داخل الأنف تسليم الخلايا الجذعية العلاجية إلى الورم الدبقي في نموذج الفأر

Summary

الخلايا الجذعية هي حاملات علاجية واعدة لعلاج أورام المخ بسبب استدارة الورم الجوهرية. غير الجذعية داخل الخلايا الجذعية تسليم تسليم يتجاوز حاجز الدم في الدماغ ويظهر إمكانات قوية للترجمة السريرية. هذه المقالة تلخص المبادئ الأساسية للتسليم الخلايا الجذعية داخل الأنف في نموذج الماوس من الورم الدبقي.

Abstract

إن النزعة الذاتية تجاه الأورام الخبيثة في الدماغ تجعل الخلايا الجذعية ناقلات واعدة من العوامل العلاجية ضد الأورام الخبيثة. تسليم الخلايا الجذعية العلاجية عبر الطريق الأنف هو استراتيجية بديلة اكتشفت مؤخرا، مع إمكانات قوية للترجمة السريرية، وذلك بسبب طبيعته غير الغازية مقارنة مع زرع داخل الجمجمة أو التسليم عن طريق الطرق النظامية. عدم وجود حاجز الدم في الدماغ يزيد من القدرة العلاجية للخلايا الجذعية التي تمر دخول الدماغ داخل الأنف. يلخص هذا المقال التقنيات الأساسية المستخدمة في دراساتنا ويحدد المبادئ الأساسية لاستراتيجية الأنف لتسليم الخلايا الجذعية باستخدام نموذج الماوس من زينوغرافتس الورم داخل الجمجمة. نحن نبرهن على الإجراءات المثلى التي تولد نتائج متسقة وقابلة للتكرار مع معلمات تجريبية محددة سلفا وتقديم مبادئ توجيهية لتدفق العمل مبسطة التي تضمن التنفيذ الفعال وموثوق بها إكسيريمناتال. تم تصميم هذه المادة لتكون بمثابة خط الأساس لمزيد من التخصيص التجريبي على أساس الفرضية، أنواع الخلايا الجذعية، أو تفاصيل الورم.

Introduction

سمية منخفضة، وانخفاض المناعة، و تروبيسم ورم الدماغ الذاتية من الخلايا الجذعية البشرية هي سمات جذابة لتقديم المركبات العلاجية ¹ . العلاجات المستندة إلى الخلايا الجذعية الجديدة لأورام الدماغ الخبيثة هي ابتكارات واعدة وضعت في السنوات الأخيرة، والتكيف الأنف من هذه الاستراتيجية العلاجية يمثل قفزة نحو الترجمة السريرية، في أن الإدارة غير الغازية والمتكررة قد تقلل بشكل كبير من حاجز لتطبيقات المريض و قد تكون قابلة للتكيف لخدمات المرضى الخارجيين دون التخدير العام أو خدمة طويلة للمريض الداخلي المرتبطة الإجراءات الجراحية الغازية ^{1 ، 2 ، 3 ، 4} .

نحن وغيرنا من رواد رائدة في طريق الأنف من تسليم الخلايا الجذعية إلى أورام الدماغ، ووضعت الأرض العمل لبعض المبادئ الأساسيةمن البحوث متعدية باستخدام نماذج الطعم أجنبي الماوس ^{2 ، 3 ، 4} ، وكذلك التحقيق في هجرة الخلايا الجذعية في الجسم الحي عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي (مري) حاملات كاشف ² . من خلال هذه الاستكشافات الرائدة، تراكمت لدينا خبرة كبيرة واكتسبت نظرة على كيفية بناء أفضل استراتيجية تقييم ما قبل السريرية قوية باستخدام الراسخ المستمدة المريض طيور أجنبي (بدكس) نماذج الماوس من الورم الخبيث، مع الحفاظ على قرار التحقيق لفحص تفاصيل ميكانيكية دقيقة من الظواهر البيولوجية المتطورة من دخول الدماغ داخل الأنف من الخلايا الجذعية العلاجية تسليمها إلى تجويف الأنف. هنا، نحن تصف مبادئ بروتوكول التشغيل موحدة لإظهار الحالة الراهنة من التحقيقات التجريبية باستخدام راسخة العصبية البشرية خط الخلايا الجذعية HB1.F3.CD ^{5 ، 6 ، 7 ، 8 ، وهو قابل للتعديل بسهولة للتكيف مع نماذج الورم محددة أو استراتيجيات باستخدام الخلايا الجذعية البشرية كما الناقلين العلاجية.}

Protocol

يجب أن تتم الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (إاكوك) أو ما يعادلها. إذا كان هناك أي عدم يقين بشأن الإجراءات المحددة الموضحة هنا، لا المتابعة. توضيح مع إاكوك المؤسسة وموظف بيطري معين.

1. ضمان عقم الخلايا المستزرعة واتباع مبادئ تقنيات العقيم

1. اتبع الممارسة مختبر جيد القياسية في جميع إجراءات زراعة الخلايا ومتطلبات إاكوك لاختبار الخلايا والممرضة تأكيد حالة خالية قبل أن تدير على الفئران ^{9 ، 10} .
2. اتبع متطلبات المعاهد الوطنية للصحة لمصادقة الخلية لضمان النتيجة استنساخه ¹¹ .
3. اتبع تقنيات الجراحة الحيوانية المعقمة التي تم تحديدها في هذه المخطوطة ⁴ .

2. إعداد خلايا غليوما ل <إم> في فيفو إكسيريمنت ^{2 ، 4}

1. خلايا الدم الدبقية (GBM43 و GBM6 و U87MG) في مصل الدم البقري الجنيني (10٪) في وسط دولبيكو المتوسط ​​النسر المعدل (دمم)) أو الوسط الخالي من المصل (الوسط العصبي مع المكملات B27، N2، الهيبارين، عامل نمو البشرة [ إغف]، عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية [بفغف]، والمضادات الحيوية، و L- الجلوتامين ¹² )، في ترطيب كو ₂ حاضنة ثقافة الخلية.
   1. اختبار جميع خطوط الخلايا عبر لوحة الماوس واضحة تشغيل من مقدمي الخدمات التجارية.
2. جمع الخلايا الملتصقة عن طريق إزالة المتوسطة الثقافة. احتضان مع 0.05٪ التربسين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (1 مل من التربسين لقارورة T25، 2 مل ل T75 قارورة، وحجم وفقا لثقافات قوارير مع مساحة أكبر) ثم يغسل الخلايا مع الكالسيوم ^{2 +} و مغ ^{2 +} الفوسفات الحرة مخزنة المالحة (بس).
   1. اضغط علىقارورة لطرد الخلايا وتحييدها فورا مع فائض من المتوسطة التي تحتوي على مصل (8 - 9 مل). ثم استخدام ماصات المصلية لنضح تعليق الخلية في أنابيب الطرد المركزي.
   2. تعليق خلية الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق. غسل الخلية مرتين على الأقل مع 10 مل من برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي المتكررة.
   3. جمع خلايا الورم نمت كما المجالات الورم في وسط خالية من المصل عن طريق الطرد المركزي (نفس السرعة والمدة على النحو الوارد أعلاه). فصل خلية بيليه عن طريق الحضانة في 1 - 2 مل من محلول انفصال الخلية عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل غسل مرتين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي (400 × 5 دقائق).
   4. إعادة تعليق الورم الدبقي في محلول ملحي معقم بتركيز من 50،000 - 200،000 خلية لكل 2.5 ميكرولتر. أرقام الخلايا المستخدمة للحقن في الدماغ الماوس تعتمد على معدل النمو الثابت لكل خط خلية دبقية. هنا، استخدام 25،000 و 100،000 ل GBM43 و GBM6 الخلايا السرطانية المستمدة من المريض، على التوالي.
   5. إعداد ضعف كمية نيسساري لعدد الزرع لحساب فقدان جزء أثناء الإجراء. نقل تعليق خلية عن طريق الحقن إلى أنبوب ميكروسنتريفوج العقيمة ووضع أنبوب على الجليد. إبقاء الخلايا على الجليد لمدة 2 ساعة كحد أقصى أثناء العمليات الجراحية، وإعداد دفعة جديدة إذا كان من المقرر الجراحات الممتدة.

3. داخل الجمجمة زرع لخلق طعم أجنبي نماذج الماوس ( الشكل 1A ) ^{2 ، 4 ، 13}

1. قبل يوم الجراحة، وتعقيم جميع الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف، وإعداد كل ما قبل وبعد الجراحة المواد رعاية الحيوان في إاكوك بروتوكول المعتمدة. تعقيم الإطار التجسيمي والمعدات الطرفية لضمان ظروف معقمة أثناء العملية، وبالتالي تقليل المضاعفات.
2. تنظيم منطقة العملية للحد من فوضى وإمكانية التلوث.
3. اللباس في معدات الحماية الشخصية المناسبة(ب) وفقا لمتطلبات إاكوك.
4. إعداد المناسبة غرفة الانتعاش بعد الجراحة. تأكد من أن التخدير والمسكنات مستعدة طازجة باستخدام الكواشف غير المنتهية. إعداد المناسبة أدوات صيانة حرارة الجسم في إاكوك وافق البروتوكول.
5. لإنشاء زينوغرافتس خلية دبقية المستمدة من المريض البشري لاختبار تسليم الأنف من نسس الإنسان، واستخدام أنواع الماوس المناعة مثل نو / نو الماوس الأثيمية من أي نوع الجنس في حوالي 6 أسابيع من العمر.
6. تخدير الحيوان على أساس وزن الجسم باستخدام الكواشف المعتمدة، أي إما عن طريق الحقن داخل الصفاق (إب) من خليط من الكيتامين (50-100 ملغ / كغ؛ استشارة إاكوك المؤسسي لنطاق الجرعة المعتمدة) وزيلازين (5-10 ملغ / كغ؛ استشارة إاكوك المؤسسية لنطاق الجرعة المعتمدة) في 200-250 ميكرولتر محلول ملحي معقم، أو عن طريق 4-5٪ إيسوفلوران التخدير باستخدام جهاز استنشاق.
   1. تأكد من أن الحيوان قد وصلت إلى طائرة التخدير الجراحية بy تو معسر قبل شق الجلد. تطبيق وافرة هلام العيون العقيمة لضمان حالة رطبة من القرنيات من الحيوان.
7. تعقيم الجمجمة باستخدام مناديل دائرية المتكررة والتناوب من بيتادين والكحول الأيزوبروبيل لكل بريتشيت-كورنينج وآخرون. ^{14 -}
8. توريد قبل تسكين شق عن طريق حقن سك من بوبرينكس (0.05 - 2 ملغ / كلغ) قبل شق باستخدام شفرة الجراحية.
9. استخدام قضيب تعقيم القطن ذات الرؤوس لمساعدة مرقئ في حين تعريض الجمجمة. استخدام 3٪ بيروكسيد الهيدروجين لتسهيل إزالة النزيف العرضي.
10. استخدام بطارية تعمل باليد الحفر الكهربائية المحمولة (أقل من 1 ملم في العرض) لخلق ثقب لدغ في 2 مم الوحشي، إما اليسار أو اليمين، إلى خط الوسط، و 2 مم وراء بريجما (يمكن تخصيص إحداثيات الموقع على أساس على نموذج الورم المقصود لدراسة معينة).
11. جبل الحيوان إلى الإطار التجسيمي إلى أدوبلاته رئيس الموقف، بحيث إدراج هاميلتون الحقنة الصغيرة عمودي على سطح الجمجمة حول ثقب لدغ. الحرص على ضمان أن الطائرة مخدر الحيوان في وضع جيد من قبل اصبع القدم معسر. مراقبة معدل التنفس للتأكد من أن الحيوان ليس تحت الإجهاد الألم خلال الخطوات التالية.
    * نحن لا نؤكد في الأذن بار المواضع ل:
    1. لدينا بريدريلد ثقب لدغ لوضع الإبرة، وبالتالي، دقيقة إحداثيات الجمجمة هي لا لزوم لها.
    2. قنوات الأذن الماوس هي هشة، ووضع الأذن في الأذن الحانات دقيقة تتطلب التدريب أكثر تورطا التي ليست ذات صلة غرضنا. مخاطر الأضرار التي لحقت قنوات الأذن الفئران تفوق فوائد وضع الدقيق.
    3. دعم الخد هو أسهل بكثير لأداء وقادرة على تحقيق نفس مستويات استقرار الرأس الماوس والتوازن أثناء تحديد المواقع. بل هو فائدة إضافية لعدة عمليات حساسة للوقت لضمانوالانتهاء في الوقت المناسب مع بقاء الخلية جيدة.
12. استخدام المقابض الإطار التجسيمي لوضع الحقنة الصغيرة طرف مسطح إلى ثقب لدغ، ثم خفضه ببطء إلى 3 مم تحت سطح الجافية. سحب 0.5 ملم للحفاظ على غيض من الإبرة في 2.5 مم تحت الجافية.
13. حقن 2.5 ميكرولتر من الخلايا الدبقية مسبقة على مدى فترة 1 دقيقة. السماح لإبرة الحفاظ على موقفها لمدة 1-2 دقيقة أخرى قبل ببطء، على مدى 1 دقيقة، وسحب الإبرة من الدماغ ورعاية للحد من ارتجاع الخلية. تطبيق شمع العظام العقيمة لتجنب خارج الورم خارج الورم.
14. إغلاق الجرح باستخدام مقاطع الفولاذ المقاوم للصدأ الجرح (7 ملم). تقديم حقن تحت الجلد (سك) من 1 مل من محلول رينغر العقيمة لاكتاتد (قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية)، ووضع الحيوان في غرفة الانتعاش الذي هو في منتصف الطريق على وسادة التدفئة.
15. عودة الحيوانات إلى رف التهوية مرة واحدة أنها استعادة الحركة، واتبع الرعاية بعد الروتينية الروتينية لضمان سموت ساعة.

4. في فيفو تلألؤ بيولوجي (بلي) من نمو الورم ( الشكل 1B ) ¹⁵

ملاحظة: يتم تعديل الخلايا الدبقية المستمدة من المريض للتعبير عن لوسيفيراس اليراع. هذا يسمح لنا لمتابعة تطور الورم بعد زرع داخل الجمجمة.

1. إعطاء الحيوانات حقنة الملكية الفكرية من D- لوسيفيرين، ملح البوتاسيوم (150 ملغ / كلغ) 10 دقيقة قبل جلسة التصوير.
2. وضع الحيوانات على الفور في غرفة تحريض الأيزوفلورين الأكسجين التي وافقت عليها إاكوك.
3. وضع الحيوانات داخل غرفة التصوير ساخنة (37 درجة مئوية) لالتقاط إشارة بلي باستخدام إعدادات البرنامج (لمزيد من التفاصيل، انظر تعليمات الشركة المصنعة).

5. كله تشعيع الدماغ ( الشكل 1C ) ^{2 ، 4 ، 13}

> ملاحظة: لتعزيز الهجرة من هنسس تسليمها داخل الأنف إلى أورام الدماغ، يمكن استخدام كامل تشعيع الدماغ من الفئران تحمل زينوغرافتس الورم داخل الجمجمة ⁴ .

1. استخدام حقنة الملكية الفكرية من الكيتامين وخليط زيلازين (50-100 ملغ / كغ و5-10 ملغ / كغ على التوالي؛ استشارة إاكوك المؤسسية لمدى الجرعة المعتمدة) مع طائرة التخدير تحت الجراحية لحث معتدل التخدير للفئران.
2. استخدام علبة عينة لوضع الفئران داخل الغرفة بين كتل التدريع الرصاص، والسماح للرئيس فقط التعرض لمسار الإشعاع ( الشكل 2 ).
3. إعطاء الفئران مع تأكيد بلي إيجابية من نمو الورم (عادة في اليوم 7-8 بعد زرع خلايا الورم) جرعة يومية من 2 غراي من التشعيع لمدة 5 أيام متتالية. أداء بلي تقييم الورم بعد الجرعة الإشعاع الماضي.

6. التعديل الوراثي للخلايا الجذعية العصبية البشرية (نسس؛ الشكله 3A) ⁴

1. الحفاظ على نسس الإنسان (استنساخ HB1.F3.CD) ^{6 ، 7} في دمم المتوسطة مع 10٪ فبس و 1٪ البنسلين الستربتومايسين في رطوبة 37 درجة مئوية تحت حاضنة 95٪ الهواء الغرفة و 5٪ كو ₂ ( ^N نسس).
2. تنفيذ أوفيركسريسيون الوراثية من مستقبلات كيميائية، مثل مستقبلات تشيموكين موتيف تشيموكين 4 (CXCR4)، في هنسس عن طريق تنبيغ مع ترميز لنتيفيروس الإنسان CXCR4.
   1. عندما نسس بالقرب من 75-80٪ كونفلنسي، إضافة الفيروس المضاد CXCR4 إلى وسط الثقافة جنبا إلى جنب مع البوليبرين (8 ميكروغرام / مل)، واحتضان لمدة 8 ساعات أو بين عشية وضحاها.
   2. استبدال المتوسطة التي تحتوي على الفيروس مع المتوسطة الطازجة التي تحتوي على بلاستيسيدين في 4 ميكروغرام / مل لاختيار إيجابي من الخلايا ترانسدوسد.
   3. التحقق من مستوى التعبير CXCR4 في هنسس المعدلة ( ^CXCR4 نسس) عن طريق التدفق الخلوي باستخدام الأجسام المضادة المضادة لل CXCR4 والمطابقة إيزوتيب الأجسام المضادة و السادسكمي رت-ير باستخدام زوج من الاشعال تضخيم CXCR4 و نازعة غليسيرالدهيد 3-فوسفات (غابد) كدناس ⁴ .
   4. توليد نسس مكافحة ناقلات ( ^فك نسس) باستخدام نفس الاستراتيجية، مع رفب استبدال الجينات CXCR4، والتحقق عن طريق الفحص المجهري أو التدفق الخلوي بسبب وجود طلب تقديم العروض رفب.

7. نقص الأكسجين المسبق ل نسس الإنسان ( الشكل 3A ) ⁴

1. لوحة نسس المستزرعة في قوارير ثقافة T75 كما هو موضح أعلاه حتى يتم التوصل 90٪ كونفلنسي.
2. مكان قوارير ثقافة الخلية داخل ترطيب غرفة كو ₂ / حاضنة مع الحفاظ على 1٪ O ₂ مستويات لمدة 24 ساعة، عن طريق N ₂ إمدادات الغاز التي تسيطر عليها الآلي المدمج في متر التدفق. ويشار إلى هذه الخلايا باسم ^H نسس. ويرد وصف نسس التحكم ^N في الخطوة 7.1.

8. تحميل هورجل نسس مع فيروس أونكوليتيك ( الشكل 3B -3H ) ⁵

1. 8.1.In نسكت ^N نسس، ^H نسس، نس نس، و ^CXCR4 نسس مع 50 اتشدي متماثل الشرطية (كراد) -S-pk7 الجسيمات الفيروسية / خلية ^{4 ، 16} .
2. 8.2.بعد 2 ساعة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة مع التنصت الدوري، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع وسائل الإعلام لإزالة الجسيمات الفيروسية غير منضم وتعليق الخلايا في محلول ملحي معقم للحقن.
   تنبيه: تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالفيروسات في الخلايا المختبرية المتعلقة بالفيروسات في المنشآت ذات المستوى المناسب للسلامة الأحيائية، مثل BSL2. يجب أن يرتدي معدات الوقاية الشخصية المناسبة من قبل الباحثين الذين يتعاملون مع فيروس الورم في المبادئ التوجيهية منشأة الحيوان الحيوان ^{4 ، 16} .

9. تحميل الخلايا الجذعية مع مايكروn- حجم أكاسيد الحديد باراماجنيتيك (مبيوس) لفي فيفو تتبع عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي (مري؛ الشكل 3B -3H ) ²

1. لتسمية الخلايا الجذعية، إضافة مبيوس لوقف الثقافات الخلية في ~ 80٪ كونفلنسي، في وجود كاشف ترنسفكأيشن للحضانة بين عشية وضحاها. يتم تحديد كفاءة وضع العلامات الخلايا الجذعية (نسس ⁴ أو اللجان الدائمة ² ) مع مبيوس (فلاش الأحمر مترافق) عن طريق التدفق الخلوي.
2. لتصور هجرة الخلايا الجذعية والتوزيع في أدمغة الحيوانات الدبقية، والحصول على كل من شريحة متعددة عالية الدقة T2 المرجح اكتساب السريع مع الاسترخاء تعزيز تدور صدى الصور ومتعددة شريحة T1 المرجحة سريع تسديدة منخفضة الزاوية تسديدة (فلاش) تسلسل صدى التدرج إلى وتقييم هيكل عبر كل من الاكليلية والمحورية الطائرات من الدماغ الماوس ² .

10. داخل الأنف تسليم نسس العلاجية ( الأرقام 1D والشكل 3D ) ^{2 ، 4}

1. الثقافة وجمع نسس ( ^N نسس، ^H نسس، نس نسس، و نسكس ^CXCR4 ) وفقا للبروتوكول الموصوفة في القسم 3.
   تنبیھ: یجب تنفیذ جمیع الإجراءات الحیوانیة التي تنطوي علی نسس المحملة ب أوف في المرافق ذات التصنیف المناسب لمستوى السلامة البیولوجیة، مثل مرافق BL2 أو BSL2.
2. تخدير الفئران عن طريق حقن الملكية الفكرية من الكيتامين وخليط زيلازين وفقا للخطوة 3.6.
3. وضع الفئران على ثنى نظيفة مواجهة مع وسادة التدفئة تحته للحفاظ على درجة حرارة الجسم. ضبط وسادة مبطن مصنوعة من مناشف ورقية ملفوفة مع الأشرطة لضمان زاوية تستقيم من فتحتي الأنف عند وضعها تحت رأس الماوس.
   ملاحظة: هيالورونيداز قبل العلاج (مجموعه 100 U كما أربع التطعيمات المتكررة في فترات 5 دقائق، 3 ميكرولتر في كل منخر) من الأنف هتم وصف بيثليوم سابقا ^{2 ، 17} .
4. باستخدام ميكروبيبيت، والاستغناء 2 ميكرولتر من تعليق نسك إلى كل منخر من الفأر. تأكيد بصريا طموح قطرة قبل الانتقال إلى الماوس التالي. ويمكن تحديد العدد الإجمالي للخلايا تسليمها من قبل المستخدم. استخدام 62،500-125،000 خلية / ميكرولتر، بحيث 0.5-1 مليون خلية يمكن تسليمها في 4 × 2 ميكرولتر جرعات.
5. استخدام جهاز توقيت لضمان فترات 5 دقائق بين كل إدارة تعليق خلية، وتصل إلى 4 مرات.
6. السماح للحيوانات لاستعادة الحركة في غرفة الانتعاش، مع موقف ضعيف حافظت طوال الوقت.

11. بقاء تحليل ( الشكل 3E )

1. إدخال بيانات مدة البقاء على قيد الحياة من الحيوانات في البرمجيات الإحصائية، وإجراء مقارنات إحصائية باستخدام اختبار رتبة السجل مع التسميات أهمية التالية: * p < 0.05، ** p <0.01، *** p <0.001.

12. الأنسجة جمع والأنسجة / إمونوسيتوشيميستري التحقق من داخل الدماغ الخلايا الجذعية دخول الدماغ ^{2 ، 4}

1. في نهاية نقطة الدراسة، الموت ببطء الفئران عبر البروتوكولات المعتمدة إاكوك. والممارسة القياسية هي استخدام غرفة كو ₂ التي تسيطر عليها معدل التدفق للتضحية الحيوانات كاستراتيجية القتل الرحيم الأولية تليها إكسانغينييناتيون عن طريق تثبيت نضح.
2. على الفور بعد التضحية بها، إجراء نضح داخل القلب مع برنامج تلفزيوني على الحيوان لضمان القضاء على بقايا الدم من الأوعية الدموية والحفاظ على الأنسجة لتحليل النسيجي اللاحقة.
3. وضع ثاني أكسيد الكربون الحيوان ₂ -thutized على الجزء العلوي من وسادة ماصة في موقف ضعيف، المضي قدما في البطن لفضح العضلات الحجاب الحاجز، الذي يتم تشريح جنبا إلى جنب مع القفص الصدري، لفضح القلب.
4. بعد ماملك نيك على الأذين الأيمن باستخدام زوج من مقص تشريح، وتسريع إكسانغينييناتيون مع 3-5 مل من حقن بس عبر البطين الأيسر في قمة. حقن الباردة الباردة بارافورمالدهيد 4٪ (بفا) في الدورة الدموية باستخدام حقنة. تشنجات العضلات الطرفية توفر تأكيدا بصريا أنه لا يوجد انسداد كبير في الدورة الدموية التي من شأنها منع تثبيت الأنسجة المناسبة.
5. إزالة جراحيا رأس الذبيحة والحفاظ عليها في أنبوب الطرد المركزي 50 مل في 4٪ بفا عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تغيير الحل إلى 30٪ السكروز في اليوم التالي قبل تشريح أنسجة المخ آخر 24 ساعة في وقت لاحق.
6. تضمين أنسجة المخ في مجمع أكتوبر وتجميد فلاش على الأيزوبنتان على الجليد الجاف. أداء كريوسكتيونينغ من كتلة الأنسجة الناتجة لتوليد 10-20 ميكرون أقسام الأنسجة لتطبيقات الأنسجة وتطبيقات إمونوسيتوشيميستري.

النتائج

كل من نقص الأكسجين قبل المعالجة ( الشكل 4A ) ⁴ و أوكسيركسريسيون CXCR4 ( أرقام 4B و ⁴ C) ^{4 بشكل} كبير أوبريغولات وجود غشاء الخلية من مستقبلات CXCR4 كما يتضح من التدفق الخلوي. وتظهر تروبيسم الورم التي...

Discussion

على الرغم من أن طريق الأنف من تسليم المخدرات وقد تم استكشاف على نطاق واسع للجزيئات الصغيرة، نانومديسينس، والمركبات البروتين على حد سواء ¹⁸ ، وتطبيق الخلايا الجذعية العلاجية لاستئصال ورم الدماغ في الأنف هو جديد جدا في الطيف من العلاجات الورم في الدماغ تح?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic frame	Kopf Instruments	Model 900
Hypoxic Cell Culture Incubator	ThermoFisher Scientific	VIOS 160i
Cell culture supplies (Plastics)	ThermoFisher Scientific	Varies	Replaceable with any source
Legend Micro 21R Refrigerated Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002490	Replaceable with any source
Bench centrifuge Sorvall ST16R	ThermoFisher Scientific	75004240	Replaceable with any source
Micro syringe 702N 25 µl (22S/2"/2)	Hamilton Company	80400	Flat tip
Sample Tray for Irradiator	Best Theratronics	A13826	To set up mice protection with lead shield
Leica DMi8 Microscope	Leica Microsystem		Custom setup
Leica CM1860 UV cryostat	Leica Microsystem		Custom setup
Exel International Insulin Syringe	ThermoFisher Scientific	14-841-31
Corning Phosphate Buffer Saline	Corning Cellgro/ThermoFisher	21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning Cellgro/ThermoFisher	11965-084
Trypsin 0.05%	Corning Cellgro/ThermoFisher	25300054
Hyaluronidase from bovine testes	MilliporeSigma	H3506