Интраназальная доставка терапевтических стволовых клеток в глиобластому в модели мыши

Резюме

Стволовые клетки являются перспективными терапевтическими носителями для лечения опухолей головного мозга из-за их внутреннего опухолевого тропизма. Неинвазивная интраназальная доставка стволовых клеток обходит гематоэнцефалический барьер и демонстрирует сильный потенциал для клинического перевода. В этой статье обобщены основные принципы доставки интраназальных стволовых клеток в мышиную модель глиомы.

Аннотация

Внутренний тропизм к злокачественным новообразованиям мозга делает стволовые клетки перспективными носителями терапевтических агентов против злокачественных опухолей. Доставка терапевтических стволовых клеток по интраназальному маршруту - это недавно открытая альтернативная стратегия с сильным потенциалом для клинического перевода из-за ее неинвазивного характера по сравнению с внутричерепной имплантацией или доставкой по системным маршрутам. Отсутствие гематоэнцефалического барьера еще более усиливает терапевтический потенциал стволовых клеток, подвергающихся интраназальному вхождению мозга. В этой статье обобщаются основные методы, используемые в наших исследованиях, и излагаются основные принципы интраназальной стратегии доставки стволовых клеток с использованием мышиной модели внутричерепных ксенотрансплантатов глиомы. Мы демонстрируем оптимизированные процедуры, которые генерируют согласованные и воспроизводимые результаты с определенными заранее определенными экспериментальными параметрами и предлагают рекомендации для упрощенного рабочего потока, которые обеспечивают эффективное выполнение и надежный опытКонечный результат. Статья призвана служить базой для дальнейшей экспериментальной настройки на основе гипотезы, типов стволовых клеток или особенностей опухоли.

Введение

Низкая токсичность, низкая иммуногенность и внутренний потоотдел опухоли мозга стволовых клеток человека являются привлекательными чертами для доставки терапевтических средств ¹ . Новые терапевтические средства на основе стволовых клеток для злокачественных опухолей головного мозга являются перспективными нововведениями, разработанными в последние годы, а интраназальная адаптация этой терапевтической стратегии представляет собой скачок к клиническому переводу, поскольку неинвазивное и повторное введение может значительно снизить барьер для приложений пациентов и Могут быть адаптированы для амбулаторных услуг без общей анестезии или длительной стационарной службы, связанной с инвазивными хирургическими процедурами ^{1 , 2 , 3 , 4} .

Мы и другие стали инициаторами интраназального пути доставки стволовых клеток к опухолям головного мозга и заложили основы для некоторых основных принциповТрансляционных исследований с использованием моделей ^{2 , 3 , 4} мышиного ксенотрансплантата, а также исследовали миграцию стволовых клеток in vivo с помощью реагентов реагентов магнитно-резонансной томографии (MRI) ² . Благодаря этим экспериментальным исследованиям мы накопили значительный опыт и получили представление о том, как наилучшим образом построить надежную стратегию доклинической оценки с использованием хорошо известных моделей мышиных ксенотрансплантатов (PDX) злокачественной глиомы, сохраняя при этом разрешение на исследование для изучения Тонкие механические детали сложных биологических явлений интраназального ввода мозга терапевтических стволовых клеток, доставляемых в полость носа. Здесь мы описываем принципы стандартизованного рабочего протокола для демонстрации текущего состояния экспериментальных исследований с использованием хорошо налаженной линии нервных стволовых клеток человека HB1.F3.CD ^{5 , 6 , 7 , 8 , который легко модифицируется для адаптации к конкретным опухолевым моделям или стратегиям с использованием человеческих стволовых клеток в качестве терапевтических носителей.}

протокол

Все процедуры на животных должны быть одобрены Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) или его эквивалентом. Если есть какая-либо неопределенность в отношении конкретных процедур, описанных здесь, не продолжайте. Уточнить с IACUC учреждения и назначенный ветеринарный сотрудник.

1. Обеспечение стерильности культивируемых клеток и соблюдение принципов асептических методов

1. Следуйте стандартной хорошей лабораторной практике во всех процедурах клеточной культуры и IACUC для тестирования клеток и подтверждения статуса без патогенов до введения мышам ^{9 , 10} .
2. Следуйте требованиям NIH для проверки подлинности ячеек, чтобы обеспечить воспроизводимый результат ¹¹ .
3. Следуйте установленным методам асептической хирургии мелких животных, изложенным в этой рукописи ⁴ .

2. Получение клеток глиомы для In Vivo Эксперимент ^{2 , 4}

1. Клетки глиомы культуры (GBM43, GBM6 и U87MG) в сыворотке (10% фетальной бычьей сыворотки в среде модифицированного орла Dulbecco [DMEM]) или в среде без сыворотки (нейробазальная среда с добавками B27, N2, гепарин, эпидермальный фактор роста [ EGF], основной фактор роста фибробластов [bFGF], антибиотики и L-глутамин ¹² ), в увлажненном инкубаторе культивирования клеток CO ₂ .
   1. Протестируйте все линии сотовой сети с помощью ясной панели мыши от коммерческих поставщиков услуг.
2. Собирайте адгезивные клетки, удаляя культуральную среду. Инкубируйте с 0,05% трипсином в течение 5 минут при комнатной температуре (1 мл трипсина для колбы T25, 2 мл для колбы T75, соответственно масштабируют для культуральных колб с большей площадью поверхности), а затем промывают клетки свободным фосфатом Ca ²⁺ и Mg ²⁺ Забуференный физиологический раствор (PBS).
   1. НажмитеКолбу для удаления клеток и немедленно нейтрализуют избытком сывороточной среды (8-9 мл). Затем используйте серологические пипетки для аспирации суспензии клеток в центрифужные пробирки.
   2. Центрифужная клеточная суспензия при 400 мкг в течение 5 мин. Вымойте клетку по крайней мере дважды с 10 мл PBS повторным центрифугированием.
   3. Собирайте клетки глиомы, выращенные в виде опухолевых сфер в бессывороточной среде, посредством центрифугирования (с той же скоростью и продолжительностью, что и выше); Диссоциировать клеточный осадок путем инкубации в 1 - 2 мл раствора для открепления клеток при 37 ° С в течение 5 мин перед промыванием дважды 10 мл PBS центрифугированием (400 × 5 × 5 мин).
   4. Повторно суспендировать глиому в стерильном физиологическом растворе в концентрации 50 000 - 200 000 клеток на 2,5 мкл. Номера клеток, используемые для инъекций в мозг мыши, зависят от установленной скорости роста для каждой клеточной линии глиомы. Здесь используют 25 000 и 100 000 для опухолевых клеток, получавших GBM43 и GBM6, соответственно.
   5. Подготовьте вдвое больше суммыSsary cell number для имплантации для учета потери доли во время процедуры. Перенесите суспензию инъекционной клетки в стерильную микроцентрифужную пробирку и поместите пробирку на лед. Держите клетки на льду в течение 2 часов максимум во время операций, подготовьте новую партию, если запланированы расширенные операции.

3. Внутричерепная имплантация для создания моделей мыши Xenograft ( рис. 1A ) ^{2 , 4 , 13}

1. Перед операционным днем ​​стерилизовать все хирургические инструменты в автоклаве и подготовить все материалы для ухода за пре- и послеоперационными животными по протоколу, утвержденному IACUC. Стерилизовать стереотаксическую раму и периферийное оборудование для обеспечения интраоперационных асептических состояний, что минимизирует осложнения.
2. Организуйте рабочую зону, чтобы свести к минимуму беспорядок и возможность загрязнения.
3. Платье в подходящем индивидуальном защитном оборудовании(СИЗ) по требованию IACUC.
4. Настройте соответствующую послеоперационную камеру для восстановления. Убедитесь, что анестетики и анальгетики приготовлены в свежем виде с использованием неживых реагентов. Настройте соответствующие приборы для поддержания тепла тела в соответствии с утвержденным протоколом IACUC.
5. Чтобы установить ксенотрансплантаты клеток глиомы на основе человеческого пациента для тестирования интраназальной доставки НСК человека, используйте иммунокомпрометированные мышиные мыши, такие как nym / nu-асимметричная мышь любого пола в возрасте примерно 6 недель.
6. Анестезируйте животное по массе тела с использованием одобренных реагентов, то есть либо с помощью внутрибрюшинной (ip) инъекции смеси кетамина (50-100 мг / кг, обратитесь в учрежденческий IACUC для одобренного диапазона доз) и ксилазина (5-10 мг / Кг, проконсультироваться с институтом IACUC для одобренного диапазона дозы) в 200-250 мкл стерильного физиологического раствора или через 4-5% изофлурановой анестезии с использованием ингаляционного устройства.
   1. Убедитесь, что животное достигло плоскости хирургической анестезии bПеред тем как разрезать кожу. Нанесите достаточный стерильный глазный гель, чтобы обеспечить влажное состояние роговицы животного.
7. Стерилизовать череп, используя повторяющиеся и чередующиеся круглые салфетки бетадина и изопропилового спирта на Pritchett-Corning и др. ¹⁴ .
8. Поставьте предварительную анальгезию путем инъекции бупренекса (0,05-2 мг / кг) до разреза с помощью хирургического лезвия.
9. Используйте стерилизованный аппликатор с хлопковым наконечником, чтобы помочь гемостату при обнажении черепа; Используйте 3% перекись водорода для облегчения клиренса случайного кровотечения.
10. Используйте ручную электрическую шариковую катушку с батарейным питанием (шириной менее 1 мм), чтобы создать отверстие для заусенцев на 2 мм поперечном, левом или правом, на средней линии и на 2 мм позади Брегмы (координаты положения могут быть настроены на основе На модель опухоли, предназначенную для конкретного исследования).
11. Поднесите животное к стереотаксической рамке к соответствующемуТак что вставленный микробный шприц Гамильтона перпендикулярен поверхности черепа вокруг заусенца. Позаботьтесь о том, чтобы анестезирующий план животного находился в хорошем состоянии, зажав ногой. Наблюдайте за частотой дыхания, чтобы убедиться, что животное не испытывает болевого стресса в течение следующих шагов.
    * Мы не выделяем места размещения в ушных барах, потому что:
    1. Мы предварительно просверлили отверстие заусенцев, чтобы расположить иглу, и поэтому точные координаты черепа не нужны;
    2. Ушные каналы для мыши являются хрупкими, и точное размещение ушных вкладышей в ухе требует более активного обучения, которое не имеет отношения к нашей цели. Риски повреждения мышиных ушных каналов перевешивают преимущества точного размещения;
    3. Поддержка щеки намного легче выполнять и способна достигать одинаковых уровней стабильности и баланса головки мыши во время позиционирования. Это дополнительное преимущество для нескольких операций, чувствительных к времени, для обеспеченияСвоевременное завершение с хорошей жизнеспособностью клеток.
12. Используйте стереотаксические ручки рамки, чтобы поместить микротип шприца с плоским концом в отверстие для заусенцев, затем медленно опустите его на 3 мм ниже поверхности твердой мозговой оболочки. Отведите 0,5 мм, чтобы поддерживать кончик иглы на 2,5 мм ниже твердой.
13. Внесите 2,5 мкл предварительно нагруженных клеток глиомы в течение 1 мин. Дайте игле удерживать свое положение еще на 1-2 мин, прежде чем медленно, в течение 1 мин, выньте иглу из мозга и следите за тем, чтобы минимизировать обратный поток клеток. Применяйте стерильный костяной воск, чтобы избежать экстракраниального роста опухоли.
14. Закройте рану с помощью зажимов из нержавеющей стали (7 мм). Доставить подкожную (sc) инъекцию 1 мл стерильного лактированного раствора Рингера (предварительно нагретого до 37 ° C) и поместить животное в камеру для восстановления, которая находится на полпути на нагревательной подушке.
15. Верните животных в проветриваемую стойку, как только они вернутся к мобильности, и следите за повседневной опекой после ухода, чтобы обеспечить сглаживаниеH восстановление.

4. In Vivo Bioluminescence Imaging (BLI) роста опухоли ( рис. 1B ) ¹⁵

ПРИМЕЧАНИЕ. Выведенные из организма клетки глиомы модифицированы для экспрессии люциферазы светлячков. Это позволяет нам следить за прогрессированием опухоли после внутричерепной имплантации.

1. Дайте животным ip-инъекцию D-люциферина, калиевой соли (150 мг / кг) за 10 минут до сеанса визуализации.
2. Немедленно поместите животных в кислородсодержащую индукционную камеру изофлюрана, одобренную IACUC.
3. Поместите животных в камеру с подогревом (37 ° C) для захвата сигнала BLI с помощью настроек программного обеспечения (подробнее см. Инструкцию изготовителя).

5. Облучение всего мозга ( рис. 1С ) ^{2 , 4 , 13}

ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы усилить миграцию интраназально доставленных hNSC на опухоли головного мозга, можно использовать облучение всего мозга мышами, несущими внутричерепные ксенотрансплантаты опухолей. ⁴ .

1. Используйте инфузионную инъекцию смеси кетамина и ксилазина (50-100 мг / кг и 5-10 мг / кг соответственно, консультируйтесь с институтом IACUC для одобренного диапазона дозы) с помощью подоперационной анестезии, чтобы умеренно вызвать анестезию для мышей.
2. Используйте лоток для образца, чтобы расположить мышей внутри камеры между экранирующими блоками свинца, позволяя только воздействие на излучение пути только на голову ( рисунок 2 ).
3. Дайте мышам положительное BLI подтверждение роста опухоли (обычно на 7-8 день после имплантации клеток глиомы) суточная доза облучения 2 Гр в течение 5 последовательных дней. Выполните BLI-оценку опухоли после последней дозы облучения.

6. Генетическая модификация нейронных стволовых клеток человека (NSCs; FigurE 3A) ⁴

1. Поддерживать человеческие НСК (клон HB1.F3.CD) ^{6 , 7} в среде DMEM с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином в увлажненном 37 ° C инкубаторе при 95% комнатной температуре и 5% CO ₂ ( ^N NSC).
2. Выполните генетическую сверхэкспрессию хемотаксических рецепторов, таких как хемокиновый рецептор 4 CXC-монокристалла (CXCR4), в hNSC путем трансдукции с лентивирусом, кодирующим CXCR4 человека.
   1. Когда NSC находятся около 75-80% слияния, добавьте лентивирус CXCR4 в культуральную среду вместе с полибреном (8 мкг / мл) и инкубируйте в течение 8 часов или в течение ночи.
   2. Замените вируссодержащую среду свежей средой, содержащей бластицидин, при 4 мкг / мл для положительного отбора трансдуцированных клеток.
   3. Подтвердите уровень экспрессии CXCR4 в модифицированных hNSC ( ^CXCR4 NSC) с помощью проточной цитометрии с использованием антитела против CXCR4 и соответствующего изотипного антитела и viКоличественную ОТ-ПЦР с использованием пары праймеров, амплифицирующих CXCR4 и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH) кДНК ⁴ .
   4. Сгенерировать векторные контрольные NSC ( ^VC NSC), используя ту же стратегию, с RFP, заменяющим ген CXCR4, и проверить с помощью микроскопии или проточной цитометрии из-за наличия флуоресценции RFP.

7. Гипоксическое предварительное кондиционирование НСК человека ( рисунок 3А ) ⁴

1. Пластинчатые культивируемые NSC в колбах культуры T75, как описано выше, до достижения 90% слияния.
2. Поместите клеточные культуральные колбы внутри увлажненной камеры / инкубатора CO ₂ с поддерживаемыми уровнями 1% O ₂ в течение 24 часов, через подачу газа N _2, контролируемую автоматическим встроенным расходомером. Эти ячейки называются ^Н НСК. Контрольные ^N NSC описаны на шаге 7.1.

8. Загрузка ХуЧеловеческие НСК с онколитическим вирусом ( рис. 3Б- 3Н ) ⁵

1. 8.1. Инфекционные ^N NSC, ^H NSC, ^VC NSC и ^CXCR4 NSC с 50 условными репликативными аденовирусными (CRAd) -S-pk7 вирусными частицами / клеткой ^{4 , 16} .
2. 8.2. Через 2 часа инкубации при комнатной температуре с периодическим нарезанием резьбы три раза промывайте клетки средой для удаления несвязанных вирусных частиц и суспендируйте клетки в стерильном физиологическом растворе для инъекций.
   ВНИМАНИЕ: Проведите все связанные с вирусом процедуры культивирования клеток in vitro на объектах с соответствующим обозначением уровня биобезопасности, таких как BSL2. Соответствующие средства индивидуальной защиты должны использоваться исследователями, которые обращаются с онколитическим вирусом в соответствии с руководящими принципами для учреждений животного происхождения ^{4 , 16} .

9. Загрузка стволовых клеток с помощью MicroN-размерные парамагнитные оксиды железа (MPIO) для отслеживания In Vivo с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ, рис. 3B -3H ) ²

1. Чтобы маркировать стволовые клетки, добавьте MPIO в культуры стволовых клеток при ~ 80% слияния, в присутствии трансфекционного реагента для инкубации в течение ночи. Эффективность маркировки стволовых клеток (NSCs ⁴ или MSCs ² ) с помощью MPIO (с красным конъюгированием) определяется проточной цитометрией.
2. Чтобы визуализировать миграцию и распределение стволовых клеток в мозге глиомы-носителей, приобретите как многослойное взвешенное быстрое взвешенное T2 с высокой разрешающей способностью с помощью реверсивно-ускорительных спиновых эхо-изображений, так и многослойных градиентных эхо-последовательностей с быстрым низкоугловым снимком (FLASH) Оценивают структуру как с помощью корональной, так и осевой плоскостей мозга мыши ² .

10. Интраназальная доставка терапевтических НСК ( Рисунки 1D и рисунок 3D ) ^{2 , 4}

1. Культура и сбор NSC ( ^N NSC, ^H NSC, VSC NSC и CSCC4 NSC) согласно протоколу, описанному в разделе 3.
   ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Все процедуры для животных, в которых используются NSC, нагруженные OV, должны выполняться на объектах с соответствующим обозначением уровня биобезопасности, таких как установки BL2 или BSL2.
2. Анестезируйте мышей с помощью инъекции кетамина и ксилазина в соответствии с этапом 3.6.
3. Поместите мышей на чистую драпировку вверх, используя нагревательную подушку внизу, чтобы поддерживать температуру тела. Отрегулируйте подушечку из проложенных бумажных полотенец лентами, чтобы обеспечить вертикальный угол ноздрей при размещении под головкой мыши.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Предварительная обработка гиалуронидазы (всего 100 мкА в виде четырех повторных прививок с 5-минутными интервалами, 3 мкл в каждой ноздре) носовойПителий был описан ранее ^{2 , 17} .
4. Используя микропипетку, распределите 2 мкл суспензии NSC для каждой ноздри мыши. Визуально подтвердите аспирирование капли перед тем, как перейти к следующей мыши. Общее количество доставленных ячеек может быть определено пользователем; Используйте 62 500-125000 клеток / мкл, так что 0,5-1 млн клеток могут быть доставлены в дозах 4 х 2 мкл.
5. Используйте таймер для обеспечения 5-минутных интервалов между каждым назначением суспензии клеток, до 4 раз.
6. Позвольте животным восстанавливать подвижность в камере восстановления, при этом положение лежа на спине поддерживается повсюду.

11. Анализ выживания ( рисунок 3Е )

1. Введите данные о продолжительности жизни животных в статистическом программном обеспечении и выполните статистические сопоставления с использованием теста логарифмического ранжирования со следующими значениями: * p < 0,05, ** p <0.01, *** p <0,001.

12. Сбор тканей и гистология / Иммуноцитохимия. Проверка вставки мозгового стержня в стенку ^{2 , 4}

1. В конце исследования мы проводим эвтаназию мышей по протоколам, одобренным IACUC. Стандартная практика заключается в использовании камеры CO ₂ с контролируемой скоростью потока, чтобы принести в жертву животных в качестве основной стратегии эвтаназии, за которой следует кровоподтекание путем перфузионной фиксации.
2. Сразу после того, как вы жертвуете, выполняйте внутрисердечную перфузию с PBS на животном, чтобы обеспечить удаление остатков крови из кровеносных сосудов и сохранение тканей для последующего гистологического анализа.
3. Поместите CO ₂ -увеличенное животное поверх абсорбирующей подушечки в положении лежа на спине, продолжайте лапаротомию, чтобы выставить диафрагменную мышцу, которая рассечена вместе с грудной клеткой, чтобы выставить сердце.
4. После маКороль ник на правом атриуме с помощью пары ножниц для вскрытия, ускорьте кровоизлияние с 3-5 мл инъекции PBS через левый желудочек на вершине. Внедрить ледяной 4% параформальдегид (PFA) в кровоток с использованием шприца; Периферические мышечные спазмы обеспечивают визуальное подтверждение того, что в кровообращении нет серьезной блокировки, которая предотвратила бы правильную фиксацию ткани.
5. Хирургически удалите головку тушки и сохраните ее в 50 мл центрифужной пробирке в 4% PFA при 4 ° C в течение ночи. Измените раствор до 30% сахарозы на следующий день до вскрытия мозговой ткани еще через 24 часа.
6. Вставьте мозговую ткань в соединение OCT и заморозить замораживание на изопентане на сухом льду. Выполните криосистему результирующего тканевого блока для получения секций ткани 10-20 мкм для применения в гистологии и иммуноцитохимии.

Результаты

Как гиперксическая предварительная обработка ( фиг. 4А ) ^{4, так} и сверхэкспрессия CXCR4 ( фиг. 4B и 4C ) ⁴ значительно усиливают присутствие клеточной мембраны рецепторов CXCR4, как показано проточной цитометрией. Опух?...

Обсуждение

Хотя интраназальный путь доставки лекарств широко изучен для небольших молекул, наномедицинов и белковых соединений ¹⁸ , применение терапевтических стволовых клеток для нацеливания опухолей внутрипозвоночного мозга является очень новым в спектре терапевтических опухол...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic frame	Kopf Instruments	Model 900
Hypoxic Cell Culture Incubator	ThermoFisher Scientific	VIOS 160i
Cell culture supplies (Plastics)	ThermoFisher Scientific	Varies	Replaceable with any source
Legend Micro 21R Refrigerated Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002490	Replaceable with any source
Bench centrifuge Sorvall ST16R	ThermoFisher Scientific	75004240	Replaceable with any source
Micro syringe 702N 25 µl (22S/2"/2)	Hamilton Company	80400	Flat tip
Sample Tray for Irradiator	Best Theratronics	A13826	To set up mice protection with lead shield
Leica DMi8 Microscope	Leica Microsystem		Custom setup
Leica CM1860 UV cryostat	Leica Microsystem		Custom setup
Exel International Insulin Syringe	ThermoFisher Scientific	14-841-31
Corning Phosphate Buffer Saline	Corning Cellgro/ThermoFisher	21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning Cellgro/ThermoFisher	11965-084
Trypsin 0.05%	Corning Cellgro/ThermoFisher	25300054
Hyaluronidase from bovine testes	MilliporeSigma	H3506