Entrega intranasal de células-tronco terapêuticas para Glioblastoma em um modelo de mouse

Resumo

As células estaminais são portadores terapêuticos promissores para tratar tumores cerebrais devido ao seu tropismo intrínseco de tumor. A entrega de células estaminais intranasais não invasivas ultrapassa a barreira hematoencefálica e demonstra um forte potencial de tradução clínica. Este artigo resume os princípios básicos da administração de células estaminais intranasais em um modelo de glioma de mouse.

Resumo

O tropismo intrínseco para doenças malignas do cérebro torna as células-tronco como portadores promissores de agentes terapêuticos contra tumores malignos. A entrega de células estaminais terapêuticas através da via intranasal é uma estratégia alternativa recentemente descoberta, com forte potencial de tradução clínica, devido à sua natureza não invasiva em relação à implantação intracraniana ou parto via via sistêmica. A falta de barreira hematoencefálica fortalece ainda mais o potencial terapêutico das células estaminais submetidas à entrada de cérebro intranasal. Este artigo resume as técnicas essenciais utilizadas em nossos estudos e descreve os princípios básicos da estratégia intranasal para a administração de células estaminais usando um modelo de mouse de xenoenxertos de glioma intracraniano. Demonstramos os procedimentos otimizados que geram resultados consistentes e reprodutíveis com parâmetros experimentais específicos predeterminados e oferecem diretrizes para o fluxo de trabalho simplificado que garantem uma execução eficiente e uma experiência confiável.Resultado ntal. O artigo foi concebido para servir de base para uma maior personalização experimental com base em hipóteses, tipos de células estaminais ou especificações tumorais.

Introdução

A baixa toxicidade, a baixa imunogenicidade e o tropismo intrínseco do tumor cerebral de células-tronco humanas são características atraentes para a entrega de veículos terapêuticos ¹ . As novas terapias baseadas em células-tronco para tumores cerebrais malignos são inovações promissoras desenvolvidas nos últimos anos e a adaptação intranasal desta estratégia terapêutica representa um salto para a tradução clínica, na medida em que a administração não invasiva e repetida pode reduzir drasticamente a barreira para aplicações de pacientes e Pode ser adaptável para serviços ambulatoriais sem anestesia geral ou serviço hospitalar prolongado associado a procedimentos cirúrgicos invasivos ^{1 , 2 , 3 , 4} .

Nós e outros fomos pioneiros na via intranasal da administração de células estaminais aos tumores cerebrais e colocamos o trabalho de base para alguns dos princípios básicosDe pesquisa de tradução usando modelos de xenogravagem de mouse ^{2 , 3 , 4} , bem como investigou a migração de células-tronco in vivo por meio de suporte de reagentes de ressonância magnética (MRI) ² . Através destas explorações-piloto, acumulamos uma experiência substancial e obtivemos informações sobre como construir melhor uma estratégia de avaliação pré-clínica robusta usando modelos de mouse de xenoenxerto (PDX) bem estabelecidos do paciente (PDX) de glioma maligno, mantendo a resolução de investigação para examinar a Detalhes mecanicistas matizados dos fenômenos biológicos sofisticados da entrada no cérebro intranasal do cérebro de células estaminais terapêuticas entregues à cavidade nasal. Aqui, descrevemos os princípios de um protocolo de operação padronizado para demonstrar o estado atual das investigações experimentais usando uma linha de células-tronco neural humana bem estabelecida HB1.F3.CD ^{5 , 6 , 7 , 8 , que é facilmente modificável para se adaptar a modelos de tumor específicos ou estratégias usando células-tronco humanas como portadores terapêuticos.}

Protocolo

Todos os procedimentos de animais devem ser aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal (IACUC) ou equivalente. Se houver alguma incerteza quanto aos procedimentos específicos aqui descritos, não proceda. Esclarecer com a IACUC da instituição e um membro designado da equipe veterinária.

1. Garantir a esterilidade das células cultivadas e seguir princípios de técnicas assépticas

1. Siga as boas práticas de laboratório padrão em todos os procedimentos de cultura de células e requisitos da IACUC para teste celular e confirmação do estado sem patógenos antes de administrar a ratos ^{9 , 10} .
2. Siga o requisito NIH para autenticação celular para garantir o resultado reprodutível ¹¹ .
3. Siga as técnicas assépticas de cirurgia de pequenos animais estabelecidas descritas neste manuscrito ⁴ .

2. Preparação de células de glioma para In Vivo Experimento ^{2 , 4}

1. Células de glioma de cultura (GBM43, GBM6 e U87MG) em soro bovino fetal (10% de soro bovino fetal no meio de Eagle modificado de Dulbecco [DMEM]) ou meio sem soro (meio Neurobasal com suplementos B27, N2, heparina, factor de crescimento epidérmico [ EGF], factor de crescimento de fibroblastos básico [bFGF], antibióticos e L-glutamina ¹² ), numa incubadora de cultura de células de CO ₂ humidificado.
   1. Teste todas as linhas celulares através do teste do painel transparente do mouse a partir de provedores de serviços comerciais.
2. Coletar células aderentes removendo o meio de cultura. Incubar com tripsina a 0,05% durante 5 minutos à temperatura ambiente (1 mL de tripsina para balão T25, 2 mL para balão T75, escalar em conformidade para frascos de cultura com maior área de superfície) e depois lavar as células com fosfato livre de Ca2 ⁺ e Mg2 ⁺ Solução salina tamponada (PBS).
   1. Toque emBalão para desalojar as células e neutralizar imediatamente com um excesso de meio contendo soro (8 - 9 mL). Em seguida, use pipetas sorológicas para aspirar a suspensão celular em tubos de centrífuga.
   2. Centrifugação de suspensão celular a 400 xg durante 5 min. Lavar a célula pelo menos duas vezes com 10 mL de PBS por centrifugação repetida.
   3. Recolher células de glioma cultivadas como esferas tumorais em meio isento de soro por centrifugação (mesma velocidade e duração que acima); Dissociar o sedimento celular por incubação em 1 a 2 ml de solução de separação celular a 37 ° C durante 5 minutos antes de lavar duas vezes com 10 mL de PBS por centrifugação (400 xgx 5 min).
   4. Re-suspenda o glioma em solução salina estéril a uma concentração de 50,000 - 200,000 células por 2,5 μL. Os números de células utilizados para injeção no cérebro do mouse dependem da taxa de crescimento estabelecida para cada linha celular de glioma. Aqui, use 25.000 e 100.000 para GBM43 e GBM6 células tumorais derivadas do paciente, respectivamente.
   5. Prepare o dobro da quantidade do neceNúmero de célula ssary para implantação para explicar a perda de uma fração durante o procedimento. Transfira a suspensão de células injectáveis ​​para um tubo de microcentrífuga estéril e coloque o tubo no gelo. Mantenha as células no gelo durante 2 h no máximo durante as cirurgias, prepare um novo lote se for planejada cirurgia prolongada.

3. Implantação intracraniana para criar modelos de mouse de xenogravagem ( Figura 1A ) ^{2 , 4 , 13}

1. Antes do dia da cirurgia, esterilize todas as ferramentas cirúrgicas em uma autoclave e prepare todo o material pré e pós-cirúrgico para animais por protocolo aprovado pela IACUC. Esterilizar a estrutura estereotáxica e os equipamentos periféricos para garantir condições assépticas intra-operatórias, minimizando as complicações.
2. Organize a área de operação para minimizar a desordem e possibilidade de contaminação.
3. Vestido com um equipamento de proteção pessoal apropriado(PPE) por exigência da IACUC.
4. Configure uma câmara de recuperação pós-operatória apropriada. Certifique-se de que anestésicos e analgésicos sejam preparados de forma fresca com os reagentes não expirados. Configure instrumentos adequados de manutenção do calor corporal por protocolo aprovado pela IACUC.
5. Para estabelecer xenoenxertos de células de glioma derivadas do paciente humano para o teste da administração intranasal de NSCs humanos, use espécies de ratos imunocomprometidos, tais como o mouse nu / nu athymic de qualquer gênero com aproximadamente 6 semanas de idade.
6. Anestesiar o animal com base no peso corporal utilizando os reagentes aprovados, ou seja, através de uma injecção intraperitoneal (ip) de uma mistura de cetamina (50-100 mg / kg, consultar IACUC institucional para uma dose aprovada) e xilazina (5-10 mg / Kg, consultar a IACUC institucional para o intervalo de doses aprovado) em 200-250 μL de solução salina estéril, ou através de uma anestesia com isoflurano a 4-5%, utilizando um dispositivo inalatório.
   1. Certifique-se de que o animal atingiu o plano de anestesia cirúrgica bE pinça antes da incisão da pele. Aplique amplo gel oftálmico estéril para garantir o estado úmido das córneas do animal.
7. Esterilize o crânio usando lâminas circulares repetidas e alternadas de betadina e álcool isopropílico por Pritchett-Corning et al. ¹⁴ .
8. Forneça a analgesia pré-incisão por injeção sc de Buprenex (0,05 - 2 mg / kg) antes da incisão usando a lâmina cirúrgica.
9. Use um aplicador de ponta de algodão esterilizado para ajudar o hemostato enquanto expõe o crânio; Use 3% de peróxido de hidrogênio para facilitar a depuração do sangramento acidental.
10. Use uma broca de esfera elétrica de mão com bateria (menos de 1 mm de largura) para criar um orifício de rebarba a 2 mm de lateral, à esquerda ou a direita, à linha média e a 2 mm atrás do Bregma (as coordenadas da posição podem ser personalizadas com base No modelo de tumor destinado a um estudo particular).
11. Montar o animal no quadro estereotáxico para o apropriadoE postura de cabeça, de modo que a seringa de Hamilton inserida é perpendicular à superfície do crânio em torno do buraco. Tenha cuidado para garantir que o plano anestésico do animal esteja em boas condições através do aperto do dedo. Observe a taxa respiratória para se certificar de que o animal não está sob estresse por dor nas etapas seguintes.
    * Não enfatizamos os canais na barra de orelha porque:
    1. Nós antecipamos o buraco para posicionar a agulha e, portanto, as coordenadas precisas do crânio são desnecessárias;
    2. Os canais de ouvido do mouse são frágeis e a colocação precisa no ouvido das barras de ouvido requer treinamento mais envolvente que não seja relevante para nosso propósito. Os riscos de danos nos canais de ouvido murinos superam os benefícios de uma colocação precisa;
    3. O suporte de bochechas é muito mais fácil de executar e capaz de alcançar os mesmos níveis de estabilidade e equilíbrio da cabeça do mouse durante o posicionamento. É um benefício adicional para várias cirurgias sensíveis ao tempo para garantirConclusão atempada com boa viabilidade celular.
12. Use os botões de moldura estereotáxicos para posicionar a seringa de ponta plana no orifício da rebarba e, em seguida, baixe-a lentamente até 3 mm abaixo da superfície dura. Retirar 0,5 mm para manter a ponta da agulha a 2,5 mm abaixo da dura.
13. Injetar 2,5 μL de células de glioma pré-carregadas no período de 1 min. Deixe a agulha manter a sua posição por mais 1-2 minutos antes, lentamente, ao longo de 1 min, retirando a agulha do cérebro e tomando cuidado para minimizar o refluxo celular. Aplique cera de osso estéril para evitar o crescimento do tumor extracraniano.
14. Feche a ferida usando grampos de ferida de aço inoxidável (7 mm). Entregue uma injeção subcutânea (sc) de 1 mL de solução de Ringer lactato estéril (pré-aquecida a 37 ° C) e coloque o animal em uma câmara de recuperação que esteja a meio caminho de uma almofada de aquecimento.
15. Retorne os animais para o rack ventilado, uma vez que eles recuperem a mobilidade e acompanhem os cuidados pós-operatórios de rotina para garantir o smootH recuperação.

4. In Vivo Bioluminescence Imaging (BLI) de crescimento tumoral ( Figura 1B ) ¹⁵

NOTA: As células de glioma derivadas do paciente são modificadas para expressar luciferase de vaga-lume. Isso nos permite seguir a progressão do tumor após a implantação intracraniana.

1. Dê aos animais uma injeção ip do sal de potássio D-luciferina (150 mg / kg) 10 minutos antes da sessão de imagem.
2. Coloque imediatamente os animais em uma câmara de indução de isoflurano oxigenada aprovada pela IACUC.
3. Coloque animais dentro da câmara de imagem aquecida (37 ° C) para capturar o sinal BLI usando as configurações do software (para detalhes, veja as instruções do fabricante).

5. Irradiação cerebral completa ( Figura 1C ) ^{2 , 4 , 13}

NOTA: Para aumentar a migração de hNSCs entregues de forma intranasal para tumores cerebrais, pode-se utilizar a irradiação cerebral total de camundongos portadores de xenoenxertos de tumores intracranianos ⁴ .

1. Use uma injeção ip de uma mistura de ketamina e xilazina (50-100 mg / kg e 5-10 mg / kg, respectivamente, consulte a IACUC institucional para o intervalo de doses aprovado) com plano de anestesia sub-cirúrgica para induzir moderadamente anestesia para camundongos.
2. Utilize uma bandeja de amostra para posicionar os camundongos dentro da câmara entre os blocos de blindagem do chumbo, permitindo a exposição somente à cabeça ao caminho de radiação ( Figura 2 ).
3. Dê aos ratos com confirmação BLI positiva do crescimento do tumor (normalmente no dia 7-8 após a implantação das células do glioma) uma dose diária de 2 Gy de irradiação por 5 dias consecutivos. Realize a avaliação BLI do tumor após a última dose de irradiação.

6. Modificação genética de células-tronco neurais humanas (NSCs; FigurE 3A) ⁴

1. Manter NSCs humanos (clone HB1.F3.CD) ^{6 , 7} em meio DMEM com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina em uma incubadora humidificada a 37 ° C sob 95% de ar ambiente e 5% de CO ₂ ( ^N NSCs).
2. Realizar a superexpressão genética de receptores chemotaxic, como o receptor 4 de quimiocinas do motivo CXC (CXCR4), em hNSCs por transdução com codificação de lentivírus para CXCR4 humano.
   1. Quando os NSCs estão próximos de 75-80% de confluência, adicione o lentivírus CXCR4 ao meio de cultura juntamente com polibreno (8 μg / mL) e incube durante 8 h ou durante a noite.
   2. Substitua o meio contendo vírus com meio fresco contendo blasticidina a 4 μg / mL para seleção positiva de células transduzidas.
   3. Valide o nível de expressão de CXCR4 em hNSC modificados ( ^CXCR4 NSCs) por meio de citometria de fluxo usando anticorpo anti-CXCR4 e anticorpo isotipo de correspondência e viUma RT-PCR quantitativa usando um par de primers amplificando CXCR4 e cDNA de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) ⁴ .
   4. Gerar NSCs de controle vetorial ( ^VC NSCs) usando a mesma estratégia, com RFP substituindo o gene CXCR4 e verificar via microscopia ou citometria de fluxo devido à presença de fluorescência de RFP.

7. Pré-condicionamento hipóxico de NSCs humanos ( Figura 3A ) ⁴

1. NSC cultivados em placas em frascos de cultura T75 como descrito acima até chegar a 90% de confluência.
2. Coloque os frascos de cultura de células dentro de uma câmara / incubadora de CO ₂ humidificada com níveis mantidos de 1% de O ₂ durante 24 h, através de um fornecimento de gás N ₂ controlado por um medidor de fluxo interno automatizado. Essas células são chamadas de NSCs ^H. Os NSC de Controle ^N são descritos no passo 7.1.

8. Carga de HuNSCs com vírus Oncolytic ( Figura 3B -3H ) ⁵

1. 8.1.Infect ^N NSCs, ^H NSCs, ^VC NSCs e ^CXCR4 NSCs com 50 partículas de vírus adenovírus replicativos condicionais (CRAd) -S-pk7 / célula ^{4 , 16} .
2. 8.2. Após 2 h de incubação à temperatura ambiente com tapagem periódica, lavar células três vezes com meio para remover partículas virais não ligadas e suspender células em solução salina estéril para injeção.
   CUIDADO: Realize todos os procedimentos de cultura de células in vitro relacionados a vírus em instalações com a designação de nível de biossegurança apropriada, como BSL2. O equipamento de proteção pessoal apropriado deve ser usado por pesquisadores que manipulam o vírus oncolítico por diretrizes institucionais de instalações para animais ^{4 , 16} .

9. Carregando células-tronco com microÓxidos de ferro paramagnéticos de tamanho n (MPIOs) para rastreamento in vivo via imagem de ressonância magnética (ressonância magnética, Figura 3B -3H ) ²

1. Para rotular as células estaminais, adicionar MPIOs às culturas de células-tronco a ~ 80% de confluência, na presença de reagente de transfecção para incubação durante a noite. A eficiência da rotulagem de células-tronco (NSCs ⁴ ou MSCs ² ) com MPIOs (flash vermelho conjugado) é determinada por citometria de fluxo.
2. Para visualizar a migração e distribuição de células-tronco no cérebro de animais portadores de glioma, adquira as imagens de eco de rotação de Melhoramento de Relaxamento e Multi-fatia e as seqüências de eco de gradiente Fast Low Angle Shot (FLASH) de multi-fatia T2 Avaliar a estrutura através dos planos coronal e axial do cérebro do mouse ² .

10. Entrega intranasal de NSC terapêuticos ( Figuras 1D e Figura 3D ) ^{2 , 4}

1. Cultive e colete NSCs ( ^N NSCs, ^H NSCs, ^VC NSCs e ^CXCR4 NSCs) de acordo com o protocolo descrito na seção 3.
   CUIDADO: Todos os procedimentos animais que envolvem NSCs carregados com OV devem ser realizados em instalações com a designação apropriada de nível de biossegurança, como instalações BL2 ou BSL2.
2. Anestesiar ratos via injeção ip de uma mistura de ketamina e xilazina de acordo com o passo 3.6.
3. Coloque os ratos sobre uma capa limpa voltada para cima com uma almofada de aquecimento embaixo para manter a temperatura corporal. Ajuste um travesseiro acolchoado feito de toalhas de papel enroladas com fitas para garantir o ângulo vertical das narinas quando colocado sob a cabeça do mouse.
   NOTA: O pré-tratamento com hialuronidase (total de 100 U como quatro inoculações repetidas em intervalos de 5 minutos, 3 μL em cada narina) do nasal eO pithelio foi descrito anteriormente ^{2 , 17} .
4. Usando uma micropipeta, distribua 2 μL de suspensão NSC para cada narina do mouse. Confirme visualmente a aspiração da gotícula antes de passar para o próximo mouse. O número total de células entregues pode ser determinado pelo usuário; Use 62.500-125.000 células / μL, de modo que 0,5-1 milhões de células podem ser administradas em doses de 4 x 2 μL.
5. Use um temporizador para garantir intervalos de 5 minutos entre cada administração de suspensão celular, até 4 vezes.
6. Permitir que os animais recuperem a mobilidade em uma câmara de recuperação, com a posição supina mantida por todo o lado.

11. Análise de sobrevivência ( Figura 3E )

1. Insira os dados de duração de sobrevivência de animais em software estatístico e faça comparações estatísticas usando o teste log-rank com as seguintes designações de significados: * p < 0,05, ** p <0.01, *** p <0,001.

12. Coleta de Tecidos e Histologia / Verificação da Imunocitoquímica da Entrada de Cérebro de Células-Troncas Intranasais ^{2 , 4}

1. No final do estudo, eutanizar camundongos através dos protocolos aprovados pela IACUC. Uma prática padrão é usar uma câmara de CO ₂ controlada por taxa de fluxo para sacrificar os animais como a principal estratégia de eutanásia seguida de exsanguinação por fixação de perfusão.
2. Imediatamente após ser sacrificado, realize uma perfusão intracardíaca com PBS no animal para garantir a eliminação de resíduos sanguíneos de vasos sanguíneos e a preservação de tecidos para posterior análise histológica.
3. Coloque o animal de poli ₍ CO ₂ ) em cima de uma almofada absorvente na posição supina, proceda com uma laparotomia para expor o músculo do diafragma, que é dissecado juntamente com a caixa torácica, para expor o coração.
4. Depois deRetirar um nick no átrio direito usando um par de tesouras de dissecação, acelerar a exsanguinação com 3-5 mL de injeção de PBS através do ventrículo esquerdo no ápice. Injecte o paraformaldeído a 4% gelado (PFA) em circulação usando uma seringa; Espasmos musculares periféricos fornecem confirmação visual de que não há bloqueio importante na circulação que evite a fixação adequada do tecido.
5. Remova cirurgicamente a cabeça da carcaça e conserve em um tubo de centrífuga de 50 mL em 4% de PFA a 4 ° C durante a noite. Mude a solução para 30% de sacarose no dia seguinte antes da dissecção do tecido cerebral 24 horas depois.
6. Incorporar o tecido cerebral no composto OCT e congelar o isopentano em gelo seco. Execute a crioesecção do bloqueio do tecido resultante para gerar seções de tecido de 10-20 μm para aplicações histológicas e imunocitoquímicas.

Resultados

O pré-tratamento hipóxico ( Figura 4A ) ⁴ e a sobre-expressão CXCR4 ( Figuras 4B e 4C ) ⁴ aumentam significativamente a presença da membrana celular dos receptores CXCR4 como demonstrado pela citometria de fluxo. O tumorismo tumoral demonstrado por NSCs (flechas azuis), é mostrado na histologia do tecido tumoral (círculo vermelho). A presença de células-tronco marcadas ...

Discussão

Embora a via intranasal de administração de fármaco tenha sido amplamente explorada para moléculas pequenas, nanomedicinas e compostos de proteína ¹⁸ , a aplicação de células-tronco terapêuticas para o alvo do tumor cerebral intranasal é muito nova no espectro de terapias de tumores cerebrais em desenvolvimento ^{2 , 3 , 4} . Existem complexidades intrínsecas envolvidas em relação aos comportam...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic frame	Kopf Instruments	Model 900
Hypoxic Cell Culture Incubator	ThermoFisher Scientific	VIOS 160i
Cell culture supplies (Plastics)	ThermoFisher Scientific	Varies	Replaceable with any source
Legend Micro 21R Refrigerated Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002490	Replaceable with any source
Bench centrifuge Sorvall ST16R	ThermoFisher Scientific	75004240	Replaceable with any source
Micro syringe 702N 25 µl (22S/2"/2)	Hamilton Company	80400	Flat tip
Sample Tray for Irradiator	Best Theratronics	A13826	To set up mice protection with lead shield
Leica DMi8 Microscope	Leica Microsystem		Custom setup
Leica CM1860 UV cryostat	Leica Microsystem		Custom setup
Exel International Insulin Syringe	ThermoFisher Scientific	14-841-31
Corning Phosphate Buffer Saline	Corning Cellgro/ThermoFisher	21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning Cellgro/ThermoFisher	11965-084
Trypsin 0.05%	Corning Cellgro/ThermoFisher	25300054
Hyaluronidase from bovine testes	MilliporeSigma	H3506