Bir Fare Modelinde Tedavi Edici Kök Hücrelerin Glioblastomaya İntranazal Dağıtımı

Özet

Kök hücreler tümör tropizminden ötürü beyin tümörlerini tedavi etmek için terapötik taşıyıcıları umut vericidir. Non-invaziv intranazal kök hücre iletimi kan beyin bariyerini atlar ve klinik çeviri için güçlü bir potansiyel gösterir. Bu makale, glioma fare modelinde intranazal kök hücre sunumunun temel ilkelerini özetlemektedir.

Özet

Beyin malignitelerine karşı içsel tropizm kök hücreleri malign tümörlere karşı terapötik ajanlar taşıyan vaat eden taşıyıcılar haline getirir. Burun içi yol yoluyla terapötik kök hücrelerin verilmesi, intrakranyal implantasyon veya sistemik rotalar yoluyla verilmeyle karşılaştırıldığında, invaziv olmayan doğası nedeniyle, klinik çeviri için güçlü potansiyele sahip yeni keşfedilen bir alternatif strateji. Kan beyin bariyeri eksikliği, burun içine beyin girişine giren kök hücrelerin terapötik potansiyelini daha da güçlendirir. Bu makale, çalışmalarımızda kullanılan temel teknikleri özetlemekte ve bir intrakranyal glioma ksenograftı fare modeli kullanılarak kök hücre nakli için burun içi stratejinin temel ilkelerini özetlemektedir. Belirli önceden belirlenmiş deneysel parametrelerle tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar üreten en iyileştirilmiş prosedürleri gösteriyoruz ve etkili yürütme ve güvenilir deneyime imkân tanıyan aerodinamik iş akışı için rehberler sunuyoruzSonuç. Makale, hipotez, kök hücre tipleri veya tümör spesifiklerine dayalı ileri deneysel uyarlama için bir taban çizgisi görevi görecek şekilde tasarlanmıştır.

Giriş

İnsan kök hücrelerinin düşük toksisitesi, düşük immünojenisitesi ve intrinsik beyin tümörü tropizmi, terapötik araçların taşınması için cazip özelliktedir ¹ . Kök hücre kökenli habis beyin tümörleri için kullanılan terapötikler, son yıllarda gelişmekte olan umut verici yeniliklerdir ve bu terapötik stratejinin burun içe adaptasyonu, klinik çeviriye doğru bir sıçramayı temsil etmektedir; bu da, non-invaziv ve tekrarlanan uygulama, hasta başvuruları için bariyeri önemli ölçüde azaltabilir ve Invaziv cerrahi prosedürler ^{1 , 2 , 3 , 4} ile ilişkili olarak genel anestezi veya uzun süre yatan hasta içi servis olmaksızın ayakta hasta hizmetleri için uyarlanabilir olabilir.

Biz ve diğerleri, beyin tümörlerine kök hücre verilmesinin burun içi yoluna öncülük ettik ve bazı temel prensiplerin temel çalışmalarını yaptık.^{2 , 3 , 4} fare ksenograft modelleri kullanılarak yapılan translasyonel araştırmaların yanı sıra, manyetik rezonans görüntüleme (MRI) reaktif taşıyıcıları vasıtasıyla kök hücrelerin in vivo migrasyonunu incelemiştir. Bu pilot keşifler sayesinde önemli deneyimler elde ettik ve kötü huylu gliomun köklü hasta kaynaklı xenograft (fare modeli) fare modellerini kullanarak güçlü bir klinik öncesi değerlendirme stratejisi oluşturmak için en iyi yolu nasıl edineceğimiz konusunda fikir sahibi olduk ve araştırmacı kararı inceleyerek Burun boşluğuna gönderilen terapötik kök hücrelerin burun içi beyin girişinin sofistike biyolojik fenomeninin nüanslı mekanik ayrıntıları. Burada, iyi kurulmuş bir insan sinir kök hücre hattı HB1.F3.CD ⁵ kullanarak deneysel araştırmaların mevcut durumunu gösteren standart bir işletim protokolünün prensiplerini açıklıyoruz. ^{, 6 , 7 , 8 , terapötik taşıyıcılar olarak insan kök hücrelerini kullanan spesifik tümör modellerine veya stratejilere uyum sağlamak için kolaylıkla modifiye edilebilir.}

Protokol

Tüm hayvansal prosedürler, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) veya eşdeğeri tarafından onaylanmış olmalıdır. Burada açıklanan özel prosedürler konusunda herhangi bir belirsizlik varsa, devam etmeyin. Kurumun IACUC ve belirlenmiş bir veteriner personeli ile açıklayın.

1. Kültürlü Hücrelerin Sterilitesini Sağlama ve Aseptik Tekniğin Esaslarını Takip Edin

1. Tüm hücre kültürü prosedürlerinde standart iyi laboratuar uygulamalarını ve farelere ^{9 , 10} uygulanmadan önce hücre testi ve patojensiz statü onayı için IACUC şartlarını izleyin.
2. Yeniden üretilebilir sonuçlar elde etmek için NIH'nin hücre kimlik doğrulama şartını izleyin ¹¹ .
3. Bu el yazmasında özetlenen kurulan küçük hayvan cerrahisi aseptik tekniklerine uyun.

2. Glioma Hücrelerinin In Vivo Deney ^{2 , 4}

1. Serum içeren (Dulbecco'nun Modifiye Kartal ortamında [DMEM]% 10 sığır fetüsü serumu) veya serum içermeyen ortamda (B27, N2, heparin, epidermal büyüme faktörü takviyeli Neurobasal ortamı [ EGF], bazik fibroblast büyüme faktörü [bFGF], antibiyotikler ve L-glutamin ¹² ) nemlendirilmiş bir CO ₂ hücre kültürü inkübatöründe kuluçkaya yatırılmıştır.
   1. Tüm hücre hatlarını, ticari servis sağlayıcılarından çalıştırılan fare temizleme paneli aracılığıyla test edin.
2. Kültür ortamı çıkarılarak yapışkan hücreler toplayın. Oda sıcaklığında (T25 şişesi için 1 mL tripsin, T75 şişesi için 2 mL, büyük yüzey alanlı kültür şişeleri için buna göre ölçeklendirme) oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0,05 tripsin ile inkübe edin ve daha sonra hücreleri Ca ²⁺ ve Mg ²⁺ serbest fosfat ile yıkayın Tamponlu salin (PBS).
   1. DokununŞişeyi boşaltın ve hemen serum içeren bir ortamdan (8 - 9 mL) nötralize edin. Daha sonra hücre süspansiyonunu santrifüj tüplerine aspire etmek için serolojik pipetler kullanın.
   2. 5 dakika 400 xg'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. Tekrarlayan santrifüjleme ile hücrenin en az iki kez 10 mL PBS ile yıkanması.
   3. Serumsuz ortamda tümör küreleri olarak yetiştirilen glioma hücrelerini, santrifüjleme yoluyla toplayın (aynı hız ve süre yukarıda); Santrifüj (400 xgx 5 dakika) ile 10 mL PBS ile iki kez yıkamadan önce, 37 ° C'de 1 - 2 mL hücre ayrılma solüsyonunda inkübe ederek hücre peletini ayırın.
   4. 2.5 uL'de 50.000 - 200.000 hücre konsantrasyonunda gliomayı steril tuzlu suda tekrar süspansiyon haline getirin. Fare beynine enjeksiyon için kullanılan hücre sayıları, her bir glioma hücre dizisi için belirlenen büyüme hızına bağlıdır. Burada, sırasıyla GBM43 ve GBM6 hasta türetilmiş tümör hücreleri için 25.000 ve 100.000 kullanın.
   5. Nece miktarını iki katına hazırlaİşlem sırasında bir fraksiyon kaybını hesaba katmak için implantasyon için ssary hücre sayısı. Enjekte edilebilir hücre süspansiyonunu steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerine yerleştirin. Ameliyatlar sırasında hücreleri buzda maksimum 2 saat tutun, uzun ameliyatlar planlanırsa yeni seri hazırlayın.

3. Xenograft Fare Modelleri Oluşturmak İçin İntrakranyal İmplantasyon ( Şekil 1A ) ^{2 , 4 , 13}

1. Ameliyat gününden önce bir otoklavdaki bütün cerrahi araçları sterilize edin ve IACUC tarafından onaylanan protokol uyarınca ameliyat öncesi ve sonrası tüm hayvan bakım materyallerini hazırlayın. İntraoperatif aseptik koşulları sağlamak için stereotaksik çerçeve ve periferik ekipmanları sterilize edin, böylece komplikasyonları en aza indirin.
2. Operasyon alanını dağınıklığı ve kirlenme olasılığını en aza indirgemek için düzenleyin.
3. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyinIACUC gerekliliklerine göre (PPE)
4. Uygun post-operatif kurtarma odası ayarlayın. Anesteziklerin ve analjeziklerinizin bekarsız reaktifler kullanılarak taze hazırlandığından emin olun. IACUC onaylı protokol uyarınca uygun vücut ısısı bakım araçlarını kurun.
5. Insan NSC'lerin burun içinden verilmesinin testi için insan hastadan türetilmiş glioma hücre ksenograftlarını oluşturmak için, yaklaşık 6 haftalık yaştaki herhangi bir cinsiyette nu / nu atimik fare gibi bağışıklığı baskılanmış fare türlerini kullanın.
6. Hayvanı onaylanmış reaktifleri kullanarak, yani bir ketamin karışımı (50-100 mg / kg intraperitoneal (ip) enjeksiyonu yoluyla onaylanmış doz aralığı için kurumsal IACUC ile görüşün) ve ksilazin (5-10 mg / Kg; onaylanmış doz aralığı için kurumsal IACUC ile görüşün) 200-250 μL steril tuzlu suda veya inhalasyon cihazı kullanarak% 4-5 izofluran anestezi ile.
   1. Hayvanın cerrahi anestezi düzlemine geldiğinden emin olun bCilt kesilmesinden önce sıkıştırın. Hayvanın korneanın nemli halini sağlamak için bol steril oftalmik jel uygulayın.
7. Pritchett-Corning ve ark.na göre betadin ve izopropil alkolün tekrarlanan ve dönüşümlü dairesel mendillerini kullanarak kafatasını sterilize edin . ¹⁴ .
8. Cerrahi bıçak kullanarak insizyona başlamadan önce pre-insizyon analjezi, Buprenex'in (0.05-2 mg / kg) sc enjeksiyonu ile sağlanır.
9. Kafatasını ortaya çıkarırken hemostata yardımcı olmak için steril pamuk uçlu aplikatörü kullanın; Tesadüfi kanamanın temizlenmesini kolaylaştırmak için% 3 hidrojen peroksit kullanın.
10. Orta hatta 2 mm yanal ya da sağdan sola ve Bregma'nın 2 mm gerisinde (konum koordinatları isteğe göre uyarlanabilir) pervane bir el elektrikli bilyalı matkap kullanın (eni 1 mm'den az) Belirli bir çalışma için tasarlanmış tümör modelinde).
11. Hayvanı stereataksik çerçeveye uyguna monte edinE kafa pozisyonu, böylece yerleştirilen Hamilton mikro şırıngası, çapak deliğinin etrafındaki kafatasının yüzeyine dik olur. Hayvanın anestezi düzleminin ayak parmaklarının sıkıştırılmasıyla iyi durumda olmasına dikkat edin. Aşağıdaki aşamalarda hayvanın ağrı stresine maruz kalmadığından emin olmak için solunum hızını gözleyin.
    * Kulak içi çubuk yerleşimlerini vurgulamıyoruz, çünkü:
    1. İğneyi konumlandırmak için çapak deliğini önceden hazırladık ve bu nedenle, kesin kafatası koordinatları gereksizdir;
    2. Fare kulak kanalları kırılgandır ve kulak çubuklarının kulak içi yerleştirilmesinin amacına uygun olmayan daha kapsamlı bir eğitim gerektirir. Kemirgen kulak kanallarının hasar görme riski hassas bir yerleştirmenin faydalarından daha ağır basar;
    3. Yanak desteğinin gerçekleştirilmesi daha kolaydır ve konumlandırma sırasında aynı düzeyde fare başı dengesi ve dengesi elde etme kabiliyeti vardır. Zamana duyarlı birden fazla ameliyatın ekstra bir fayda sağlamasıIyi bir hücre canlılığı ile zamanında tamamlanma.
12. Stereotaksik çerçeve düğmelerini düz uçlu mikro şırıngayı çapak deliğine konumlandırmak için kullanın, sonra dura yüzeyinin 3 mm altına yavaşça indirin. İğnenin ucunu duranın 2,5 mm altında tutmak için 0,5 mm geri çekin.
13. 1 dakika boyunca önceden yerleştirilmiş gliom hücrelerinin 2.5 uL'sini enjekte edin. İğne yavaş yavaş 1-2 dakika önce pozisyonunu koruyun ve 1 dakika boyunca iğne beyninden çekip hücre geri akışını en aza indirgeye dikkat edelim. Ekstrakranial tümör gelişimini önlemek için steril kemik mumu uygulayın.
14. Yarayı, paslanmaz çelik yara klipsleri (7 mm) kullanarak kapatın. Steril laktated Ringer solüsyonu (önceden 37 ° C'ye kadar ısıtılan) 1 mL'lik bir subkütanöz (sc) enjeksiyon yapın ve hayvanı bir ısıtma pedi üzerinde yarım kalan bir geri kazanım odasına yerleştirin.
15. Hareket kabiliyetini tekrar kazandıklarında hayvanları havalandırılan rafa geri gönderin ve pürüzsüzleşmeyi sağlamak için rutin operasyon sonrası bakıma uyunKurtarma.

4. Tümör Büyümesinin İn Vivo Biyolüminesans Görüntüleme (BLI) ( Şekil 1B ) ¹⁵

NOT: Hastadan türetilen glioma hücreleri, ateşböceği lüsiferazını ifade edecek şekilde modifiye edilir. Bu, intrakranyal implantasyondan sonra tümör ilerlemesini izlememizi sağlar.

1. Görüntüleme oturumundan 10 dakika önce, hayvanlara D-luciferase, potasyum tuzu (150 mg / kg) ile ip enjeksiyonu yapın.
2. Hayvanları derhal IACUC tarafından onaylanmış oksijenli izofluran indüksiyon odasına yerleştirin.
3. Hayvanları, yazılım ayarlarını kullanarak BLI sinyalini yakalamak için ısıtmalı (37 ° C) görüntüleme bölmesine yerleştirin (ayrıntılar için, üreticinin talimatlarına bakın).

5. Bütün Beyin Işınlaması ( Şekil 1C ) ^{2 , 4 , 13}

NOT: İntranatif olarak verilen hNSC'lerin beyin tümörlerine migrasyonunu arttırmak için, intrakranyal tümör ksenograft taşıyan farelerin tüm beyin radyasyonundan yararlanılabilir ⁴ .

1. Farelerde anestezi indüklemek için sub-cerrahi anestezi düzlemi ile bir ketamin ve xylazine karışımı (50-100 mg / kg ve 5-10 mg / kg sırasıyla; ipotek enjeksiyonu kullanın; onaylanmış doz aralığı için kurumsal IACUC ile görüşün).
2. Fareleri kurşun kalkan blokları arasındaki odacık içine konumlandırmak için bir örnek tepsiden faydalanın, sadece radyasyon yoluna kafaya maruz kalmak için izin verin ( Şekil 2 ).
3. Farelere, tümör büyümesinin pozitif BLI teyidi (normalde glioma hücrelerinin implanasyonundan sonra 7-8. Günde) verin, ard arda beş gün boyunca günlük 2 Gy radyasyon dozu yapın. Son ışınlama dozundan sonra tümörün BLI değerlendirmesi yapın.

6. İnsan Sinirsel Kök Hücrelerinin Genetik Modifikasyonu (NSC'ler;E 3A) ⁴

1. % 95 oda havası ve% 5 C02 ( ^N NSC'ler) altında nemli 37 ° C inkübatörde% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile DMEM ortamında insan NSC'lerini (klon HB1.F3.CD) koruyun.
2. CXC motif kemokin reseptörü 4 (CXCR4) gibi kemotaksik reseptörlerin, insan CXCR4'ü için lentivirüs kodlayan transdüksiyon ile hNSC'lerde gen aşırı ekspresyonunu gerçekleştirin.
   1. NSC'ler% 75-80 konfluansa yaklaştırdığında, polibren (8 μg / mL) ile birlikte kültür ortamına CXCR4 lentivirüs ekleyin ve 8 saat veya gece boyunca inkübe edin.
   2. Transdüser hücrelerin pozitif seçimi için virüs içeren besiyeri 4 μg / mL'de blastikidin içeren taze besiyeri ile değiştirin.
   3. Modifiye edilmiş hNSC'lerdeki ( ^CXCR4 NSC'lerdeki) ^CXCR4 ekspresyon seviyesini, anti-CXCR4 antikorunu ve eşleşen izotip antikoru ve vi'yi kullanarak akış sitometrisi vasıtasıyla doğrulayınCXCR4 ve gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) cDNA'ları çoğaltan bir çift primer kullanılarak kantitatif bir RT-PCR ⁴ .
   4. Aynı strateji kullanarak RFC'nin CXCR4 genini değiştirerek vektör kontrol NSC'lerini ( ^VC NSC'ler) üretin ve RFP floresansının varlığı nedeniyle mikroskopla veya akış sitometrisiyle doğrulayın.

7. İnsan NSC'lerinin Hipoksik Ön Şartlandırma ( Şekil 3A ) ⁴

1. Plaka,% 90 birleşene kadar yukarıda tarif edildiği gibi T75 kültür şişelerinde NSC'leri kültürledi.
2. Otomatikleştirilmiş yerleşik akış sayacı ile kontrol edilen N ₂ gazı kaynağı ile 24 saat süreyle% 1 O ₂ seviyelerinde muhafaza edilen nemli bir CO ₂ odası / inkübatör içine hücre kültürü şişeleri yerleştirin. Bu hücrelere ^H NSC'ler denir. Kontrol ^N NSC'leri adım 7.1'de anlatılmıştır.

8. Hu'nun yüklenmesiOnkolitik Virüslü İnsan NSC'leri ( Şekil 3B -3H ) ⁵

1. 8.1 Koşullu replikatif adenovirüs (CRAd) -S-pk7 viral partikülleri / hücre ^{4 , 16} ile ^N NSC, HNSK, ^VC NSC ve ^CXCR4 NSC'leri enfekte edin.
2. 8.2. Periyodik musluklarla oda sıcaklığında 2 saat inkübasyondan sonra, bağlanmamış viral partikülleri çıkarmak için hücreleri üç kez medya ile yıkayın ve hücreleri, enjeksiyonluk steril salin içinde süspanse edin.
   DİKKAT: BSL2 gibi uygun biyogüvenlik düzeyi tanımlamaları ile tesislerdeki virüsle ilgili tüm in vitro hücre kültürü prosedürlerini uygulayın. Uygun kişisel koruyucu ekipman, kurumsal hayvan tesisleri talimatlarına göre onkolitik virüsü tutan araştırmacılar tarafından giyilmelidir ^{4 , 16} .

9. Kök Hücrelerin Mikro İle YüklenmesiManyetik Rezonans Görüntüleme (MRI; Şekil 3B- 3H ) vasıtasıyla In-Vivo İzlem için n-boyutlu Paramanyetik Demir Oksitler (MPIO'lar)

1. Köpek hücrelerini etiketlemek için, ~% 80 konfluende, gece boyunca inkübasyon için transfeksiyon reaktifi varlığında hücre kültürlerini kökleştirmek için MPIO'ları ekleyin. MPIO'lar (flaş kırmızı konjüge) ile kök hücre etiketlemenin (NSC'ler ⁴ veya MSC'ler ² ) etkinliği, akış sitometrisi ile belirlenir.
2. Glioma taşıyan hayvanların beyinlerinde kök hücre göçünü ve dağılımını görselleştirmek için hem çok dilimli, hem de yüksek çözünürlüklü T2 ağırlıklı Hızlı Gevşeme Geliştirme spin eko görüntüleri ve çok dilimli T1 ağırlıklı Hızlı Düşük Açılı Atış (FLASH) gradyan eko serileri elde edin Yapıyı, fare beyninin koronal ve eksenel düzlemleri vasıtasıyla değerlendirin ² .

10. Terapötik NSC'lerin burun içi teslimi ( Şekil 1D ve Şekil 3D ) ^{2 , 4}

1. Bölüm 3'te açıklanan protokole göre NSC'leri ( ^N NSC'ler, ^H NSC'leri, ^VC NSC'leri ve ^CXCR4 MGK'larını) toplayın ve toplayın.
   DİKKAT: OV yüklü NSC'leri içeren tüm hayvan prosedürleri, BL2 veya BSL2 tesisleri gibi biyogüvenlik düzeyi belirlenmiş olan tesislerde yapılmalıdır.
2. 3. adıma göre bir ketamin ve ksilazin karışımının ip enjeksiyonu yoluyla farelere anestezi uygulayın.
3. Fareleri, vücut sıcaklığını korumak için altındaki bir ısıtma pedi ile yüzü yukarı bakan açık bir örtünün üzerine yerleştirin. Fare başlığının altına yerleştirildiğinde burun deliklerinin dik durmasını sağlamak için rulo kağıt havlularından yapılmış yastıklı bir yastığı bantlarla ayarlayın.
   NOT: Hiyalüronidaz ön muamelesi (burun ezisinin 5 dakikalık aralıklarla dört tekrarlanan aşılama, her burun deliğinde 3 uL) toplam 100 UPithelium daha önce ^{2 ,} 17'de tanımlanmıştır.
4. Bir mikropipet kullanarak, farenin her burun deliğine NSC süspansiyon 2 mcL dağıtın. Bir sonraki fareye geçmeden önce damlacıktaki aspirasyonu görsel olarak teyit edin. Teslim edilen toplam hücre sayısı kullanıcı tarafından belirlenebilir; 0.5-1 milyon hücre 4 x 2 μL dozlarda verilebilecek şekilde 62.500-125.000 hücre / μL kullanın.
5. Her hücre süspansiyonu uygulaması arasında 5 dakikalık aralıklarla 4 kata kadar bir zamanlayıcı kullanın.
6. Sırt üstü pozisyonu korunurken, hayvanlara bir iyileştirme odasında hareketlilik kazandırın.

11. Hayatta Kalma Analizi ( Şekil 3E )

1. Hayvanların hayatta kalma süresini istatistiksel yazılımda girin ve log-rank testini kullanarak aşağıdaki önem belirtmeleri ile istatistiksel karşılaştırmalar yapın: * p < 0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.

12. İntranazal Kök Hücre Beyin Girişinde Doku Toplama ve Histoloji / İmmünositokimya Doğrulaması ^{2 , 4}

1. Çalışmanın bitim noktasında, fareleri IACUC onaylı protokollerle euthanize edin. Standart bir uygulama, birincil ötanazi stratejisi olarak hayvanları feda etmek için perfüzyon fiksasyonuyla tahliye sonrası bir akış hızı kontrollü CO ₂ odası kullanmaktadır.
2. Kurban edildikten hemen sonra, kan damarlarındaki kan kalıntılarının yok edilmesi ve dokuların daha sonraki histolojik analizler için korunması için hayvan üzerinde PBS ile intrakardiyak bir perfüzyon gerçekleştirin.
3. CO ₂ -euhanized hayvan yatar pozisyonda bir emici ped üstüne koyun, kalp maruz kalma, göğüs kafesi ile birlikte disseke diyafram kas ortaya maruz bir laparotomi ile devam edin.
4. Baba sonraSağ atriyumda bir çift kesme makas kullanarak bir kral yapın, apsende sol ventrikül aracılığıyla 3-5 mL'lik bir PBS enjeksiyonu ile kan kaybını hızlandırın. Bir şırınga kullanarak buz soğukluğunda% 4 paraformaldehid (PFA) dolaşıma enjekte edin; Periferik kas spazmları, dolaşımda düzgün doku fiksasyonunu engelleyecek önemli bir blokaj olmadığını görsel olarak teyit eder.
5. Cerrahi olarak karkasın başını çıkarın ve gece boyunca 4 ° C'de% 4 PFA içinde 50 mL santrifüj tüpünde saklayın. Çözümü bir sonraki gün 24 saat sonra beyin dokusu diseksiyonundan önce% 30 sakroza değiştirin.
6. Beyin dokusunu OCT bileşiğine yerleştirin ve kuru buz üzerinde izopentan üzerinde hızlı dondurun. Histoloji ve immünositokimya uygulamaları için 10-20 μm'lik doku kesitleri oluşturmak için nihai doku bloğunun kriyoteksiyon işlemi yapın.

Sonuçlar

Hem hipoksik ön-muamele ( Şekil 4A ) hem de CXCR4 aşırı ekspresyonu ( Şekil 4B ve 4C ) ⁴ , akış sitometrisi ile gösterildiği gibi, CXCR4 reseptörlerinin hücre zarı varlığını önemli derecede yukarı düzenler. NSC'ler tarafından gösterilen tümör tropizmi (mavi oklar), tümör dokusu histolojisinde (kırmızı daire) gösterilmektedir. Tümördeki MPIO-işaretli (

Tartışmalar

İlacın intranazal yolu, küçük moleküller, nanomedikal ilaçlar ve protein bileşikleri için yaygın olarak araştırılmış olmasına rağmen, intranazal beyin tümörü hedeflemesi için terapötik kök hücrelerin uygulanması, gelişmekte olan beyin tümörü terapötik spektrumunda çok yeni ^{2 , 3 , 4} . Burun boşluğundaki kök hücrelerin davranışları ile ilgili karmaşık karmaşıklıklar bulunmaktadır ve mo...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic frame	Kopf Instruments	Model 900
Hypoxic Cell Culture Incubator	ThermoFisher Scientific	VIOS 160i
Cell culture supplies (Plastics)	ThermoFisher Scientific	Varies	Replaceable with any source
Legend Micro 21R Refrigerated Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002490	Replaceable with any source
Bench centrifuge Sorvall ST16R	ThermoFisher Scientific	75004240	Replaceable with any source
Micro syringe 702N 25 µl (22S/2"/2)	Hamilton Company	80400	Flat tip
Sample Tray for Irradiator	Best Theratronics	A13826	To set up mice protection with lead shield
Leica DMi8 Microscope	Leica Microsystem		Custom setup
Leica CM1860 UV cryostat	Leica Microsystem		Custom setup
Exel International Insulin Syringe	ThermoFisher Scientific	14-841-31
Corning Phosphate Buffer Saline	Corning Cellgro/ThermoFisher	21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning Cellgro/ThermoFisher	11965-084
Trypsin 0.05%	Corning Cellgro/ThermoFisher	25300054
Hyaluronidase from bovine testes	MilliporeSigma	H3506