JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويصف هذه المخطوطة بروتوكولات موحدة لقياس هايبرفوسفوريليشن تاو، قياس ملزمة تاو microtubules، وتوطين تاو داخل الخلايا بعد العلاج بالعقاقير. ويمكن استخدام هذه البروتوكولات متكررة لفحص المخدرات أو غيرها من المركبات التي تستهدف الربط تاو هايبرفوسفوريليشن أو ميكروتوبولي.

Abstract

تاو المرتبطة microtubule البروتين هو بروتين الخلايا العصبية التي يموضع معظمها في محاور عصبية. عموما تاو أمر ضروري لعمل الخلايا العصبية العادية نظراً لأنها تشارك في الجمعية ميكروتوبولي وتحقيق الاستقرار. وإلى جانب الخلايا العصبية، يتم التعبير عن تاو في الثدي والبروستاتا، المعدة، القولون والمستقيم، وسرطان البنكرياس حيث يظهر هيكل مماثل تقريبا وتمارس مهام مماثلة تاو الخلايا العصبية. مقدار تاو وعن الفسفرة يمكن تغيير وظيفتها كعامل استقرار ميكروتوبوليس، ويؤدي إلى تطوير خيوط حلزونية المزدوجة في اضطرابات الأعصاب المختلفة، مثل مرض الزهايمر. من المهم تحديد الدولة الفسفرة تاو وخصائصها microtubule ملزمة. وباﻹضافة إلى ذلك، دراسة التعريب داخل الخلايا من تاو مهم في أمراض مختلفة. هذه المخطوطة تفاصيل البروتوكولات القياسية لقياس الفسفرة تاو وملزم تاو إلى microtubules في خلايا سرطان القولون والمستقيم مع أو بدون الكركمين والعلاج ليكل. يمكن استخدام هذه العلاجات لوقف انتشار خلايا السرطان والتنمية. يتم فحص توطين تاو داخل الخلايا باستخدام إيمونوهيستوتشيميستري والفحص المجهري [كنفوكل] أثناء استخدام كميات قليلة من الأجسام المضادة. ويمكن استخدام هذه فحوصات متكررة لفحص المركبات التي تؤثر على هايبرفوسفوريليشن تاو أو ملزمة microtubule. رواية المداواة المستخدمة لمختلف تاوباثيس أو وكلاء السرطان ذات الصلة يمكن أن توصف احتمال استخدام هذه البروتوكولات.

Introduction

واعتبرت تاو أصلاً البروتينات المرتبطة microtubule الحرارة مستقرة كان المنقي يشترك مع توبولين1. وأعرب تاو هو حصرا في أعلى حقيقيات النوى2،،من34. وتتمثل المهمة الرئيسية تاو هو السيطرة microtubule الجمعية1،،من56. كما أنه يسهم البلمرة microtubules7، النقل محواري8، والتغييرات في القطر محواري9، تشكيل قطبية عصبي، ونيوروديجينيريشن10. تاو أيضا بمثابة سقالة بروتين للتحكم في بعض مسارات الإشارات. تشير دراسات الدماغ الفئران إلى أن تاو العصبية وأنه يموضع أساسا في محاور عصبية11. نظراً لأن تاو أساسي البلمرة microtubule وتنمية الخلايا العصبية، تاو كان الافتراض بأن تلعب دوراً رئيسيا في التنمية محواري في الجهاز العصبي المركزي؛ كانت هذه الفرضية في وقت لاحق يتم التحقق من تجارب في المختبر و في فيفو . بالإضافة إلى الخلايا العصبية، وهو أعرب عن تاو في الخلايا غير العصبية المختلفة، بما فيها الكبد والكلى والعضلات خلايا12،13. وأعرب تاو هو أيضا في الثدي والبروستات، القولون، والمعدة، وسرطان البنكرياس خلية خطوط وأنسجة14،15،16،،من1718، 19-تاو موجود أيضا في هيئة إدراج التهاب العضل توبولوفيلامينتس الملتوية في الهيئات إدراج20.

تاو قد تحمل عدة تعديلات بوستترانسلاشونال. جميع التعديلات بوستترانسلاشونال، الفسفرة هي الأكثر شيوعاً. الفسفرة تاو زيادة إنقاص النسب ل microtubules، أخيرا المزعزعة للاستقرار في سيتوسكيليتون. وقد وصف مواقع الفسفرة خمسة وثمانون في البروتين تاو المعزولة من أنسجة المخ البشري مرض الزهايمر. وتشكل 53% من هذه المواقع، سيرين، ثريونين 41% وفقط 6% تيروزين بقايا21،،من2223. ويؤثر الفسفرة تاو التعريب والدالة وملزم، القابلية للذوبان وقابليته لتعديلات أخرى بوستترانسلاشونال. كما تاو الفسفرة إلى أكثر من المدى الطبيعي (أو مشبعة تماما مع مجموعات الفوسفات) يعرف باسم هايبرفوسفوريليشن التي يتطابق الخصائص الهيكلية والوظيفية لمرض الزهايمر24. يحافظ على الأداء السليم ل microtubules محواري تاو ويضمن أداء الخلايا العصبية طبيعية في ظل الظروف الفسيولوجية. ومع ذلك، فشل تاو هايبرفوسفوريلاتيد للحفاظ على ربط microtubule منظمة تنظيماً جيدا، مما تسبب في فقدان الخلايا العصبية بسبب تفكك microtubule. المستويات العادية من الفسفرة تاو مطلوبة من أجل تاو سليمة الأداء، لكن تاو فشل لتعمل بشكل طبيعي إذا تم تعديل مستوى الفسفرة المميزة لها، وإذا لم هايبرفوسفوريلاتيد25. في مرض الزهايمر، وبعض اضطرابات الأعصاب المرتبطة بالسن الأخرى، يصبح هايبرفوسفوريلاتيد تاو وأشكال خيوط حلزونية المزدوجة والتشابك نيوروفيبريلاري26،27. وهكذا، أساليب لتحديد الفسفرة تاو وملزمة microtubule هامان.

سرطان القولون والمستقيم، سرطان المرتبطة بالشيخوخة، الثالث الأكثر شيوعاً تشخيص السرطان والسرطان المسببة للوفاة الثالثة بارزة ل كل من الرجال والنساء28. سرطان القولون والمستقيم واحد من أنواع السرطان الرئيسية المسببة للوفاة في العالم الغربي29. نظراً لأن سرطان القولون والمستقيم ومرض الزهايمر المرتبطة بالشيخوخة، وكلاهما يحدث أساسا في البلدان المتقدمة حيث يتمتع الناس بالعادات الغذائية مماثلة، قد على نحو ما الربط بين هذين المرضين. وبالإضافة إلى ذلك، الخلايا السرطانية تاو-الإيجابية والسلبية تاو تستجيب بشكل مختلف لوكلاء العلاج الكيميائي، مثلاً، باكليتاكسيل16.

الكركمين واحد من المشتقات الرئيسية من كركم لونغا، الكركم التوابل الهندية30. لعدة قرون، السكان في جنوب آسيا قد استهلكت الكركم في وجباتهم بشكل يومي. الكركمين ويستخدم لعلاج الأمراض المختلفة، بما في ذلك سرطان القولون والمستقيم ومرض الزهايمر والسكري، التليف الكيسي، مرض التهاب الأمعاء، والتهاب المفاصل، والدهون، وتصلب الشرايين ومرض القلب الاقفاري31، 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38-الليثيوم أيضا يمكن أن تقتل خلايا سرطان القولون والمستقيم أو منع الانتشار على39. يمكن أيضا استخدام الليثيوم لعلاج مرض الزهايمر40 كما أنه يقلل من تراكم تاو ويمنع هايبرفوسفوريليشن، وكما لاحظ ماوس المعدلة وراثيا نموذج41،42،43، 44.

وتهدف هذه المخطوطة إلى: 1) قياس مجموع تاو ومستويات التعبير والرمات-تاو في الخلايا المعالجة؛ 2) تصف مقايسة الفوسفاتيز قياس الشامل تاو الفسفرة؛ 3) دراسة ملزمة microtubule من تاو؛ و 4) ترجمة تاو بالفحص المجهري [كنفوكل] في خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم، تعامل مع الكركمين أو ليكل. وتكشف النتائج أن خلية العلاج مع الكركمين، وهو عامل جيد يفترض أن العلاج الكيميائي لسرطان القولون، ويمكن أن تقلل من التعبير عن كلا تاو مجموع المعاملة مع ليكل وفوسفوريلاتيد تاو في خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم. يمكن أن تسبب هذه العلاجات أيضا النووية إزفاء من تاو. ومع ذلك، بشكل غير متوقع، يفشل الكركمين تحسين ربط تاو إلى microtubules.

Protocol

1-"إعداد الكواشف"

  1. إضافة 10 ميليلتر (1 مم) فينيلميثيلسولفونيل الفلوريد الحل، 10 ميليلتر (س 1 من الأسهم x 100) الحل كوكتيل مثبط البروتياز، و 10 ميليلتر (س 1 من الأسهم x 100) من الفوسفاتيز حل كوكتيل مثبط لمل 1 x radioimmunoprecipitation 1 المقايسة (ريبا) العازلة لإعداد المخزن المؤقت تحلل ريبا كاملة-
  2. تحضير 10 × المخزن المؤقت في المخزن المؤقت (بيم) tubulin عامة.
    1. إضافة 800 ملم (6.0474 ز) الببرازين-N-N '-مكررا-2-اثانيسولفونيك حامض، 10 مم (95.1 ملغ) جليكول-bis(β-aminoethyl ether)-N، N، N '، ن '-تيتراسيتيك حامض و 10 ملم (51 ملغ) مجكل 2 و 1.25 هيدروكسيد الصوديوم M (3 مل من 10 أمتار) في أنبوب 50 مل ، تخلط مع 15 مل مقطر من الماء، وحل باستخدام دوامة. تحقق من الرقم الهيدروجيني (يجب أن يكون 6.9). إذا كان الرقم الهيدروجيني > 6.9، تجاهل المخزن المؤقت، وطبعه جديدة الكثير طازجة.
      ملاحظة: ينبغي أن تكون هيدروكسيد الصوديوم أدناه 1.25 متر لضمان عدم تخطي هذا الرقم الهيدروجيني 6.9. لا ينصح باستخدام HCl لضبط الأس الهيدروجيني > 6.9.
    2. هيدروكسيد الصوديوم إضافة دروبويسي حتى يصبح pH 6.9. إضافة الماء المقطر لجعل يصل إلى 25 مل من المخزن المؤقت بيم X 10. وأخيراً، إجراء التصفية باستخدام المحاقن وعامل تصفية حقنه 0.2 ميكرون. تقسيم هذا المخزن المؤقت إلى مختبرين في أنابيب 1.5 مل وتخزينها في 4 ° C.
  3. تحضير 5 × عينة المخزن المؤقت مع عامل تخفيض وصبغ-
    1. ميكس 300 ميليلتر (60 ملم) من 1 م تريس-HCl (6.8 درجة الحموضة)، 2.5 مل (25 في المائة) من 50% والغليسيرول، مل 1 (2%) من 10% الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS)، والمياه 1.2 مل المقطر ليشكلون 5 مل 5 × المخزن المؤقت لنموذج صحيفة بيانات السلامة. تخزين في − 20 درجة مئوية.
      ملاحظة: نظراً لأن الجلسرين لزج، قياس 1.25 مل والغليسيرول صعب. ويزن مل واحد من 100 ٪ الجلسرين ز 1.26. وهكذا، تزن 1.575 ز والغليسيرول 100% (الذي يساوي 1.25 مل 100% أو 2.5 مل والغليسيرول 50%) في 15 مل أنبوب أولاً؛ تخلط جيدا مع المكونات الأخرى.

2. خلية ثقافة والعلاج مع الكركمين أو العلاج ليكل وفحص تعبير البروتين

  1. إضافة ~ 1 × 10 6 HCT 116 الخلايا إلى 100 مم زراعة الأنسجة الأطباق التي تحتوي على الحد الأدنى الضروري وسائط الإعلام (ذاكرة) تستكمل مع الأبقار الجنين 10% مصل الدم (FBS) والبنسلين-ستربتوميسين 1%. بعد يوم واحد من استزراع الخلايا سوف تصل إلى التقاء 60-70 ٪.
    ملاحظة: عدد اللوحات المطلوبة يعتمد على عدد العلاجات الموصوفة أدناه.
  2. عند التوصل إلى التقاء ~ 65% (تقريب استخدام الفحص المجهري) الخلايا، وإزالة المتوسطة MEM تكملة وإضافة ذاكرة خالية من المصل مع 5 ميكرومتر 10 ميكرومتر، و 30 الكركمين ميكرومتر أو 25 مم، 50 مم و 100 مم ليكل. احتضان في 37 درجة مئوية ل 24 ساعة في جو هوميديفيد التي تحتوي على 5% CO 2-
  3. ح 24 بعد العلاج، وتغسل الخلايا مع 1 مل المثلج مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)، وكشط الخلايا باستخدام مكشطة خلية. نقل الخلايا كشط إلى 1.5 مل الطرد المركزي أنابيب والطرد المركزي لمدة 4 دقائق في س 1,800 ز عند 4 درجة مئوية للحصول على خلايا الكريات.
  4. الخلايا بتعليق الكريات في 100 ميليلتر الكامل ريبا العازلة عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة بينما بانتظام التنصت على الأنابيب. Sonicate العينات بإيجاز-
  5. الطرد المركزي هوموجيناتيس خلية في benchtop أجهزة الطرد مركزي في 22,570 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية. نقل سوبيرناتانتس إلى أخرى الأنابيب المسماة باستخدام ماصة.
  6. قياس تركيز البروتين في سوبيرناتانتس ب مقايسة برادفورد 45 استخدام مجموعات تجارية بالبروتين-الإنزيم.
  7. تحضير عينات من البروتين تساوي تركيز (عينة ميليلتر البروتين/13 ميكروغرام 10) خلية ليساتيس مع 4 X مخزونات النشر الاستراتيجي جل تحميل المخزن المؤقت. إعداد 4 × مخزونات النشر الاستراتيجي جل تحميل المخزن المؤقت الطازجة التي تحتوي على 400 مم ديثيوثريتول (DTT)-
    ملاحظة: في هذه المرحلة، عينات يمكن تخزينها في − 20 درجة مئوية إذا لزم الأمر-
  8. إينكوباتي العينات على كتلة حرارة عند 100 درجة مئوية للحد الأدنى 5 خلط العينات باستخدام دوامة والانتظار لتبرد لهم ~ 10-15 دقيقة
  9. تجميع نظام التفريد. البروتين
    1. تحميل 10 ميكروغرام (13 عينة ميليلتر) لكل بئر في جل الحزب الديمقراطي الصربي-polyacrylamide 10% للتفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة). تحميل سلم الوزن الجزيئي إلى الجل إلى حارة واحدة.
      ملاحظة: يبدأ التفريد، سيتم حل سلم البروتين في نطاقات البروتين من الأوزان الجزيئية الظاهر. استخدم هذه العصابات لتقدير الأوزان الجزيئية لنطاقات البروتين غير معروف.
    2. بعد تحميل العينات، توصيل أقطاب الإيجابية والسلبية للنظام الكهربي لمصدر طاقة للحفاظ على جهد مستمر. في البداية، في بداية 70 الخامس لمدة 20 دقيقة لنقل العينات البروتين من هلام التراص في جل حل. ثم، بزيادة الجهد إلى 125 الخامس لما يقرب من 70-120 دقيقة حتى سلم البروتين وعينات تصل إلى نهاية جل.
    3. بعد انتهاء التفريد، نقل الهلام إلى غشاء الفينيليدن ثنائي الفلوريد (PVDF) باستخدام نظام اليكتروبلوتينج رطب. نقل لدقيقة ~ 100 في 100 ضد كتلة الغشاء في المخزن المؤقت حظر ألبومين المصل البقري 4% (BSA) لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة حوالي 25 درجة مئوية.
  10. مارك وصمة عار بقطع عليه على الجانب مع سلم الوزن الجزيئي. استخدام ورقة بلاستيكية شفافة وقاطع حاد لقطع وصمة عار. إعداد الحلول الابتدائية-جسم (تاو المضادة في 1:5، 000؛ مكافحة-والرمات-تاو في 1:4، 000) واحتضان وصمة عار في هذا الحل عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  11. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، غسل وصمة عار لدقيقة 7 أربع مرات في حل مخزنة الفوسفات المالحة-توين-20 (ببست)-
  12. إعداد الحلول جسم الثانوية ذات الصلة (الأرنب المضادة الماعز أو الماوس المضادة IgG في 1:5، 000)، واحتضان وصمة عار في هذا الحل لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة حوالي 25 درجة مئوية. الغسيل في ببست أربع مرات، 7 دقيقة.
  13. وضع وصمة عار باستخدام مجموعة أدوات تشيميلومينيسسينسي وفقا للشركة المصنعة ' توصيات s. تغطية وصمة عار غلاف بلاستيكي شفاف باستخدام. الحصول على الصور من تشيميلومينيسسينسي نظام تشيميلومينيسسينسي مع البرامج ذات الصلة التصوير-

3. تحليل الفوسفاتيز

  1. معاملة ليساتيس خلية (من الخطوة 2، 5) مع الفوسفاتيز القلوية في المخزن المؤقت الفوسفاتيز القلوية.
    1. للسيطرة على حد سواء، وإعداد العينات المعالجة، 20 ميليلتر العينات التي تحتوي على 20 ميكروغرام مجموع البروتين. إضافة حجم ليساتيس الخلية التي تحتوي على 20 ميكروغرام من مجموع البروتين، تليها 2 ميليلتر الفوسفاتيز القلوية المخزن المؤقت والفوسفاتيز القلوية 10 ميليلتر. إضافة الماء المقطر لجعل حتى 20 ميليلتر.
  2. احتضان هذه العينات في 37 درجة مئوية حاء 1 وقف رد الفعل بإضافة حمض الإيثيلين (يدتا) بتركيز نهائي 50 مم، أو عن طريق إضافة أورثوفاناداتي الصوديوم (Na 3 فو 4) بتركيز نهائي 10 ملم. يمكن أيضا إيقاف رد فعل من التدفئة في 75 درجة مئوية للحد الأدنى 5
  3. قبل انتهاء حضانة العينات مع الفوسفاتيز، إعداد عينات تركيز نفسه دون إضافة الفوسفاتيز للمقارنة مع عينات تعامل الفوسفاتيز.
  4. إضافة 4 الطازجة "الحزب الديمقراطي الصربي س" جل-تحميل مخزن يحتوي على 400 مم DTT.
  5. احتضان العينات على كتلة حرارة عند 100 درجة مئوية للحد الأدنى 5 ميكس العينات باستخدام دوامة. بارد في درجة حرارة الغرفة ل ~ 10-15 دقيقة
  6. تجميع نظام التفريد لتشغيل هلام بولياكريلاميدي 10% من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.
    1. تحميل 10 ميكروغرام البروتين (13 عينة ميليلتر) جيدا في بولياكري 10%هلام لاميدي. تحميل سلم الوزن الجزيئي.
    2. بعد تحميل النموذج، الاتصال أقطاب الإيجابية والسلبية للنظام الكهربي لمصدر طاقة للحفاظ على جهد مستمر. في البداية، في بداية 70 الخامس لمدة 20 دقيقة لنقل العينات البروتين من هلام التراص في جل حل. ثم زيادة الجهد إلى 125 الخامس وتشغيل الجل لحوالي 70-120 دقيقة حتى سلم البروتين وعينات تصل إلى نهاية جل.
    3. بعد انتهاء التفريد، نقل الهلام إلى غشاء PVDF باستخدام نظام اليكتروبلوتينج رطب. نقل لدقيقة ~ 100 في 100 ف.
      4. علامة
    4. وصمة عار بجعل صغيرة قطع على الجانب سلم الوزن الجزيئي. استخدام ورقة بلاستيكية شفافة وقاطع حاد لقطع وصمة عار.
  7. كتلة الغشاء في المخزن المؤقت حظر جيش صرب البوسنة 4% لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
  8. احتضان وصمة عار في حل جسم الابتدائية (تاو المضادة في 1:5، 000) في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. غسل وصمة عار في ببست أربع مرات، لمدة 7 دقائق.
  9. إعداد الحل جسم الثانوية ذات الصلة (الماوس مفتش الماعز المضادة في 1:5، 000)، واحتضان وصمة عار لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تغسل في ببست أربع مرات، لمدة 7 دقائق.
  10. وضع وصمة عار باستخدام مجموعة أدوات تشيميلومينيسسينسي وفقا للشركة المصنعة ' توصيات s. تغطية وصمة عار داخل غلاف بلاستيكي شفاف. الحصول على الصور من تشيميلومينيسسينسي نظام تشيميلومينيسسينسي مع البرامج ذات الصلة التصوير-

4. Microtubule ملزم بالانزيم

  1. مقايسة الربط microtubule، كرر الخطوتين 2.1-2.6.
  2. تحضير 1 × (2 مل) يم المخزن المؤقت من 10 "س يم" العازلة المخزنة في 4 درجات مئوية بإضافة 20 ميكرومتر (40 ميكروليتر) باكليتاكسيل و 1 مم (20 ميليلتر) أنشئ. تأخذ ميكروتوبولي الأسهم (طن متري) من − الثلاجة 80 درجة مئوية ومخزون العامل تاو كولاي من − الثلاجة 20 درجة مئوية.
  3. إعداد العينات وفقا الجدول 1-
  4. احتضانها في 37 درجة مئوية ل Ultracentrifuge 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في 100,000 س ز.
  5. نقل 120 ميليلتر من سوبيرناتانتس التي تحتوي على غير منضم تاو، لتنظيف والمسمى أنابيب.
    6. عينة من المخزن المؤقت إلى بيليه تتضمن تاو منضم
  6. 120 إضافة ميليلتر (نفس وحدة التخزين كالمادة طافية) 5 س ومزيج دقيق. نقل الحل لتنظيف الأنابيب المسماة ومزيج دقيق.
  7. قياس تركيز البروتين (راجع الخطوة 2، 6)-
    ملاحظة: أثناء إعداد العينات، استخدام وحدة تخزين الحل (الخطوة 4.6) لإعداد عينات المادة طافية وبيليه.
    8. إعداد عينات تركيز البروتين ما يعادل
  8. وإضافة طازجة 4 × مخزونات النشر الاستراتيجي جل-تحميل المخزن المؤقت الذي يحتوي على القيمة (400 ملم)-
    ملاحظة: يمكن تخزين العينات في − 20 درجة مئوية في هذه المرحلة-
  9. كرر الخطوات من 3-3.5، 10-
< td colspan = " 2 >
العينة اسم ميكروتوبولي حاجة حاجة "البروتين الرئيسي" بيم-غتب-PTX
1 HCT 116-التحكم (6.21 ميكروغرام/ميكروليتر) 2 ميكروليتر 9.66 ميكروليتر (60 ميكروغرام) ميكروليتر 108.34
2 HCT 116-الكركمين 10 ميكرومترات (4.81 ميكروغرام/ميكروليتر) 2 ميكروليتر 16.63 ميكروليتر (80 ميكروغرام) ميكروليتر 101.37
3 HCT 116-الكركمين 20 ميكرومتر (3.28 ميكروغرام/ميكروليتر) 2 ميكروليتر ميكروليتر 30.49 (100 ميكروغرام) ميكروليتر 87.51
4 HCT 116-ليكل 25 مم (5.43 ميكروغرام/ميكروليتر) 18.42 ميكروليتر (100 ميكروغرام) 2 ميكروليتر ميكروليتر 99.58
5 تاو كولاي 2 ميكروليتر ميكروليتر 1 352-تاو ميكروليتر 117
6 طن متري فقط 2 ميكروليتر X ميكروليتر 118
ميكروليتر 120 كل

الجدول 1: عينة التحضير للمقايسة ملزمة microtubule.

5-الترجمة والتعبير تاو بعد "العلاج من الخلايا" مع الكركمين

  1. تنظيف ساترة استخدام الإيثانول 70% والجاف باستخدام أنسجة مختبرية. إدراج ساترة مفردة في كل بئر من صفيحة المسمى 6-جيدا-زراعة الأنسجة. وضع اللوحة على سلامة بيولوجية مجلس الوزراء والتبديل في الأشعة فوق البنفسجية خفيفة على الأقل 3 h.
  2. ثقافة فرعية الخلايا والبذور منهم في الآبار ذات الصلة من لوحة 6-جيدا في 2.5 × 10 5 خلايا/بئر في الموصى به الثقافة المتوسطة.
  3. بعد ح ~ 24، دراسة الخلايا باستخدام مجهر مقلوب باستخدام 10 X و 40 X أهداف للتحقق من التغييرات الشكلية الخلوية. تسجيل صور إذا لزم الأمر-
  4. شطف الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني مرتين. إصلاح الخلايا في فورمالدهايد 3.7% في حاضنة 37 درجة مئوية في الظلام-
    ملاحظة: التثبيت قبل والفورمالديهايد في درجة حرارة الغرفة يعمل بشكل جيد، أيضا. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع الفورمالدهيد.
    5. أغسل
  5. الخلايا في برنامج تلفزيوني. إصلاح الخلايا في الميثانول المثلج في − 20 درجة مئوية للحد الأدنى 15 بيرميبيليزي الخلايا التي تفرخ منهم في جيش صرب البوسنة 3% و 0.1% أغسل X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني على الجليد للحد الأدنى 10 الخلايا مع PBS.
  6. احتضان الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لحظر (BSA 3% و 0.1% 20 توين في حل برنامج تلفزيوني) ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: حضانة ح 2 في 4 درجات مئوية يعمل بشكل جيد، جداً.
  7. إعداد الحل الابتدائية-جسم (تاو المضادة في 1: 200) في جيش صرب البوسنة 3% و 0.1% 20 توين في برنامج تلفزيوني (مثلاً، 2 ميليلتر تاو-13 جسم في المخزن المؤقت لمل 0.4).
  8. قطع قطعة صغيرة من PVDF الغشاء حيث أن القطع تناسب بشكل صحيح داخل كل بئر من لوحة 6-جيدا؛ نقع في الماء لدقيقة 5 مكان قطع PVDF في كل بئر-
  9. ميليلتر 60 إضافة حل جسم الأولية للقص القطع PVDF في كل بئر. ضع كوفيرسليبس أن الخلايا يمكن أن تلمس الحل الابتدائية-جسم. تبني في 4 درجات مئوية في غرفة مظلمة، والرطبة بين عشية وضحاها. تغسل في برنامج تلفزيوني أربع مرات.
  10. إعداد الحل جسم الثانوية (مترافق fluorescein 594 المضادة الماوس مفتش في 1: 400) في جيش صرب البوسنة 3% و 0.1% 20 توين في برنامج تلفزيوني.
  11. قص قطع صغيرة من الغشاء PVDF حيث أن القطع تناسب بشكل صحيح داخل كل بئر من لوحة 6-جيدا، ونقع في الماء لدقيقة 5 مكان قطع PVDF في كل بئر-
  12. ميليلتر 80 إضافة الحل الثانوية-الأجسام المضادة لكل من القطع PVDF في لوحة 6-جيدا. ضع ساترة أن الخلايا يمكن أن تلمس الحل جسم الثانوية. احتضان في غرفة مظلمة، والرطبة في درجة حرارة الغرفة ل 2 حاء – المياه والصرف الصحي مع برنامج تلفزيوني أربع مرات.
  13. تحميل عينات في المتوسط المتصاعدة مع 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) والإصلاح كوفيرسليبس على الشرائح الزجاجية. إسقاط
    1. إضافة واحدة متوسطة المتصاعدة مع DAPI على الشرائح الزجاجية. إزالة كوفيرسليبس من كل بئر ووضعها على الشرائح الزجاجية التي تحتوي على المتوسط المتصاعدة مع DAPI. التأكد من أن يمس سطح كل ساترة التي تحتوي على خلايا الملون في مونالمتوسطة تينغ على الشريحة الزجاجية المقابلة.
    2. تطبيق مسمار البولندية جميع أنحاء كل ساترة لختم وإصلاحها محكم على الشرائح الزجاجية. إذا لزم الأمر، القيام بهذه الخطوة مرتين-
  14. إينكوباتي ل 1.5 ح في درجة حرارة الغرفة في غرفة مظلمة.
  15. دراسة الشرائح باستخدام مجهر [كنفوكل] باستخدام زيت الغمر في ساترة في غرفة مظلمة.

النتائج

وتم بحث التعبير عن مجموع تاو والفوسفات-تاو بعد علاج الخلايا بتركيزات مختلفة من الكركمين أو ليكل (الشكل 1). معاملة الخلايا بتركيزات مختلفة ثلاث الكركمين انخفضت مستويات التعبير تاو؛ التعبير والرمات تاو تزداد عند المعاملة بالتركيزات المنخفضة من الكركمين ول...

Discussion

هذه المخطوطة شروط إجرائية مختلفة للكشف عن مجموع تاو وفوسفوريلاتيد تاو في خلايا سرطان القولون والمستقيم تعامل مع الكركمين وليكل. لتقييم حالة الفسفرة عموما تاو في عينات البروتين، وصفت مقايسة الفوسفاتيز. يمكن استخدام هذا الفحص يحتمل أن تكون دراسة حالة الفسفرة أي البروتين.

هذ...

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم أي شيء كشف.

Acknowledgements

تم إجراء هذا البحث كجزء من المشروع تحت عنوان 'التنمية والتصنيع للمواد الخام مستحضرات التجميل ذات القيمة العالية من الطحالب البحرية'، وتموله وزارة للمحيطات ومصائد الأسماك، وكوريا، وأيده على منحة داخلية (2Z04930) من KIST معهد دانوي للمنتجات الطبيعية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
HCT 116 cellATCCCCL-247
MEM (EBSS)HycloneSH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher (Gibco)16000044Store at -20 °C
penicillin-streptomycinHycloneSV30010
Trypsin-EDTA solutionWelGeneLS 015-01
100 mm dishCorning430161
6 well plateCorningCoster 3516
Anti-Tau 13 antibodyabcamab19030
Dithiothreitol (DTT)Roche10 708 984 001Storage Temperature 2–8 °C
Microlitre CentrifugesHettich ZentrifugenMIKRO 200 R
PaclitaxelSigma-AldrichT1912Storage Temperature 2–8 °C
CurcuminSigma-Aldrich (Fluka)78246Storage Temperature 2–8 °C
Microtubules (MT)CytoskeletonMT001Store at 4 °C (desiccated)
Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200Store at 4 °C in the dark
Sodium hydroxideSigma72068
Magnesium ChlorideSigma-AldrichM2670
GTPSigma-AldrichG8877Store at -20 °C
DPBSWelGeneLB 001-02
Sonic DismembratorFisher ScientificModel 500
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima L-100 XP
PIPESSigmaP1851
Bovine serum Albumin (BSA)SigmaA7906
Molecular ImagerBio-RadChemiDoc XRS+Store at 4 °C
Protein assay dye reagentBio-Rad500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAbCell signalling2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAbCell signalling2118
Anti-Tau (phospho S396) antibodyabcamab109390
EGTASigmaE3889Store at room temperature
FastAP Thermosensitive Alkaline PhosphataseThermo ScientificEF0651Store at -20 °C
PMSFSigmaP7626Store at room temperature
Phosphatase Inhibitor CocktailCell Signalling5870Store at 4 °C
Protease Inhibitor CocktailCell Signalling5871Store at 4 °C
RIPA BufferSigmaR 0278Storage Temperature 2–8 °C
Tau-352 humanSigmaT 9950Store at -20 °C
Triton X-100 Sigma-AldrichX - 100Store at around 25 °C
PVDF membraneBio-Rad162-0177
Goat anti-mouse IgG Secondary AntibodyThermoFisherA-11005Store at 4 °C in the dark
Confocal MicroscopyLeica MicrosystemLeica TCS SP5
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Affymetrix75819
Protein AssayBio-Rad500-0006Store at 4 °C

References

  1. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
  2. Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neurochem. 64, 1288-1297 (1995).
  3. Goedert, M., et al. PTL-1, a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans. J Cell Sci. 109 (Pt 11), 2661-2672 (1996).
  4. Goedert, M., Spillantini, M. G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R. A. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. Neuron. 3, 519-526 (1989).
  5. Cleveland, D. W., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. Purification of tau, a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin. J Mol Biol. 116, 207-225 (1977).
  6. Fellous, A., Francon, J., Lennon, A. M., Nunez, J. Microtubule assembly in vitro. Purification of assembly-promoting factors. Eur J Biochem. 78, 167-174 (1977).
  7. Witman, G. B., Cleveland, D. W., Weingarten, M. D., Kirschner, M. W. Tubulin requires tau for growth onto microtubule initiating sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 73, 4070-4074 (1976).
  8. Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319, 1086-1089 (2008).
  9. Harada, A., et al. Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein. Nature. 369, 488-491 (1994).
  10. Caceres, A., Kosik, K. S. Inhibition of neurite polarity by tau antisense oligonucleotides in primary cerebellar neurons. Nature. 343, 461-463 (1990).
  11. Binder, L. I., Frankfurter, A., Rebhun, L. I. The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol. 101, 1371-1378 (1985).
  12. Gu, Y. J., Oyama, F., Ihara, Y. tau is widely expressed in rat tissues. J Neurochem. 67, 1235-1244 (1996).
  13. Kenner, L., et al. Expression of three- and four-repeat tau isoforms in mouse liver. Hepatology. 20, 1086-1089 (1994).
  14. Souter, S., Lee, G. Microtubule-associated protein tau in human prostate cancer cells: isoforms, phosphorylation, and interactions. J Cell Biochem. 108, 555-564 (2009).
  15. Sangrajrang, S., et al. Estramustine resistance correlates with tau over-expression in human prostatic carcinoma cells. Int J Cancer. 77, 626-631 (1998).
  16. Rouzier, R., et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8315-8320 (2005).
  17. Mimori, K., et al. Reduced tau expression in gastric cancer can identify candidates for successful paclitaxel treatment. Brit J Cancer. 94, 1894-1897 (2006).
  18. Jimeno, A., et al. Development of two novel benzoylphenylurea sulfur analogues and evidence that the microtubule-associated protein tau is predictive of their activity in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther. 6, 1509-1516 (2007).
  19. Huda, M. N., Kim, D. H., Erdene-Ochir, E., Kim, Y. S., Pan, C. H. Expression, phosphorylation, localization, and microtubule binding of tau in colorectal cell lines. Appl Biol Chem. 59, 807-812 (2016).
  20. Askanas, V., Engel, W. K., Bilak, M., Alvarez, R. B., Selkoe, D. J. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. The American journal of pathology. 144, 177-187 (1994).
  21. Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33, 95-130 (2000).
  22. Hanger, D. P., Anderton, B. H., Noble, W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 15, 112-119 (2009).
  23. Sergeant, N., et al. Biochemistry of Tau in Alzheimer's disease and related neurological disorders. Expert Rev Proteomics. 5, 207-224 (2008).
  24. Fath, T., Eidenmuller, J., Brandt, R. Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer's disease. J Neurosci. 22, 9733-9741 (2002).
  25. Kolarova, M., Garcia-Sierra, F., Bartos, A., Ricny, J., Ripova, D. Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease. Int J Alzheimers Dis. 2012, 731526 (2012).
  26. Kosik, K. S., Joachim, C. L., Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4044-4048 (1986).
  27. Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4040-4043 (1986).
  28. Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin. 53, 5-26 (2003).
  29. Patel, V. B., Misra, S., Patel, B. B., Majumdar, A. P. Colorectal cancer: chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer. 62, 958-967 (2010).
  30. Lim, G. P., et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci. 21, 8370-8377 (2001).
  31. Venkatesan, N. Curcumin attenuation of acute adriamycin myocardial toxicity in rats. Br J Pharmacol. 124, 425-427 (1998).
  32. Srinivasan, M. Effect of curcumin on blood sugar as seen in a diabetic subject. Indian J Med Sci. 26, 269-270 (1972).
  33. Deodhar, S. D., Sethi, R., Srimal, R. C. Preliminary study on antirheumatic activity of curcumin (diferuloyl methane). Indian J Med Res. 71, 632-634 (1980).
  34. Rao, C. V., Rivenson, A., Simi, B., Reddy, B. S. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound. Cancer Res. 55, 259-266 (1995).
  35. Araujo, C. C., Leon, L. L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96, 723-728 (2001).
  36. Lim, T. G., et al. Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2. Cancer Prev Res (Phila). 7, 466-474 (2014).
  37. Ringman, J. M., Frautschy, S. A., Cole, G. M., Masterman, D. L., Cummings, J. L. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer's disease. Curr Alzheimer Res. 2, 131-136 (2005).
  38. Li, H., et al. Lithium chloride suppresses colorectal cancer cell survival and proliferation through ROS/GSK-3beta/NF-kappaB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. , 241864 (2014).
  39. Forlenza, O. V., De-Paula, V. J., Diniz, B. S. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. ACS Chem Neurosci. 5, 443-450 (2014).
  40. Noble, W., et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6990-6995 (2005).
  41. Perez, M., Hernandez, F., Lim, F., Diaz-Nido, J., Avila, J. Chronic lithium treatment decreases mutant tau protein aggregation in a transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 5, 301-308 (2003).
  42. Engel, T., Goni-Oliver, P., Lucas, J. J., Avila, J., Hernandez, F. Chronic lithium administration to FTDP-17 tau and GSK-3beta overexpressing mice prevents tau hyperphosphorylation and neurofibrillary tangle formation, but pre-formed neurofibrillary tangles do not revert. J Neurochem. 99, 1445-1455 (2006).
  43. Caccamo, A., Oddo, S., Tran, L. X., LaFerla, F. M. Lithium reduces tau phosphorylation but not A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. Am J Pathol. 170, 1669-1675 (2007).
  44. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  45. Gupta, K. K., Bharne, S. S., Rathinasamy, K., Naik, N. R., Panda, D. Dietary antioxidant curcumin inhibits microtubule assembly through tubulin binding. FEBS J. 273, 5320-5332 (2006).
  46. Lee, J. W., Park, S., Kim, S. Y., Um, S. H., Moon, E. Y. Curcumin hampers the antitumor effect of vinblastine via the inhibition of microtubule dynamics and mitochondrial membrane potential in HeLa cervical cancer cells. Phytomedicine. 23, 705-713 (2016).
  47. Liu, F., et al. Site-specific effects of tau phosphorylation on its microtubule assembly activity and self-aggregation. Eur J Neurosci. 26, 3429-3436 (2007).
  48. Sultan, A., et al. Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem. 286, 4566-4575 (2011).
  49. Bukar Maina, M., Al-Hilaly, Y. K., Serpell, L. C. Nuclear Tau and Its Potential Role in Alzheimer's Disease. Biomolecules. 6, 9 (2016).
  50. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, 790-803 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

128 microtubules

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved