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Résumé

Caractériser le fonctionnement des récepteurs odorants sert un élément indispensable dans le processus de deorphanization. Nous décrivons une méthode permettant de mesurer l’activation des récepteurs odorants en temps réel à l’aide d’un test de cAMP.

Résumé

La taille énorme des familles mammifères odorant du récepteur (OR) présente des difficultés à trouver leurs ligands apparentés parmi de nombreux produits chimiques volatils. Pour efficacement et précisément deorphanize ORs, nous combinons l’utilisation d’une lignée de cellules hétérologues d’exprimer les mammifères ORs et un plasmide génétiquement modifié biocapteur permettant de mesurer la production d’AMPc en aval de l’activation d’OR en temps réel. Ce test peut être utilisé pour écran odorisants contre ORs et vice versa. Interactions positives odorant-récepteur à partir des écrans peuvent être confirmées par la suite en testant contre diverses concentrations d’odeurs, générant des courbes concentration-réponse. Ici, nous avons utilisé cette méthode pour effectuer un criblage à haut débit d’un composé odorant contre une bibliothèque OR humain exprimés dans les cellules Hana3A et a confirmé que le récepteur répond positivement est le récepteur apparenté du composé d’intérêt. Nous avons trouvé cette méthode de détection de haut débit pour être efficaces et fiables pour évaluer l’activation de l’OR et nos données fournissent un exemple de son utilisation possible dans les études fonctionnelles d’OR.

Introduction

Le sens de l’odorat joue un rôle important dans la survie des animaux qu’ils comptent sur leurs capacités olfactives pour procurer de la nourriture, éviter les prédateurs et le danger, distinguer les espèces et sélectionnez mate1,2. La réalisation de ces fonctions dépend les récepteurs odorants (RUP), qui sont exprimés individuellement à la surface ciliaire des neurones sensoriels olfactifs (OSNs) située dans l’épithélium olfactif (OE). SRO constitue la plus grande famille de la superfamille des récepteurs (GPCR) G-protéine a couplé avec environ 400 et 1200 divers OR gènes chez les humains et les souris, respectivement3,4,5. RUP activé par odorisants conduire à une augmentation taux d’AMPc intracellulaires via l’activation séquentielle d’olfactif G-protéine (Golf) et tapez III l’adénylyl cyclase (ACIII). L’augmentation qui en résulte du niveau d’AMPc intracellulaire pourrait fonctionner comme un second messager, qui ouvre le canal de nucléotides bloquées sur la surface des cellules, provoquant l’afflux des cations dont Ca2 + et les potentiels d’action et le lancement en fin de compte neuro-potentiel transmission et perception olfactive. Le processus de détection et de discrimination un grand nombre de substances odorantes par ORs est considéré comme la première étape de la perception olfactive6,7.

Étant donné que Buck et Axel8 tout d’abord avec succès cloné récepteurs odorants et élucidé le mécanisme de la perception olfactive initiée par ORs, deorphanization de la famille de l’OR est devenu l’un des points chauds dans ce domaine. Diverses méthodes in vivo, ex vivo et in vitro pour mesurer l’activation de l’OR ont été déclarés9,10,11,12. Une méthode traditionnelle utilisée Ca2 + imagerie suivie de single-cell RT-PCR sur OSNs permis l’identification de différents ORs à aliphatiques composés malodorants13,14,15. Plus récemment, l’avènement des analyses à grande échelle transcriptome a favorisé le développement de méthodes plus haut débit en vivo . Le dosage de Kentucky identifié souris eugénol et muscone-favorisant l’ORs avec l’utilisation de la S100a5-tauGFP journaliste souris souche et microarray analysis9. Selon la diminution des niveaux d’ARNm de l’OR après exposition odorant, la technologie de rêve employé une approche transcriptomique afin de déterminer les profils activation OR dans les deux espèces de vertébrés et non-vertébré16. De même, compte tenu de la phosphorylation de S6 activations neuronales, la Matsunami groupe séquencée ARNm de ribosome phosphorylés immunoprécipitation pour identifier les réactifs ORs12. Enfin, le groupe Feinstein a rapporté souris super renifleur qui pourraient servir de plate-forme pour étudier l’odeur codage en vivo, connu comme la technologie de MouSensor17.

Dans le domaine in vitro , le défi de la mise en culture OSNs a fait un système d’expression hétérologue qui imite ou expression fonctionnelle in vivo une solution idéale pour effectuer un dépistage à grande échelle de produits chimiques odorantes pour ORs. Néanmoins, étant donné que les lignées de cellules cultivées d’origines non-olfactifs diffèrent des OSNs natifs, ou protéines sont conservées dans le réticulum endoplasmique et incapable de faire le trafic vers la membrane plasmique, entraînant perte de récepteur fonction18 et la dégradation de l’OR , 19. pour résoudre ce problème, importants travaux ont été faits pour répliquer l’expression fonctionnelle d’OR sur la membrane cellulaire dans les lignées cellulaires hétérologue. Krautwurst et coll. d’abord attaché les 20 premiers acides aminés de la rhodopsine (Rho-tag) à la N-terminale de la protéine de l’OR et cela favorisé l’expression de la surface cellulaire de certains ORs de cellules humaines embryonnaires de rein (HEK)20. En procédant à une analyse en série de (SAGE) Bibliothèque analyse l’expression génique de OSNs unique, Saito et al. tout d’abord cloné transportant des récepteurs protéiques (RTP) membres de la famille, RTP1 et RTP2 et la protéine réceptrice de l’enrichisseur expression 1 (REEP1) qui a facilité le trafic d’OR à la membrane cellulaire et améliorés de réponses véhiculées par les odorants des RUP dans les cellules HEK293T 21. se fondant sur ces constatations, le groupe Matsunami réussi à établir la lignée de cellules Hana3A, stablement transfected avec RTP1, RTP2, REEP1 et Gαolf dans HEK293T et transitoirement transfectées avec ORs Rho-tag, efficaces ou fonctionnels expression. Les études ont révélé 1) une forme plus courte de RTP1, RTP1S, qui pourrait plus fermement favorisent ou fonction que la protéine originale de RTP1 et 2) le récepteur muscarinique de l’acétylcholine, type 3 (M3R) qui pourrait augmenter l’activité d’OR par l’intermédiaire de l’inhibition de la β-arrestine-2 recrutement, qui ont été introduits dans le système d’expression hétérologue pour optimiser expérimental sortie22,23.

Plusieurs méthodes de détection ont été utilisés pour quantifier l’activation des récepteurs dans les systèmes hétérologues. Le dosage de la phosphatase alcaline placentaire sécrétées (SEAP) travaille avec une enzyme de journaliste transcriptionnellement réglementée par des éléments de réponse de l’AMPc (CREs), ce qui en fait une option intéressante pour évaluer l’activation de l’OR. La fluorescence est facilement détectée dans un échantillon de milieu de culture après l’incubation avec SEAP détection réactif24. En utilisant cette méthode, les fonctions d’ORs comme une classe secondaire des récepteurs chemosensoriels exprimée dans la trace de OE-les récepteurs associés à amine (TAARs) ont été caractérisent25,26,27. Une autre méthode courante, le dosage de la luciférase, utilise un gène rapporteur luciférase de firefly sous le contrôle de l’élément de réponse de l’AMPc (CRE). Luminescence générée par la production de la luciférase procure un moyen efficace et robuste de quantifier OR activation10,11,28.

Des tests en temps réel de cAMP aussi sont sont répandues dans la surveillance dynamiquement la fonction des RCPG hétérologues ou endogènes. Un exemple de ces tests avancés tire parti d’une variante de biocapteur génétiquement codé, qui possède un domaine de liaison au cAMP fusionné à une forme mutante de la luciférase. Lorsque le cAMP se lie, le changement conformationnel aboutit à l’activation de la luciférase, luminescence d'où peut ensuite être mesurée avec un lecteur de chimiluminescence29,30. La technologie en temps réel de cAMP a été signalée pour l’orphelin hors des récepteurs de l’odeur humaine dans les cellules HEK293 et NxG de 108CC15âne = « xref » > 31,32,33, ainsi que dans le Hana3A dérivé de HEK293T cellules34,35. Le groupe Krautwurst a également décrit en détail la technologie cAMP en temps réel afin de convenir aux bi-directionnel à grande échelle ou la projection des approches32,33.

Nous décrivons ici un protocole permettant de mesurer l’activation d’OR à l’aide d’un essai en temps réel de cAMP dans les cellules Hana3A. Dans ce protocole, la luminescence des cellules vivantes préalablement équilibrés est cinétiquement mesurée pendant 30 min après le traitement par certains composés volatils, ce qui représente une analyse plus efficace et plus précise de l’activation d’OR qui sont moins sensibles aux artefacts qui se produisent dans l’environnement cellulaire avec temps prolongé et la toxicité cellulaire induite par l’odeur. Cette mesure en temps réel permet un dépistage à grande échelle des ORs et des ligands, ainsi que la caractérisation des paires d’OR-ligand spécifiques d’intérêt. En utilisant cette méthode, nous avons avec succès identifié OR5AN1 comme le récepteur de la muscone composés de musc en réalisant une projection contre 379 ORs humaines et en confirmant par la suite le résultat du dépistage positif.

Protocole

1. Culturing et Maintenance des cellules Hana3A

  1. cellules de maintenir dans 10 mL de milieu essentiel minimum (MEM) avec 10 % sérum bovin fœtal (SVF), 100 µg/mL la pénicilline-streptomycine et 1,25 µg/mL amphotéricine B dans un 100 mm boîte de Petri de cellules dans un incubateur de culture cellulaire de 37 ° C avec 5 % de CO 2. Avec chaque autre passage, ajouter 1 puromycine µg/mL pour maintenir la transfection stable des plasmides (voir Introduction).
    Remarque : Effectuez toutes les étapes de culture cellulaire dans une classe II hotte biologique de sécurité afin d’assurer un environnement stérile.
  2. Sous-culture à un ratio de 10 à 20 % dans les 100 mm plats tous les jours 2-3.

2. Placage de cellules pour la Transfection

  1. observer les cellules de Hana3A sous un microscope à contraste de phase pour assurer la viabilité des cellules et d’estimer confluent.
  2. Aspirer tous les moyen de la boîte de Petri cell.
  3. Laver les cellules en ajoutant 10 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sur la plaque, agitant le plat et aspirer le PBS.
  4. Ajouter 3 mL de 0.05 % trypsine-acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) sur la plaque. Mélanger pendant 1 min ou jusqu'à ce que toutes les cellules sont à flot.
    Remarque : Observer l’évolution de cellules détacher le fond de la plaque sous le microscope comme nécessaire.
  5. Désactiver la trypsine en ajoutant 5 mL de MEM avec 10 % FBS et pipette up et down pour briser les morceaux de cell Mass
    Remarque : Pour l’électrodéposition avant la transfection, le support utilisé ne doit pas contenir antibiotiques. Ajout d’antibiotiques peut-être diminuer l’efficacité de transfection.
  6. Transférer une quantité appropriée de cellules dans un tube de mLl-15 selon le nombre de plaques à transfecter. Pour chaque plaque à 96 puits, plaque 2 x 10 6 cellules ou environ 1/5 d’un plat de confluentes 100 mm 100 %, ce qui donne un nombre de cellules de 2 x 10 4 cellules par puits ou d’une densité d’environ 15 à 30 % confluence / puits. Centrifuger les tubes à 200 x g pendant 5 min et aspirer le surnageant sans déranger le culot cellulaire.
    Remarque : Calculer le montant exact des cellules pour être ensemencés sur des plaques de 96 puits afin d’éviter les recouvrant ou undergrowing des cellules avant stimulation.
  7. Ajouter une quantité appropriée de MEM avec 10 % FBS dans le 15 mL tube et Pipeter de haut en bas pour briser les morceaux de la cellule de masse. Pour chaque plaque à 96 puits, remettre en suspension les cellules avec 6 mL de MEM avec 10 % BF.
    Remarque : Veillez à ne pas à générer des bulles d’air dans le tube.
  8. Ajouter les cellules en suspension dans un réservoir. À l’aide d’une pipette multicanaux, pipette 50 µL de cellules sur chaque puits d’une plaque de 96 puits. Incuber une nuit à 37 ° C, avec 5 % de CO 2.

3. Transfection des plasmides

  1. avant la transfection, observer les cellules plaqués pour assurer une bonne confluence d’environ 30 à 50 % par puits sous un microscope à contraste de phase et de revenir à l’incubateur.
  2. Préparer à l’avance la Rho-tag OR construct 11 , 21 , 22 , 28, le facteur accessoire construit (RTP1S 22 , 36 et M3R 23), et la variante de biocapteur construire 29 , 30 par miniprep. Quantifier la concentration d’ADN par un spectrophotomètre et ajuster des concentrations d’ADN plasmidique (par exemple, à 100 ng/µL) avec de l’eau distillée si nécessaire.
  3. Préparation des mélanges de la Transfection
    1. prépare un mélange de transfection de plasmide dans 500 µL de MEM pour chaque plaque de 96 puits selon le tableau 1.
      Remarque : Lorsque différents ORs sont testés sur la même plaque 96 puits, le volume de la mélange de transfection et la quantité d’ADN ajouté plasmidique doit être adapté en fonction du nombre de puits transfectées avec un donné ou.
    2. Préparer un mélange de transfection dans un tube avec 18 µL de réactif de transfection de médiation lipidique dans 500 µL de MEM.
  4. Mélanger le mélange de plasmide avec le mélange de transfection par pipetage de haut en bas. Incuber à température ambiante pendant 15 min.
  5. Arrêter la réaction en ajoutant 5 mL de MEM avec 10 % BF.
  6. Étalé une épaisse couche d’essuie-tout stérile dans la hotte de la culture cellulaire. Prendre une plaque à 96 puits avec des cellules de l’incubateur. Doucement et à plusieurs reprises Appuyez sur la plaque à l’envers sur la pile de papier essuie-tout afin que le milieu est complètement absorbé par le papier absorbant.
    Remarque : Ne pas avec force ou brusquement taper la plaque comme on pourrait perdre des cellules.
  7. Transférer 50 µL du mélange combiné transfection dans chaque puits de la plaque à 96 puits et incuber pendant la nuit pendant 18 à 24 heures à 37 ° C, avec 5 % de CO 2.
    Remarque : Un calendrier de transfection et stimulation temps géré doit précéder la mesure lorsque plus d’une plaque à 96 puits sont testés dans une expérience afin d’avoir toutes les plaques mesurées après la transfection fois et le temps de pose stimulation.

4. Stimulation et instruments de mesure ou activité à l’aide du test de cAMP en temps réel

  1. observer les cellules transfectées sous un microscope à contraste de phase pour assurer une bonne confluence de 50 à 80 % par puits et revenir à l’incubateur.
  2. Préparer le moyen de stimulation en ajoutant 10 mM hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acide (HEPES) et 5 mM de glucose à Hank ' s Balanced Salt Solution (HBSS).
  3. Décongeler les aliquotes de réactif de substrat essai cAMP en temps réel sur la glace. Réactif de substrat de magasin à-80 ° C à 55 µL par tube en tubes PCR. Utiliser 1 tube par plaque.
  4. Préparer 2 % solution de l’équilibration en mélangeant 55 µL de réactif au substrat et 2750 µL de solution de glucose/HEPES/HBSS.
  5. Étalé une épaisse couche de papier absorbant sur le banc. Doucement et à plusieurs reprises Appuyez sur la plaque à l’envers sur du papier absorbant afin que le milieu de la transfection est complètement absorbé par le papier absorbant.
  6. Laver les cellules par pipetage 50 µL de solution de HBSS/HEPES/glucose dans chaque cupule.
  7. Taper doucement et à plusieurs reprises la solution HBSS/HEPES/glucose de la plaque à 96 puits.
  8. Pipette 25 µL de solution d’équilibration de 2 % à chaque puits et incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 2 h.
  9. Préparer à l’avance de 1 M de solutions odorant dans le DMSO et conserver à-20 ° C jusqu'à ce que.
  10. Avant la fin de la période d’incubation, diluer les solutions mères odorant à des concentrations de travail en milieu de stimulation HBSS/HEPES/glucose.
    Remarque : Les concentrations des dilutions odorant préparées dans cette étape doivent être doublées pour obtenir les concentrations finales correctes dans chaque puits.
  11. à l’aide d’une chimiluminescence lecteur et avant l’ajout de la substance odorante, mesurer le niveau de luminescence basale de la plaque pour 2 fois de suite à un taux de 1000 ms par bien 34.
  12. Rapidement retirer la plaque du lecteur plaque et ajouter des dilutions de substance odorante 25 µL à chaque puits et commencer immédiatement la mesure de la luminescence continue de tous les puits pendant 20 cycles dans les 30 min.
    NOTE : Pipette avec précaution pour éviter de contaminer les voisins puits lors de l’utilisation de différentes substances odorantes et/ou des concentrations différentes de la même odorisants dans la même assiette.

5. Analyse des données

  1. Exporter les données depuis le logiciel de lecteur de plaque chimiluminescence.
  2. Calculer normalisé réponse OR pour chaque point de temps à l’aide de la formule
    (luminescence N – luminescence basale) / (luminescence plus haut – luminescence basale)
    où N = valeur de la luminescence d’un certain bien ; basal = valeur moyenne luminescence des deux basales valeurs de la luminescence ; plus haut = valeur la plus élevée luminescence d’une plaque ou un ensemble de plaques.
    Remarque : Selon le but de l’expérience, autres représentations graphiques peuvent être adoptées. Par exemple, pour le dépistage des essais (voir Figure 1) et pour générer des courbes concentration-réponse, la valeur de la luminescence d’un certain puits à un point de temps désirée pendant la mesure cinétique, telles que la valeur maximale ou la le montant final, peut être utilisé.

Résultats

Muscone est le principal composant aromatique du musc naturel. Récentes études OR5AN1 identifié comme un récepteur humain pour muscone et autres composés de musc macrocycliques issus d’homologie avec la souris ou, MOR215-1, clonée à partir des glomérules muscone réagissant en comportement souris37,38. En sélectionnant le répertoire OR humain, notre groupe et le groupe Touhara également identifié OR5AN1 comme un réc...

Discussion

Mesurer avec exactitude l’activation de l’OR après une exposition à une certaine substance odorante est la première étape en déchiffrant le codage de l’information olfactive. Les expériences montré dans cet étude représentent qu'un exemple de la façon dont on peut identifier, en utilisant un in vitro système d’expression OR, ORs sensibles parmi le répertoire OR humain pour la substance odorante d’intérêt et ensuite caractériser les récepteurs pharmacologie à l’aide de différentes co...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Le travaux ont été subventionnés par la Chinese National Science Foundation (31070972), la Science et la technologie Commission of Shanghai Municipality (16ZR1418300), le programme novateur recherche équipe de Shanghai Municipal Education Commission, le Shanghai Eastern Scholar Program (J50201) et le Programme National de recherche fondamentale de la Chine (2012CB910401).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BSigmaA2942
DMSOSigmaD2650
FBSGibco10099-141
GloSensor cAMP reagentPromegaE1290
pGloSensor-20F cAMP plasmidPromegaE1171
Hana3A cellsavailable from authors upon request
HBSS, without calcium or magnesiumGIBCO14175095
HEPESHycloneSH30237
Lipofectamine2000Invitrogen11668-019
M3R plasmidcloned into a mammalian expression vector such as pCI
MEM, with EBSS and L-glutamineHycloneSH30024
MusconeSanta Cruzsc-200528
Musk tibeteneSigma-AldrichS359165
OR plasmidscloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI
PBS, without calcium or magnesiumCellgro21-040-CV
Penicillin-streptomycinHycloneSV30010
Plasmid miniprep kitTiangenDP103-03
PuromycinSigmaP8833
RTP1S plasmidcloned into a mammalian expression vector such as pCI
Trypsin-EDTAHycloneSH30236
0.2-mL PCR tubeAxygenPCR-02-C
1.5-mL Eppendorf tubeEppendorf
15-mL 17 mm x 120 mm conical tubeBD Falcon352096
8-well and/or 12-well multichannel pipetmanEppendorf
96-well flat-bottomed white cell culture plateGreiner655098
100 mm x 20 mm cell culture dishBD Falcon353003
Class II biological safety cabinet with laminar flow
Cell culture incubator, with 5% CO2
Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes
Infinite F200 plate readerTecan
Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives
Spectrophotometer
Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution
Sterile paper towel

Références

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