gemessen werden kann. Die Echtzeit-cAMP Technologie ist geeignet für die de-Verwaisung des menschlichen Geruchsstoff Rezeptoren in HEK293 und NxG 108CC15 Zellen berichtet wordenArsch = "Xref" > 31^,32,33, wie sowie in die HEK293T abgeleitet Hana3A^34,35Zellen. Die Krautwurst-Gruppe auch beschrieben im Detail die Echtzeit-cAMP-Technologie, um für Bi-direktionale groß angelegte oder Screening Ansätze^32,33geeignet.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der OR-Aktivierung mit einem Echtzeit-cAMP-Assay in Hana3A Zellen. In diesem Protokoll wird die Lumineszenz von Pre äquilibriert lebenden Zellen für 30 min. nach der Behandlung mit bestimmten flüchtige Verbindungen, die eine effiziente und genaue Analyse der OR-Aktivierung, die weniger anfällig sind, kinetisch gemessen. Artefakte, die in der zellulären Umgebung mit längerer Zeit und Geruch-induzierte Zelle Toxizitäten auftreten. Diese Echtzeit-Messung ermöglicht eine großangelegte Screening von Regionen in äußerster Randlage und Liganden sowie Charakterisierung von spezifischen OR-Ligand Paaren von Interesse. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich OR5AN1 als Rezeptor für den Moschus zusammengesetzten Muscone durch eine Abschirmung gegen 379 menschlichen ORs durchführen und anschließend bestätigen das positive Screening-Ergebnis.

Protokoll

1. Culturing und Wartung von Hana3A Zellen

1. pflegen Zellen in 10 mL minimale wesentliche Medium (MEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 100 µg/mL Penicillin-Streptomycin und 1,25 µg/mL Amphotericin B in einem 100-mm Zelle Kulturschale in einem 37 ° C Zelle Kultur Inkubator mit 5 % CO ₂. Mit jeder anderen Passage hinzufügen 1 µg/mL Puromycin Aufrechterhaltung beständigen Transfection Plasmide (siehe Einleitung).
   Hinweis: Führen Sie alle Schritte mit Zellkultur in einer Klasse II biologischen Sicherheitsschrank, steriles Umfeld zu gewährleisten.
2. Subkultur in einem Verhältnis von 10-20 % in 100 mm Gerichte alle 2-3 Tage.

2. Galvanischen Zellen zur Transfektion

1. beobachten die Hana3A Zellen unter dem Phasenkontrast-Mikroskop Zellviabilität sicherzustellen und Zusammenfluss schätzen.
2. Aspirieren Sie alle Mittel aus der Zelle Kulturschale.
3. Zellen durch Hinzufügen von 10 mL von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf den Teller, wirbeln die Schüssel und Absaugen der PBS waschen.
4. Add 3 mL 0,05 % Trypsin-Ethylen Diamin Tetraacetic Säure (EDTA) auf den Teller. Mischung für 1 Minute oder bis alle Zellen flott sind.
   Hinweis: Beachten Sie den Fortschritt der Zellen von der Unterseite der Platte unter dem Mikroskop nach Bedarf abnehmen.
5. Inaktivierung Trypsin durch Zugabe von 5 mL MEM mit 10 % FBS und Pipette rauf und runter zu brechen, Brocken von Handy-Messe
   Hinweis: Für die Beschichtung vor Transfektion, sollte das verwendete Medium nicht Antibiotika enthalten. Zugabe von Antibiotika kann die Transfektion Effizienz verringern.
6. Übertragung eine entsprechende Menge an Zellen zu einem 15-mLl-Schlauch abhängig von der Anzahl der Platten zu transfiziert werden. Für jede 96-Well-Platte, Platte 2 x 10 ⁶ Zellen oder ca. 1/5 der 100 % konfluierende 100 mm Platte geben eine Zellzahl von 2 x 10 ⁴ Zellen pro Brunnen oder eine Dichte von ca. 15-30 % Zusammenfluss pro Bohrloch. Röhren bei 200 X g für 5 min Zentrifugieren und aspirieren den Überstand ohne zu stören die Zelle Pellet.
   Hinweis: Berechnen Sie die richtige Menge an Zellen auf 96-Well-Platten zu vermeiden, Verwilderung oder undergrowing Zellen vor Stimulation vernickelt werden.
7. Hinzufügen eine entsprechende Menge an MEM mit 10 % FBS in der 15 mL tube und pipette rauf und runter zu brechen, Brocken der Zelle Masse. Für jede 96-Well-Platte Aufschwemmen der Zellen mit 6 mL MEM mit 10 % FBS.
   Hinweis: Achten Sie darauf, Luftblasen in das Rohr zu erzeugen.
8. Die suspendierten Zellen hinzufügen in einen Stausee. Mit einer Mehrkanal-Pipette, pipette 50 µL Zellen auf jedem Bohrloch einer 96-Well-Platte. Inkubation über Nacht bei 37 ° C mit 5 % CO ₂.

3. Transfektion von Plasmiden

1. vor Transfektion, beobachten die vergoldeten Zellen gewährleisten einen ordnungsgemäße Zusammenfluss von ca. 30-50 % pro Bohrloch unter dem Phasenkontrast-Mikroskop und zurück in den Inkubator.
2. Vorbereitung im Vorfeld der Rho-Tags OR Konstrukt ^{11 , 21 , 22 , 28}, baut der Zubehör-Faktor (RTP1S ^{22 , 36} und M3R ²³), und die Biosensor-Variante ^{29 , 30} von Miniprep konstruieren. Die DNA-Konzentration von einem Spektrophotometer zu quantifizieren und Plasmid-DNA-Konzentrationen (z.B. zu 100 ng/µL) mit destilliertem Wasser nach Bedarf anpassen.
3. Vorbereitung der Transfektion Mischungen
   1. bereiten eine Plasmid Transfektion Mischung in 500 µL MEM für jede 96-Well-Platte gemäß Tabelle 1.
      Hinweis: Wenn verschiedene Regionen in äußerster Randlage auf der gleichen 96-Well-Platte getestet werden, das Volumen der Transfektion Mischung und die Höhe der Plasmid DNA hinzugefügt muss angepasst werden in Abhängigkeit von Anzahl der transfizierten Bohrungen mit einem bestimmten OR.
   2. Vorbereiten einer Transfektion Mischung in einem Rohr mit 18 µL der Lipid-vermittelte Transfektion Reagenz in 500 µL MEM.
4. Mischen die Plasmid-Mischung mit der Transfektion Mischung von Pipettieren rauf und runter. Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min.
5. Die Reaktion zu stoppen, durch Zugabe von 5 mL MEM mit 10 % FBS.
6. Erstreckt sich eine dicke Schicht von sterilen Papiertüchern in der Zelle-Kultur-Haube. Nehmen Sie eine 96-Well-Platte mit Zellen aus dem Inkubator. Sanft und immer wieder die Platte umgedreht auf den Haufen von Papiertuch antippen, so dass das Medium vom Küchenpapier vollständig absorbiert wird.
   Hinweis: Mit Nachdruck oder abrupt Tippen Sie nicht die Platte wie man Zellen verlieren könnte.
7. 50 µL der kombinierten Transfektion Mischung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte zu übertragen und über Nacht inkubieren 18-24 h bei 37 ° C mit 5 % CO ₂.
   Hinweis: Ein Mal geschafft Transfektion und Stimulation Zeitplan sollte die Messung vorausgehen, wenn mehr als eine 96-Well-Platte werden in einem einzigen Experiment getestet, um alle Platten nach Transfektion gleichzeitig und Belichtungszeit Reiz gemessen haben.

4. Stimulation und Messung oder Aktivität unter Verwendung der Real-Time-cAMP-Test

1. beobachten die transfizierten Zellen unter dem Phasenkontrast-Mikroskop zu gewährleisten einen ordnungsgemäße Zusammenfluss von 50-80 % pro Bohrloch und zurück in den Inkubator.
2. Bereiten die Stimulation Medium durch Zugabe von 10 mM Hydroxyethyl Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES) und 5 mM Glukose zu Hank ' s ausgewogen Salz Lösung (HBSS).
3. Tauen die Echtzeit-cAMP Assay Substrat Reagenz Aliquote auf Eis. Substrat-Reagenz bei-80 ° C bei 55 µL pro Röhre in PCR Röhren aufbewahren. 1 Tube pro Platte verwenden.
4. Bereiten Sie 2 % Gleichgewichtherstellung Lösung durch Mischen von 55 µL des Reagenz Substrat und 2750 µL HBSS/HEPES/Glukoselösung.
5. Erstreckt sich eine dicke Schicht von Papierhandtüchern auf der Bank. Sanft und immer wieder die Platte umgedreht auf das Papiertuch antippen, so dass die Transfektion Medium vom Küchenpapier vollständig absorbiert wird.
6. Waschen die Zellen von 50 µL HBSS/HEPES/Glukoselösung in jede Vertiefung pipettieren.
7. Sanft und immer wieder zu erschließen, die HBSS/HEPES/Glukose-Lösung aus der 96-Well-Platte.
8. Pipette 25 µL 2 % Gleichgewichtherstellung Lösung zu jedem gut und Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln für 2 h.
9. Vorbereitung im Vorfeld 1 M Geruchsstoff Stammlösungen in DMSO und Store bei-20 ° C bis verwendet.
10. Vor dem Ende der Inkubationszeit Verdünnen der Geruchsstoff Stammlösungen arbeiten Konzentrationen in HBSS/HEPES/Glucose Stimulation Medium.
    Hinweis: Die Konzentrationen von der Geruchsstoff Verdünnungen in diesem Schritt vorbereitet sollte verdoppelt, um die korrekte Endkonzentrationen in jede Vertiefung ergeben.
11. Mit einem Chemilumineszenz Platte Leser und vor Zugabe der Geruchsstoff, messen die basalen Lumineszenz der Platte 2 Mal hintereinander mit einer Rate von 1000 ms pro gut ³⁴.
12. Schnell die Platte aus dem Teller Leser zu entfernen und fügen 25 µL Geruchsstoff Verdünnungen in jede Vertiefung und kontinuierliche Lumineszenz Messung alle Brunnen für 20 Zyklen sofort starten innerhalb von 30 min.
    Hinweis: Pipette vorsichtig zur Vermeidung einer Kontamination benachbarter Brunnen, bei Verwendung von verschiedenen Riechstoffen und/oder unterschiedliche Konzentrationen der gleichen Geruchsstoffe in der gleichen Platte.

5. Analyse der Daten

1. exportieren Sie die Daten aus der Chemilumineszenz-Platte-Reader-Software.
2. Calculate normalisiert OR Antwort für jeden Zeitpunkt mit Hilfe der Formel
   (Lumineszenz _N – Lumineszenz _basale) / (Lumineszenz _höchste – Lumineszenz _basale)
   wo N = Lumineszenz-Wert eines bestimmten gut; basale = durchschnittliche Lumineszenz-Wert der beiden basalen Lumineszenz-Werte; höchste = höchsten Lumineszenz-Wert einer Platte oder eine Reihe von Platten.
   Hinweis: Je nach Zweck des Experiments, alternative grafische Darstellungen angenommen werden können. Zum Beispiel für screening-Tests (siehe Abbildung 1) und zur Erzeugung von Konzentration-Wirkungs-Kurven, die Lumineszenz-Wert eines Brunnens zu einem gewünschten Zeitpunkt während der kinetischen Messung, z. B. den maximalen Wert oder die Endwert, verwendet werden.

Ergebnisse

Muscone ist die wichtigste aromatische Komponente aus natürlichen Moschus. Aktuelle Studien identifizierten OR5AN1 als menschliche Rezeptor für Muscone und andere makrozyklische Moschus-Verbindungen basierend auf Homologie auf die Maus oder MOR215-1, von Muscone eine geschlechtergerechte Glomeruli im Verhalten der Mäuse^37,38geklont. Durch screening der menschlichen OR Repertoire, unsere Gruppe und der Touhara-Gruppe auch identi...

Diskussion

Genaue Messung eine OR-Aktivierung nach Exposition gegenüber einem bestimmten Geruchsstoff ist der erste Schritt bei der Entschlüsselung der Codierung der Geruchsinformation. Die Experimente gezeigt, die ein Beispiel wie man über ein in-vitro- identifizieren kann, die in dieser Studie OR Expressionssystems, reaktionsschnelle ORs unter dem menschlichen OR Repertoire für die duftende Chemie-und anschließend Charakterisierung des Rezeptors Pharmakologie mit verschiedenen Konzentrationen der Chemikalie. Unsere ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Sigma	A2942
DMSO	Sigma	D2650
FBS	Gibco	10099-141
GloSensor cAMP reagent	Promega	E1290
pGloSensor-20F cAMP plasmid	Promega	E1171
Hana3A cells			available from authors upon request
HBSS, without calcium or magnesium	GIBCO	14175095
HEPES	Hyclone	SH30237
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-019
M3R plasmid			cloned into a mammalian expression vector such as pCI
MEM, with EBSS and L-glutamine	Hyclone	SH30024
Muscone	Santa Cruz	sc-200528
Musk tibetene	Sigma-Aldrich	S359165
OR plasmids			cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI
PBS, without calcium or magnesium	Cellgro	21-040-CV
Penicillin-streptomycin	Hyclone	SV30010
Plasmid miniprep kit	Tiangen	DP103-03
Puromycin	Sigma	P8833
RTP1S plasmid			cloned into a mammalian expression vector such as pCI
Trypsin-EDTA	Hyclone	SH30236
0.2-mL PCR tube	Axygen	PCR-02-C
1.5-mL Eppendorf tube	Eppendorf
15-mL 17 mm x 120 mm conical tube	BD Falcon	352096
8-well and/or 12-well multichannel pipetman	Eppendorf
96-well flat-bottomed white cell culture plate	Greiner	655098
100 mm x 20 mm cell culture dish	BD Falcon	353003
Class II biological safety cabinet with laminar flow
Cell culture incubator, with 5% CO2
Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes
Infinite F200 plate reader	Tecan
Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives
Spectrophotometer
Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution
Sterile paper towel