Livraison intradermique de cellules souches thérapeutiques au glioblastome dans un modèle de souris

Résumé

Les cellules souches sont des vecteurs thérapeutiques prometteurs pour traiter les tumeurs cérébrales en raison de leur tropisme intrinsèque tumoral. L'administration de cellules souches intranasales non invasives contourne la barrière hémato-encéphalique et démontre un fort potentiel de traduction clinique. Cet article résume les principes fondamentaux de la transmission des cellules souches intranasales dans un modèle de souris du gliome.

Résumé

Le tropisme intrinsèque vis-à-vis des malignités cérébrales rend les cellules souches comme des porteurs prometteurs d'agents thérapeutiques contre les tumeurs malignes. La livraison de cellules souches thérapeutiques via la voie intranasale est une stratégie alternative récemment découverte, avec un fort potentiel de traduction clinique, en raison de sa nature non invasive par rapport à l'implantation intracrânienne ou à l'accouchement par voie systémique. Le manque de barrière hémato-encéphalique renforce encore le potentiel thérapeutique des cellules souches soumises à une entrée intranasale du cerveau. Cet article résume les techniques essentielles utilisées dans nos études et décrit les principes fondamentaux de la stratégie intranasale pour la délivrance de cellules souches à l'aide d'un modèle de souris de xénogreffes de gliome intracrânien. Nous démontrons les procédures optimisées qui génèrent des résultats cohérents et reproductibles avec des paramètres expérimentaux spécifiques prédéterminés et proposent des lignes directrices pour un flux de travail simplifié qui assurent une exécution efficace et une expérience fiableRésultat final. L'article est conçu pour servir de base pour une autre personnalisation expérimentale basée sur des hypothèses, des types de cellules souches ou des spécimens de tumeurs.

Introduction

La faible toxicité, l'immunogénicité faible et le tropisme tumoral intrinsèque des cellules souches humaines sont des traits attrayants pour la délivrance de véhicules thérapeutiques ¹ . Les nouvelles thérapies à base de cellules souches pour les tumeurs malignes du cerveau sont des innovations prometteuses développées ces dernières années et l'adaptation intranasale de cette stratégie thérapeutique représente un saut vers la traduction clinique, dans la mesure où une administration non invasive et répétée pourrait considérablement réduire la barrière pour les applications des patients et Peut être adaptable pour les services ambulatoires sans anesthésie générale ou un long service hospitalier associé à des interventions chirurgicales invasives ^{1 , 2 , 3 , 4} .

Nous et d'autres ont été les pionniers de la voie intranasale de la transmission des cellules souches aux tumeurs cérébrales et avons mis l'œuvre au sol pour certains des principes de baseDe la recherche translationnelle à l'aide de modèles de xénogreffes de souris ^{2 , 3 , 4} , ainsi que des recherches sur la migration des cellules souches in vivo via des supports de réactifs à résonance magnétique (IRM) ² . Grâce à ces explorations pilotes, nous avons accumulé une expérience substantielle et nous avons permis de mieux comprendre comment construire au mieux une stratégie d'évaluation préclinique robuste en utilisant des modèles de souris de xénogreffe (PDX) bien établis par le patient (PDX), tout en maintenant la résolution d'enquête pour examiner le Des détails mécanistes nuancés des phénomènes biologiques sophistiqués de l'entrée du cerveau intranasal des cellules souches thérapeutiques livrées à la cavité nasale. Ici, nous décrivons les principes d'un protocole d'exploitation normalisé pour démontrer l'état actuel des recherches expérimentales en utilisant une ligne de cellules souches neurales humaines bien établie HB1.F3.CD ^{5 , 6 , 7 , 8 , qui est facilement modifiable pour s'adapter à des modèles ou stratégies de tumeur spécifiques utilisant des cellules souches humaines en tant que supports thérapeutiques.}

Protocole

Toutes les procédures animales doivent être approuvées par le comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) ou l'équivalent. S'il n'y a pas d'incertitude concernant les procédures spécifiques décrites ici, ne procédez pas. Clarifier avec l'IACUC de l'établissement et un membre du personnel vétérinaire désigné.

1. Assurer la stérilité des cellules cultivées et suivre les principes des techniques aseptiques

1. Suivez les bonnes pratiques de laboratoire standard dans toutes les procédures de culture cellulaire et les exigences de l'IACUC pour l'essai cellulaire et la confirmation d'état sans agents pathogènes avant d'administrer à la souris ^{9 , 10} .
2. Suivez l'exigence NIH pour l'authentification cellulaire afin d'assurer un résultat reproductible ¹¹ .
3. Suivre les techniques aseptiques établies pour les petits animaux décrites dans ce manuscrit ⁴ .

2. Préparation des cellules de gliome pour In Vivo Experiment ^{2 , 4}

1. Cellules de gliome de culture (GBM43, GBM6 et U87MG) dans du sérum bovin fœtal 10% dans le milieu médiéval modifié [DMEM] de Dulbecco ou sans sérum (milieu Neurobasal avec suppléments B27, N2, héparine, facteur de croissance épidermique [ EGF], facteur de croissance de fibroblastes basique [bFGF], antibiotiques et L-glutamine ¹² ), dans un incubateur de culture de cellules de CO ₂ humidifié.
   1. Testez toutes les lignes de la cellule via la flèche de la souris à partir des fournisseurs de services commerciaux.
2. Recueillir des cellules adhérentes en éliminant le milieu de culture. Incuber avec 0,05% de trypsine pendant 5 min à température ambiante (1 ml de trypsine pour le flacon T25, 2 mL pour le flacon T75, varier en conséquence pour les flacons de culture avec une plus grande surface) puis laver les cellules avec du phosphate libre de Ca ²⁺ et Mg ²⁺ Solution tampon saline (PBS).
   1. Appuyez sur leFlacon pour déloger les cellules et neutraliser immédiatement avec un excès de milieu contenant du sérum (8 à 9 mL). Ensuite, utilisez des pipettes sérologiques pour aspirer la suspension cellulaire dans les tubes centrifuges.
   2. Centrifuger la suspension de cellules à 400 xg pendant 5 min. Laver la cellule au moins deux fois avec 10 mL de PBS par centrifugation répétée.
   3. Recueillir des cellules de gliome cultivées sous forme de sphères tumorales dans un milieu sans sérum par centrifugation (même vitesse et durée que ci-dessus); Dissocier le culot cellulaire par incubation dans 1 à 2 ml de solution de détachement cellulaire à 37 ° C pendant 5 minutes avant de laver deux fois avec 10 ml de PBS par centrifugation (400 xgx 5 min).
   4. Re-suspendre le gliome dans une solution saline stérile à une concentration de 50 000 à 200 000 cellules par 2,5 μL. Les nombres de cellules utilisés pour l'injection dans le cerveau de souris dépendent du taux de croissance établi pour chaque lignée cellulaire de gliome. Ici, utilisez 25 000 et 100 000 pour GBM43 et GBM6 cellules tumorales dérivées du patient, respectivement.
   5. Préparez le double de la quantité nécessaireSsary cell number for implantation pour tenir compte de la perte d'une fraction pendant la procédure. Transférer la suspension de cellules injectables dans un tube de microcentrifugeuse stérile et placer le tube sur de la glace. Garder les cellules sur de la glace pendant 2 h maximum pendant les chirurgies, préparer un nouveau lot si des chirurgies prolongées sont prévues.

3. Implantation intracrânienne pour créer des modèles de souris Xénogreffe ( Figure 1A ) ^{2 , 4 , 13}

1. Avant la journée de chirurgie, stériliser tous les outils chirurgicaux dans un autoclave et préparer tous les matériels de soins pré et post-chirurgicaux par protocole approuvé par l'IACUC. Stériliser le cadre stéréotaxique et les équipements périphériques afin d'assurer des conditions d'émergence intra-opératoires, ce qui minimise les complications.
2. Organiser la zone d'opération pour minimiser l'encombrement et la possibilité de contamination.
3. Habillez-vous dans un équipement de protection individuelle approprié(EPI) selon l'exigence de l'IACUC.
4. Mettre en place une chambre de récupération post-opératoire appropriée. Assurez-vous que les anesthésiques et les analgésiques sont préparés frais en utilisant des réactifs non expirés. Mettre en place des instruments appropriés de maintenance de la chaleur corporelle selon le protocole approuvé par l'IACUC.
5. Pour établir des xénogreffes de cellules de gliome dérivées du patient humain pour le test de l'administration intranasale de NSC humains, utiliser des espèces de souris immunodéprimées telles que la souris athymique nu / nu de n'importe quel genre à environ 6 semaines d'âge.
6. Anesthésier l'animal en fonction du poids corporel en utilisant les réactifs approuvés, soit par injection intraperitoneale (ip) d'un mélange de kétamine (50-100 mg / kg, consulter l'IACUC institutionnel pour une dose approuvée) et de la xylazine (5-10 mg / Kg, consulter l'IACUC institutionnel pour une gamme de doses approuvée) dans 200-250 μL de solution saline stérile, ou par une anesthésie à l'isoflurane à 4-5% à l'aide d'un dispositif d'inhalation.
   1. Assurez-vous que l'animal a atteint l'avion d'anesthésie chirurgicale bEt le pincement avant de l'incision cutanée. Appliquer un large gel ophtalmique stérile pour assurer l'état humide des cornées de l'animal.
7. Stériliser le crâne en utilisant des lingettes circulaires répétées et en alternance de betadine et d'alcool isopropylique par Pritchett-Corning et al. ¹⁴ .
8. Fournir l'analgésie pré-incision par injection Sc de Buprenex (0,05 à 2 mg / kg) avant l'incision à l'aide de la lame chirurgicale.
9. Utilisez un applicateur stérilisé à base de coton pour aider l'hémostatique tout en exposant le crâne; Utiliser 3% de peroxyde d'hydrogène pour faciliter l'élimination des saignements fortuits.
10. Utilisez un foret à bille électrique à piles (moins de 1 mm de largeur) pour créer un trou de bavure à 2 mm latéral, à gauche ou à droite, à la ligne médiane et à 2 mm derrière le Bregma (les coordonnées de position peuvent être personnalisées Sur le modèle de tumeur destiné à une étude particulière).
11. Montez l'animal sur le cadre stéréotaxique au niveau appropriéEt la posture de la tête, de telle sorte que la seringue microréale insérée de Hamilton est perpendiculaire à la surface du crâne autour de la bavure. Veillez à ce que le plan anesthésique de l'animal soit en bonne santé grâce au pincement des pieds. Observez le taux respiratoire pour s'assurer que l'animal n'est pas soumis à un stress de douleur pendant les étapes suivantes.
    * Nous ne mettons pas l'accent sur les emplacements des serveurs intra-auriculaires parce que:
    1. Nous avons prédvété le trou de bavure pour positionner l'aiguille et, par conséquent, des coordonnées précises du crâne ne sont pas nécessaires;
    2. Les canaux d'oreille de la souris sont fragiles et le placement précis dans les oreilles des barres d'oreille nécessite une formation plus impliquée qui n'est pas pertinente pour notre but. Les risques de dommages aux canaux d'oreille murins l'emportent sur les avantages d'un placement précis;
    3. Le soutien des joues est beaucoup plus facile à réaliser et capable d'atteindre les mêmes niveaux de stabilité et d'équilibre de la tête de la souris lors du positionnement. Il s'agit d'un avantage supplémentaire pour de multiples chirurgies sensibles au temps pour assurerAchèvement en temps opportun avec une bonne viabilité cellulaire.
12. Utilisez les boutons de cadre stéréotaxiques pour positionner la micro seringue à pointe cylindrique sur le trou de bavure, puis abaissez lentement jusqu'à 3 mm en dessous de la surface de la dureté. Rétracter 0,5 mm pour maintenir la pointe de l'aiguille à 2,5 mm en dessous de la dure.
13. Injecter 2,5 μL de cellules de gliome préchargées sur une période de 1 min. Laissez l'aiguille maintenir sa position pendant un autre 1-2 min avant lentement, en 1 min, en retirant l'aiguille du cerveau et en prenant soin de minimiser le reflux cellulaire. Appliquer une cire osseuse stérile pour éviter une croissance tumorale extra-croquante.
14. Fermez la plaie en utilisant des clips enroulés en acier inoxydable (7 mm). Livrer une injection sous-cutanée (sc) de 1 ml de solution de Ringer lactée stérile (préchauffée à 37 ° C) et placer l'animal dans une chambre de récupération à mi-chemin d'un coussin chauffant.
15. Retournez les animaux au rack ventilé une fois qu'ils ont regagné la mobilité et suivent les soins post-opératoires de routine pour assurer le smootH de récupération.

4. In Vivo Bioluminescence Imaging (BLI) de la croissance tumorale ( figure 1B ) ¹⁵

NOTE: Les cellules de gliome dérivées du patient sont modifiées pour exprimer la luciférase de luciole. Cela nous permet de suivre la progression de la tumeur après une implantation intracrânienne.

1. Donnez aux animaux une injection ip de la D-luciférine, du sel de potassium (150 mg / kg) 10 min avant la séance d'imagerie.
2. Placez immédiatement les animaux dans une chambre d'isoflurane oxygénée approuvée par l'IACUC.
3. Placez les animaux à l'intérieur de la chambre d'imagerie chauffée (37 ° C) pour capturer le signal BLI en utilisant les paramètres du logiciel (pour plus de détails, voir les instructions du fabricant).

5. Irradiation du cerveau entière ( figure 1C ) ^{2 , 4 , 13}

NOTE: Pour améliorer la migration des hNSCs administrés par voie intranasale aux tumeurs cérébrales, une irradiation cérébrale totale de souris portant des xénogreffes tumorales intracrâniennes peut être utilisée ⁴ .

1. Utilisez une injection ip d'un mélange de kétamine et de xylazine (50-100 mg / kg et 5-10 mg / kg respectivement, consultez l'IACUC institutionnel pour une gamme de doses approuvée) avec un plan d'anesthésie sous-chirurgicale pour induire modérément l'anesthésie chez la souris.
2. Utiliser un plateau d'échantillonnage pour positionner les souris à l'intérieur de la chambre entre les blocs de blindage du plomb, ce qui permet une exposition de la tête au rayonnement ( Figure 2 ).
3. Donnez aux souris une confirmation positive de la croissance de la tumeur par BLI (normalement au jour 7-8 après l'implantation des cellules de gliome) une dose quotidienne de 2 Gy d'irradiation pendant 5 jours consécutifs. Effectuer une évaluation BLI de la tumeur après la dernière dose d'irradiation.

6. Modification génétique des cellules souches neuronales humaines (NSCs; FigurE 3A) ⁴

1. Maintenir les NSC humains (clone HB1.F3.CD) ^{6 , 7} dans du milieu DMEM avec 10% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine dans un incubateur humidifié à 37 ° C sous 95% d'air ambiant et 5% de CO ₂ ( ^N NSC).
2. Effectuer une surexpression génétique des récepteurs chimiotaxiques, tels que le récepteur de chimiokine 4 (CXCR4) du motif CXC, dans les hNSCs par transduction avec un codage de lentivirus pour CXCR4 humain.
   1. Lorsque les NSC sont proches de la confluence de 75 à 80%, ajoutez le lentivirus CXCR4 au milieu de culture avec du polybrène (8 μg / mL) et incubez pendant 8 h ou pendant la nuit.
   2. Remplacer le milieu contenant du virus avec du milieu frais contenant de la blasticidine à 4 μg / mL pour le choix positif des cellules transduites.
   3. Valider le niveau de l'expression de CXCR4 dans les SNN modifiés ( ^CXCR4 NSC) par cytométrie de flux en utilisant un anticorps anti-CXCR4 et un anticorps isotypique correspondant et viUne RT-PCR quantitative utilisant une paire d'amorces amplifiant les ADNc CXCR4 et glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) ⁴ .
   4. Générer des NSC de contrôle vectoriel ( ^VC NSCs) en utilisant la même stratégie, avec RFP remplaçant le gène CXCR4, et vérifier par microscopie ou cytométrie de flux en raison de la présence de la fluorescence RFP.

7. Préconditionnement hypoxique des NSC humains ( Figure 3A ) ⁴

1. NSC cultivés en plaques dans des flacons de culture T75 comme décrit ci-dessus jusqu'à atteindre 90% de confluence.
2. Placez des flacons de culture cellulaire dans une chambre / incubateur de CO ₂ humidifié avec des niveaux de 2% de O ₂ maintenus pendant 24 h, via un approvisionnement en gaz N ₂ contrôlé par un débitmètre intégré automatisé. Ces cellules sont appelées ^H NSC. Les NSC de contrôle ^N sont décrits à l'étape 7.1.

8. Chargement de HuHomme NSC avec virus Oncolytic ( Figure 3B -3H ) ⁵

1. 8.1.Infect ^N NSCs, ^H NSC, ^VC NSCs et ^CXCR4 NSCs avec 50 adénovirus réplicatif conditionnel (CRAd) -S-pk7 particules virales / cellule ^{4 , 16} .
2. 8.2.Après 2 heures d'incubation à température ambiante avec un tampon périodique, laver les cellules trois fois avec du milieu pour éliminer les particules virales non liées et suspendre les cellules dans une solution saline stérile pour injection.
   ATTENTION: Effectuer toutes les procédures de culture cellulaire in vitro liées aux virus dans les installations ayant la désignation de niveau de biosécurité appropriée, telles que BSL2. Un équipement de protection individuelle approprié doit être utilisé par les chercheurs qui manipulent le virus de l'oncolytique selon les directives institutionnelles des établissements d'animaux ^{4 , 16} .

9. Chargement des cellules souches avec microOxydes de fer paramagnétiques de taille n (MPIO) pour le suivi in vivo selon l'imagerie par résonance magnétique (IRM, figure 3B -3H ) ²

1. Pour étiqueter les cellules souches, ajouter des MPIO à des cultures de cellules souches à une confluence de 80%, en présence d'un réactif de transfection pour une incubation durant la nuit. L'efficacité de l'étiquetage des cellules souches (NSCs ⁴ ou MSC ² ) avec MPIO (flash rouge conjugué) est déterminée par cytométrie en flux.
2. Pour visualiser la migration et la distribution des cellules souches dans les cerveaux des animaux porteurs de gliome, procurez-vous à la fois des images d'écho de spin d'amélioration de relaxation et d'élimination rapidaire pondérée en T2 à haute résolution et des séquences d'écho à gradient à faible angle (FLASH) à faible épaisseur T1 Évaluer la structure par l'intermédiaire des plans coronaux et axiaux du cerveau de la souris ² .

10. Livraison intradermique de NSC thérapeutiques ( Figures 1D et Figure 3D ) ^{2 , 4}

1. Culture et collecte des NSC ( ^N NSC, ^H NSC, ^VC NSCs et ^CXCR4 NSC) selon le protocole décrit à la section 3.
   ATTENTION: Toutes les procédures animales impliquant des NSC chargés d'OV doivent être effectuées dans des installations avec la désignation de niveau de biosécurité appropriée, telles que les installations BL2 ou BSL2.
2. Anesthésier les souris par injection ip d'un mélange de kétamine et de xylazine selon l'étape 3.6.
3. Placez les souris sur un drap propre vers le haut avec un coussin chauffant en dessous pour maintenir la température du corps. Réglez un oreiller rembourré en papier enroulé avec des bandes pour assurer l'angle droit des narines lorsque vous êtes placé sous la tête de la souris.
   REMARQUE: Prétraitement de l'hyaluronidase (total de 100 U en quatre inoculations répétées à intervalles de 5 minutes, 3 μL dans chaque narine) de l'étique nasaleLe python a été décrit précédemment ^{2 , 17} .
4. À l'aide d'une micropipette, déposez 2 μL de suspension NSC à chaque narine de la souris. Confirmez visuellement l'aspiration de la gouttelette avant de passer à la souris suivante. Le nombre total de cellules délivrées peut être déterminé par l'utilisateur; Utiliser 62 500-125 000 cellules / μL, de sorte que 0,5 à 1 million de cellules peuvent être administrées à des doses de 4 x 2 μL.
5. Utilisez une minuterie pour assurer des intervalles de 5 minutes entre chaque administration de suspension cellulaire, jusqu'à 4 fois.
6. Permettre aux animaux de retrouver la mobilité dans une chambre de récupération, la position en position couchée étant maintenue tout au long.

11. Analyse de survie ( figure 3E )

1. Entrez les données sur la durée de survie des animaux dans les logiciels statistiques et effectuez des comparaisons statistiques en utilisant le test log-rank avec les désignations de signification suivantes: * p < 0,05, ** p <0.01, *** p <0,001.

12. Collecte tissulaire et histologie / Immunocytochimie Vérification de l'entrée de cerveau à cellules souches intranasales ^{2 , 4}

1. Au point final de l'étude, éuthanasier les souris via les protocoles approuvés par l'IACUC. Une pratique standard consiste à utiliser une chambre de CO ₂ contrôlée par débit pour sacrifier les animaux en tant que stratégie d'euthanasie primaire suivie d'une exsanguination par fixation par perfusion.
2. Immédiatement après avoir été sacrifié, effectuer une perfusion intracardiaque avec du PBS sur l'animal pour assurer l'élimination des résidus sanguins des vaisseaux sanguins et la préservation des tissus pour une analyse histologique ultérieure.
3. Placez l'animal à base de CO ₂ sur un coussinet absorbant en position couchée, procédez à une laparotomie pour exposer le muscle diaphragme, qui est disséqué avec la cage thoracique, pour exposer le cœur.
4. Après maKing a nick sur l'oreillette droite en utilisant une paire de ciseaux à dissection, accélérer l'exsanguination avec un 3-5 mL d'injection de PBS via le ventricule gauche au sommet. Injecter du paraformaldéhyde à 4% glacé (PFA) glacé en utilisant une seringue; Les spasmes musculaires périphériques fournissent une confirmation visuelle qu'il n'y a pas de blocage majeur dans la circulation qui empêcherait une fixation adéquate des tissus.
5. Enlever chirurgicalement la tête de la carcasse et conserver dans un tube de centrifugation de 50 mL dans 4% de PFA à 4 ° C pendant la nuit. Changez la solution à 30% de saccharose le lendemain avant la dissection du tissu cérébral encore 24 h plus tard.
6. Intégrez le tissu cérébral dans un composé OCT et congélation rapide sur l'isopentane sur de la glace carbonique. Effectuer la cryotypie du bloc tissulaire résultant pour générer des sections tissulaires de 10-20 μm pour les applications histologiques et immunocytochimiques.

Résultats

Le prétraitement hypoxique ( Figure 4A ) ⁴ et la surexpression CXCR4 ( figures 4B et 4C ) ⁴ augmentent considérablement la présence de la membrane cellulaire des récepteurs CXCR4 comme démontré par la cytométrie en flux. Le tropisme tumoral démontré par les NSC (flèches bleues), est montré dans l'histologie du tissu tumoral (cercle rouge). La présence de cellule...

Discussion

Bien que la voie intranasale de l'administration de médicaments ait été largement explorée pour les petites molécules, les nanomédicaments et les composés protéiques ¹⁸ , l'application de cellules souches thérapeutiques pour le ciblage intranasal de la tumeur cérébrale est très nouvelle dans le spectre de la thérapie tumorale du cerveau en développement ^{2 , 3 , 4} . Il existe des com...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic frame	Kopf Instruments	Model 900
Hypoxic Cell Culture Incubator	ThermoFisher Scientific	VIOS 160i
Cell culture supplies (Plastics)	ThermoFisher Scientific	Varies	Replaceable with any source
Legend Micro 21R Refrigerated Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002490	Replaceable with any source
Bench centrifuge Sorvall ST16R	ThermoFisher Scientific	75004240	Replaceable with any source
Micro syringe 702N 25 µl (22S/2"/2)	Hamilton Company	80400	Flat tip
Sample Tray for Irradiator	Best Theratronics	A13826	To set up mice protection with lead shield
Leica DMi8 Microscope	Leica Microsystem		Custom setup
Leica CM1860 UV cryostat	Leica Microsystem		Custom setup
Exel International Insulin Syringe	ThermoFisher Scientific	14-841-31
Corning Phosphate Buffer Saline	Corning Cellgro/ThermoFisher	21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning Cellgro/ThermoFisher	11965-084
Trypsin 0.05%	Corning Cellgro/ThermoFisher	25300054
Hyaluronidase from bovine testes	MilliporeSigma	H3506