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Resumen

Caracterizar la función de receptores odorantes sirve una parte indispensable en el proceso de deorphanization. Se describe un método para medir la activación de receptores odorantes en tiempo real utilizando un ensayo de campo.

Resumen

El enorme tamaño de las familias de mamíferos odorante del receptor (o) presenta dificultades para encontrar sus ligandos afines entre los numerosos productos químicos volátiles. Para eficientemente y exactamente deorphanize ORs, combinamos el uso de una línea de células heterólogas ORs mamíferos y un plásmido biosensor genéticamente modificados para medir campo producción aguas abajo de la activación de la OR en tiempo real. Este ensayo puede utilizarse para olores de pantalla contra ORs y viceversa. Las interacciones de los receptores odorantes de las pantallas pueden confirmarse posteriormente por pruebas contra diferentes concentraciones de olor, generación de curvas de concentración-respuesta positiva. Aquí hemos utilizado este método para realizar una proyección de alto rendimiento de un compuesto oloroso contra una biblioteca OR humano expresado en las células Hana3A y confirmó que el receptor responder positivamente es el receptor cognado para el compuesto de interés. Encontramos este método de detección de alto rendimiento eficiente y confiable en la evaluación de la activación de la OR y nuestros datos proporcionan un ejemplo de su uso potencial en estudios funcionales OR.

Introducción

El sentido del olfato desempeña un papel importante en la supervivencia de animales como ellos confían en sus capacidades olfativas para obtener comida, evitar depredadores y peligros, especies y seleccionar mate1,2. La realización de estas funciones depende de los receptores de olor (RUP), que se expresan individualmente en la superficie ciliar de las neuronas sensoriales olfativas (OSNs) localizada en el epitelio olfatorio (OE). ORs constituyen la mayor familia de la superfamilia de receptores (GPCR) de la proteína G acoplada con aproximadamente 400 y 1200 diversos OR genes en humanos y ratón, respectivamente3,4,5. ORs activados por olores conducen al aumento de los niveles intracelular de cAMP a través de la activación secuencial de proteína olfatoria de G (Golf) y tipo cyclase del adenylyl III (ACIII). El mayor nivel de cAMP intracelular resultante podría funcionar como un segundo mensajero, que se abre el canal nucleotide-bloqueado en la superficie de la célula, provocando afluencia de cationes como Ca2 + y los potenciales de acción y en última instancia iniciando potencial de neuro transmisión y percepción olfativa. El proceso de detectar y discriminar una gran cantidad de olores por ORs es considerado como el primer paso de percepción olfativa6,7.

Puesto que Buck y Axel8 primero con éxito había reproducido receptores odorantes y dilucidado el mecanismo de la percepción olfativa iniciada por ORs, deorphanization de la familia de OR se convirtió en uno de los hotspots en este campo. Varios métodos in vivo, ex vivo y en vitro para medir la activación OR han sido reportados9,10,11,12. Un método tradicional que utiliza Ca2 + proyección de imagen de seguido por RT-PCR unicelular en OSNs permitió la identificación de diferentes SRO a aceites alifáticos13,14,15. Más recientemente, el advenimiento de los análisis del transcriptoma a gran escala promueve el desarrollo de métodos de alto rendimiento en vivo más. El ensayo de Kentucky había identificado ORs de eugenol y muscone-sensible al ratón con el uso de la S100a5-tauGFP reportero ratón cepa y microarrays análisis9. Basado en la disminución de los niveles de mRNA de OR después de la exposición de olor, la tecnología de sueño emplea un enfoque transcriptómicos para determinar perfiles de activación OR en ambas especies de vertebrados y no vertebrados16. Asimismo, habida cuenta de la fosforilación de S6 en activaciones neuronales, la señorita grupo secuenciado mRNAs de immunoprecipitations ribosoma fosforilada para identificar capacidad de respuesta de ORs12. Por último, el grupo de Feinstein informó ratones estupendo sniffer que podrían servir como una plataforma para estudiar olor codificación en vivo, conocido como la tecnología de MouSensor17.

En el Reino de vitro , el reto de cultivo OSNs hace un sistema de expresión heteróloga que imita OR expresión funcional en vivo una solución ideal para la investigación a gran escala de los productos químicos para ORs. Sin embargo, puesto que las líneas de cultivo de células de origen no olfativa difieren OSNs nativos, o proteínas son retenidas en el retículo endoplasmático e incapaz de tráfico a la membrana plasmática, dando por resultado OR degradación y pérdida de función del receptor18 , 19. para resolver este problema, se han realizado trabajos extensos para replicar expresión funcional OR sobre la membrana celular en células heterólogas. Krautwurst et al. primero atribuye los 20 primeros aminoácidos de la rodopsina (Rho-etiqueta) a la N-terminal de la proteína de OR y esto promovió la expresión de superficie de la célula de algunos ORs en células de riñón embrionario humano (HEK)20. Mediante la realización de un análisis de serie de análisis del gene expresión (SAGE) Biblioteca de solo OSNs, Saito et al. clonó por primera vez el transporte del receptor proteína (RTP) miembros de la familia, RTP1 y RTP2 y la proteína del receptor de expresión potenciador 1 (REEP1) que facilitó el tráfico de OR a la membrana celular y mejorada respuestas mediadas por el olor de las RUP en las células HEK293T 21. basándose en estos hallazgos, el grupo de la señorita establecido con éxito la línea celular de Hana3A estable transfected con RTP1, RTP2, REEP1 y Gαolf en HEK293T y transitorio transfected con ORs tagged Rho, eficiente o funcional expresión. Posteriores estudios revelaron 1) una forma más corta de RTP1, RTP1S, que podrían promover más robusta o función de la proteína original de RTP1 y 2) el receptor muscarínico de tipo 3 (M3R) que podría mejorar la actividad OR vía inhibición de la β-arrestin-2 contratación, los cuales fueron introducidos en el sistema de expresión heteróloga para optimizar experimental salida22,23.

Varios métodos de detección se han utilizado para cuantificar la activación del receptor en sistemas heterólogos. El ensayo de la fosfatasa alcalina placentaria secretada (SEAP) trabaja con una enzima reporter reglamentada transcripcionalmente por elementos de la respuesta de campo (CREs), convirtiéndolo en una opción atractiva para evaluar la activación de la OR. La fluorescencia se detecta fácilmente en una muestra de medio de cultivo después de la incubación con SEAP detección reactivo24. Usando este método, las funciones de RUP como una clase secundaria de receptores chemosensory en el OE-el rastro receptores asociados a aminas (Edmonton) han sido caracterizan25,26,27. Otro método común, el ensayo de luciferasa, utiliza un gen de reportero de luciferasa de luciérnaga bajo el control del elemento de respuesta cAMP (CRE). Luminiscencia generada por la producción de luciferase de medición proporciona un medio eficiente y robusto de cuantificación OR activación10,11,28.

Ensayos de campo en tiempo real también han sido ampliamente utilizados en el seguimiento dinámicamente la función de los GPCRs heterólogas o endógenas. Un ejemplo de tales ensayos avanzados aprovecha una variante genéticamente codificados biosensor, que posee un dominio de unión a campo fusionado a la forma mutante de la luciferasa. Cuando el campo se une, el cambio conformacional conduce a la activación de la luciferasa, luminiscencia que puede medirse entonces con un lector de la quimioluminescencia29,30. La tecnología de campo en tiempo real ha informado conveniente para la orfandad de los receptores de olor humano en las células HEK293 y NxG de 108CC15culo = "xref" > 31,32,33, como así como en la Hana3A HEK293T derivado células34,35. El grupo Krautwurst también describe en detalle la tecnología de campo en tiempo real para ser conveniente para enfoques a gran escala o detección bidireccional32,33.

Aquí se describe un protocolo para medir la activación OR usando un análisis de campo en tiempo real en células Hana3A. En el presente Protocolo, la luminiscencia de células vivas previamente equilibradas se mide cinéticamente por 30 min después del tratamiento con compuestos volátiles específicos, que representan un análisis más eficiente y preciso de la activación de OR que son menos susceptibles a artefactos que se producen en el entorno celular con tiempo prolongado y toxicidad celular inducida por el olor. Esta medida en tiempo real permite una proyección a gran escala de SRO y ligandos, así como caracterización de pares OR-ligando específicos de interés. Usando este método, con éxito identificamos OR5AN1 como receptor para el muscone compuesto de almizcle realizando una proyección contra 379 ORs humanas y posteriormente confirmar el resultado de la investigación positiva.

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Protocolo

1. cultivo y mantenimiento de las células Hana3A

  1. mantener las células en 10 mL de medio mínimo esencial (MEM) con 10% suero fetal bovino (FBS), 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina y 1,25 μg/mL anfotericina B en un 100 mm placa de cultivo de células en una incubadora de cultivo celular de 37 ° C con 5% CO 2. Con cada otro paso, añadir 1 puromicina μg/mL para mantener estable de la transfección de plásmidos (véase Introducción).
    Nota: Realice todos los pasos que implica el cultivo de células en una clase de gabinete de seguridad biológica II a garantizar ambiente estéril.
  2. Subcultivo en una proporción de 10-20% en 100 mm platos cada 2-3 días.

2. Recubrimiento de las células para la transfección

  1. observar las células bajo un microscopio de contraste de fase para asegurar la viabilidad de las células y para estimar la confluencia del Hana3A.
  2. Aspirar todo medio de la placa de cultivo celular.
  3. Lavar las células añadiendo 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en la placa, el plato se arremolinan y aspirando PBS.
  4. Añadir 3 mL de 0.05% tripsina-ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en la placa. Mezcla durante 1 minuto o hasta que todas las células estén a flote.
    Nota: Observar el avance de las células de la parte inferior de la placa bajo el microscopio como sea necesario.
  5. Tripsina Inactivate añadiendo 5 mL de MEM con 10% FBS y pipeta hacia arriba y hacia abajo para romper trozos de Massachusetts de la célula
    Nota: Para placas antes de transfección, el medio utilizado no debe contener antibióticos. Además de los antibióticos pueden disminuir la eficacia de transfección.
  6. Transferir una cantidad apropiada de las células a un tubo de 15 mLl dependiendo del número de placas a ser transfectadas. Por cada placa de 96 pocillos, placa de 2 x 10 6 células o aproximadamente 1/5 de un plato de 100 mm confluente del de 100%, dando una cuenta de célula de 2 x 10 4 células por pozo o una densidad de aproximadamente 15-30% confluencia por pozo. Centrifugar los tubos a 200 x g durante 5 min y aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular.
    Nota: Calcular la cantidad correcta de células para ser revestidos en placas de 96 pocillos para evitar sobrecrecimiento o undergrowing las células antes de la estimulación.
  7. Agregar una cantidad apropiada de MEM con 10% FBS en la 15-mL tubo y pipeta hacia arriba y hacia abajo para romper trozos de la célula de la masa. Para cada placa de 96 pocillos, resuspender las células con 6 mL de MEM con 10% FBS.
    Nota: Tenga cuidado de no generar burbujas de aire en el tubo de.
  8. Añadir las células suspendidas en un tanque. Usando una pipeta multicanal, pipetee 50 μl de células en cada pozo de una placa de 96 pocillos. Incubar durante una noche a 37 ° C con 5% CO 2.

3. Transfección de plásmidos

  1. antes de transfección, observar las células plateadas para asegurar una adecuada confluencia de aproximadamente 30-50% bien bajo el microscopio de contraste de fase y volver a la incubadora de.
  2. Preparar con antelación el OR tagged Rho construcción 11 , 21 , 22 , 28, el factor accesorio construye (RTP1S 22 , 36 y M3R 23), y la variante de biosensor construir 29 , 30 por miniprep. Cuantificar la concentración de DNA por un espectrofotómetro y ajustar las concentraciones de ADN plásmido (p. ej., a 100 ng/μL) con agua destilada como sea necesario.
  3. Preparación de las mezclas de transfección
    1. prepara una mezcla de transfección del plásmido en 500 μl de MEM para cada placa de 96 pocillos según tabla 1.
      Nota: Cuando diferentes SRO es probados en la misma placa de 96 pocillos, el volumen de la mezcla de transfección y la cantidad de plásmido ADN añadido debe adaptarse en función del número de pozos transfected con un dado o.
    2. Prepare una mezcla de transfección en un tubo con 18 μL de reactivo de transfección mediada por lípidos en 500 μl de recordar:
  4. Mezcle la mezcla de plásmido con la mezcla de transfección mediante pipeteo arriba y abajo. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min
  5. Detener la reacción agregando 5 mL de MEM con 10% FBS.
  6. Extienda una capa gruesa de toallas de papel estéril en la campana de la cultura de célula. Tomar una placa de 96 pocillos con células de la incubadora. Suavemente y varias veces toque la placa boca abajo en la pila de toallas de papel para que el medio es completamente absorbido por la toalla de papel.
    Nota: No con fuerza o bruscamente golpee la placa como uno podría perder células.
  7. Transferir 50 μl de la mezcla de transfección combinado en cada pocillo de la placa de 96 pocillos e incubar durante la noche por 18-24 h a 37 ° C con 5% CO 2.
    Nota: Un programa de transfección y la estimulación logró tiempo debe preceder a la medición cuando se prueban más de una placa de 96 pocillos en un experimento para tener todas las placas miden después del mismo tiempo de transfección y tiempo de exposición del estímulo.

4. Estimulación y medición o actividad usando el ensayo de campo en tiempo real

  1. observar las células transfected con un microscopio de contraste de fase para asegurar una adecuada confluencia de 50-80% por pozo y vuelva a la incubadora.
  2. Preparar el medio de la estimulación mediante la adición de 10 mM hidroxietil-1-ácido ácido (HEPES) y 5 mM glucosa a Hank ' s solución sal balanceada (HBSS).
  3. Descongelar las alícuotas de reactivo sustrato de ensayo de campo en tiempo real en el hielo. Almacenar el reactivo substrato a-80 ° C a 55 μl por tubo en tubos de PCR. 1 tubo por placa.
  4. Preparar solución de equilibrado 2% mezcla 55 μl del reactivo de sustrato y solución de glucosa HEPES de HBSS 2750 μl.
  5. Extienda una capa gruesa de toallas de papel en el Banco. Varias veces y suavemente golpee la placa boca abajo sobre la toalla de papel para que el medio de transfección es completamente absorbido por la toalla de papel.
  6. Lavar las células por Pipetear 50 μl de solución de glucosa HEPES de HBSS a cada pocillo.
  7. Grifo suavemente y varias veces la solución de glucosa HEPES de HBSS de la placa de 96 pozos.
  8. Pipeta 25 μl de la solución de equilibrio de 2% a cada uno bien e incubar a temperatura ambiente en oscuridad durante 2 h.
  9. Preparar por adelantado 1 M soluciones odorante en DMSO y almacenar a-20 ° C hasta su uso.
  10. Antes del final de la incubación, diluir las soluciones stock de olor a las concentraciones de trabajo en medio de estimulación de la HBSS/HEPES/glucosa.
    Nota: Las concentraciones de las diluciones de olor preparadas en este paso se deben duplicar para obtener las concentraciones finales correctas en cada pozo.
  11. Con un QL placa lector y antes además de odorante, medir el nivel basal de la luminescencia de la placa por 2 veces consecutivas a una velocidad de 1000 ms por bien 34.
  12. Rápidamente Retire la placa del lector de la placa y añadir diluciones de odorante de 25 μl a cada pocillo inmediatamente iniciar la medición de la luminiscencia continua de todos los pozos de 20 ciclos dentro de 30 minutos
    Nota: Pipeta cuidadosamente para evitar la contaminación los vecinos pozos al usar diferentes olores o diferentes concentraciones de los mismos odorantes en el mismo plato.

5. Análisis de datos

  1. exportar los datos desde el software de lector de placa de quimioluminescencia.
  2. Cálculo normalizado respuesta OR para cada punto de tiempo utilizando la fórmula de
    (luminiscencia N – luminiscencia basal) / (luminiscencia mayor – luminiscencia basal)
    donde N = el valor de luminiscencia de un determinado bien; basal = valor promedio de luminiscencia de los dos basales valores de luminiscencia; más alto = mayor valor de luminiscencia de un plato o un conjunto de placas de.
    Nota: Dependiendo de la finalidad del experimento, pueden adoptarse representaciones gráficas alternativas. Por ejemplo, para la detección del análisis (ver figura 1) y para la generación de curvas de respuesta a la concentración, el valor de luminiscencia de un cierto bien en un momento deseado durante la medición cinética, como el valor máximo o el valor final, se puede usar.

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Resultados

Muscone es el principal componente aromático de almizcle natural. Recientes estudios OR5AN1 identificados como un receptor humano para el muscone y otros compuestos macrocíclicos de almizcle basadas en homología con el ratón o, MOR215-1, reproducido de glomérulos muscone-responsivo en comportarse ratones37,38. Por proyección el repertorio humano de OR, nuestro grupo y el grupo Touhara también identificado OR5AN1 como un rec...

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Discusión

Medir con precisión la activación de un OR con la exposición a un determinado odorante es el primer paso para descifrar la codificación de la información olfativa. Los experimentos se muestra en esta representan estudio que un ejemplo de cómo se puede identificar, mediante una en vitro sistema de expresión OR, or sensible entre el repertorio humano de OR para el olor químico de interés y posteriormente caracterizar el receptor Farmacología utilizando diferentes concentraciones de la sustancia. Nuestros...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El trabajo fue apoyado por la Fundación de ciencia nacional chino (31070972), ciencia y tecnología Comisión de Shangai municipio (16ZR1418300), el programa para innovadores investigación equipo de Shanghai Municipal Comisión de educación, el Shanghai oriental Programa (J50201) y el programa de investigación básica Nacional de China (2012CB910401).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BSigmaA2942
DMSOSigmaD2650
FBSGibco10099-141
GloSensor cAMP reagentPromegaE1290
pGloSensor-20F cAMP plasmidPromegaE1171
Hana3A cellsavailable from authors upon request
HBSS, without calcium or magnesiumGIBCO14175095
HEPESHycloneSH30237
Lipofectamine2000Invitrogen11668-019
M3R plasmidcloned into a mammalian expression vector such as pCI
MEM, with EBSS and L-glutamineHycloneSH30024
MusconeSanta Cruzsc-200528
Musk tibeteneSigma-AldrichS359165
OR plasmidscloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI
PBS, without calcium or magnesiumCellgro21-040-CV
Penicillin-streptomycinHycloneSV30010
Plasmid miniprep kitTiangenDP103-03
PuromycinSigmaP8833
RTP1S plasmidcloned into a mammalian expression vector such as pCI
Trypsin-EDTAHycloneSH30236
0.2-mL PCR tubeAxygenPCR-02-C
1.5-mL Eppendorf tubeEppendorf
15-mL 17 mm x 120 mm conical tubeBD Falcon352096
8-well and/or 12-well multichannel pipetmanEppendorf
96-well flat-bottomed white cell culture plateGreiner655098
100 mm x 20 mm cell culture dishBD Falcon353003
Class II biological safety cabinet with laminar flow
Cell culture incubator, with 5% CO2
Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes
Infinite F200 plate readerTecan
Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives
Spectrophotometer
Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution
Sterile paper towel

Referencias

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